Name: 疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶSARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体の高速測定法。疑似ウイルス感染と蛍光イメージングを用いて、回復期血清サンプルの中和活性を評価します。BSL-2施設で実施可能なハイスループット法です。

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Whelanラボは、このプロトコルで使用されるVSV-S-eGFPウイルスを寛大に提供してくれたことに感謝します(Case et al. 2020で説明)。また、患者の血液サンプル(REBプロトコルID 20200371-01H)を収集したビル・キャメロン博士とユタポーン・コーワン博士(およびチーム)に感謝します。著者らは、この記事の研究、著者、および/または出版物に対する次の財政支援の受領を開示する:この研究は、オタワ病院財団からの寛大な支援とカナダ保健研究所(#448323)からの助成金とCOVID-19科学のためのシスルダウン財団からのファストグラントからC.S.I.T.R.J.への迅速な助成金によって資金提供されましたJPは、クラスターMitacsフェローシップによって資金提供されています。T.A.はCIHRバンティング・フェローシップによって資金提供を受けています。また、この研究のために血液サンプルを参加し、寄付したすべての人に感謝したいと思います。

1. SARS-CoV-2擬似ウイルスの製造および定量のためのめっき細胞(1日目)
<ol><li>組織培養の準備<ol>
<li>暖かい1xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩(DPBS);10%胎児ウシ血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(オプション)を含むDulbeccoの改変イーグル培地(DMEM)。約15分間水浴中に0.25%トリプシンエチレン酢酸(EDTA)から37°Cまで。</li>
		<li>70%エタノールで組織培養フードを消毒し、必要に応じて組織培養フードに組織培養皿、パスツールピペット、血清ピペットを配置します。水浴からPBS、DMEM、トリプシンを取り除き、組織培養フードに入れる前に70%エタノールで消毒します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>めっきと細胞の維持<ol>
<li>DMEMでVero E6細胞を成長させる(10%FBSを含む)T75組織培養フラスコまたは15cmの組織培養皿で5%CO2を有する37°Cインキュベーターで培養する。細胞が80-90%コンフルエントである場合、必要に応じて細胞を通過させる。</li>
		<li>各皿に1x PBSの10 mLを加え、4-5回穏やかに揺らすことによって細胞を洗います。PBSを吸引する。各皿に3mLのトリプシン-EDTAを加え、プレートを揺らし、表面全体が覆われていることを確認します。37°Cで5%CO2で約5分間、または細胞が剥離するまで培養します。</li>
		<li>7 mLのDMEM(10%FBSを含む)を加えてトリプシンを非アクティブ化し、何度か上下にピペットを入れて細胞を再中断します。500×gのベンチトップ遠心分離機を用いてトリプシンを5分間回転させ、細胞ペレットを邪魔することなく培地を吸引し、10mLのDMEM(10%FBSを含む)で細胞を再懸濁させた。細胞が将来の実験に必要な場合は、15 mLの新鮮なDMEM(10%FBSを含む)を含む新しい皿に1 mLを入れます。</li>
		<li>自動細胞カウンターまたはヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、15cmプレートごとに約1×107細胞を加え、5%CO2で37°Cで100%コンフルエント(1-2日)までインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. VSV-S-EGFP 擬ウイルス製剤
<ol><li>感染症<ol>
<li>感染の多重度(MOI)0.01でVSV-S-eGFPストックウイルスを5%CO2で37°Cで1時間37°Cで12 mLでVSV-S-eGFPストックウイルスに感染させ、時折プレートを揺らす。イノキュラムを新鮮なDMEM(2%FBSと20 mM HEPES、pH 7.7を含む)で置き換え、5%CO2で34°Cに設定されたインキュベーターに移動します。 注意:細胞培養におけるVSV-S-eGFPの伝播には34°Cの温度が必要です。</li>
		<li>広範な細胞変性効果(CPE)と細胞剥離の観察時に細胞上清を収集し、約48時間の感染後に。蛍光顕微鏡を使用して、感染後24時間から始まる感染細胞によるeGFPの広範な発現を可視化する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>徴収<ol>
<li>4°Cで1,000×gでベンチトップ遠心分離機を5分間使用して上澄み物を遠心分離し、細胞の破片を除去します。上清をアリコートして複数の凍結融解サイクルを回避し、-80°Cで保存する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. VSV-S-eGFP 擬似ウイルスのタテリング
<ol><li>ウイルス価を決定するシリアル希釈<ol>
<li>6ウェルプレート上のプレートベロE6細胞は、DMEM(10%FBS)で1ウェルあたり6×105細胞の播種密度で、5%CO2で37°Cで一晩インキュベートする。 注: TMPRSS2 および hACE2 を過剰発現するベロセルも使用できます。</li>
		<li>7マイクロ遠心チューブに900 μLの培地を入れることにより、VSV-S-eGFPウイルスの10倍シリアル希釈シリーズを冷たい無血清DMEMにセットする。ラベルチューブは1から7まで。ウイルスストックの100 μLを最初のチューブと渦に簡単に加えます。チューブ1からチューブ2および渦に100μLの希釈ウイルスを簡単に移す;チューブ7まで続けます。</li>
		<li>ベロE6細胞を含む6ウェルプレートの全ウェルから培地を吸引し、500μLの希釈液10-2〜10-7に置き換える。5%CO2で37°Cで45分間プレートをインキュベートし、15分ごとにそっと揺らします。</li>
		<li>吸入し、2x DMEMと6%カルボキシメチルセルロース(CMC)の1:1混合物を含むオーバーレイに置き換え、3%CMCの最終濃度は、10%FBSを補った;34°Cでインキュベートし、5%のCO2 を48時間行います。 注:感染工程中に15分間、37°Cの水浴でオーバーレイ混合物を事前に温めます。10%FBSを補う2x DMEMと1%アガロースの1:1混合物は、CMCの代わりに使用することができる。アガロースで重ね合わせるには、1%アガロース(dH2O)を沸騰させ、冷たい2倍のDMEMと混ぜます。混合物は、セル単層(約37〜40°C)に添加する前に適切な温度であることを確認してください。アガロースをオーバーレイに使用する場合、細胞は染色前に少なくとも1時間、3:1メタノール:酢酸の2 mLでインキュベートすることによって固定されなければならない。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ウイルス性タイターの染色と計算<ol>
<li>蛍光顕微鏡下でeGFPの結晶バイオレットまたは直接可視化で染色することにより、プラークを可視化します。</li>
		<li>プレートを汚す場合は、オーバーレイを吸引し、PBSで1回洗浄し、2 mLの0.1%結晶バイオレット(メタノールとdH2O)を各ウェルに加えます。脱染色する前に、室温で約20分間プレートロッカーに置きます。クリスタルバイオレットを取り出し、dH2 OまたはPBSを使用して各ウェルを2回軽く洗います。 注:洗浄と染色のステップは、手順全体を通して細胞単層がそのまま残るように、各ウェルの側面に向かってゆっくりとピペットすることによって穏やかに行われるべきです。</li>
		<li>プレートを数える前に、プレートを少なくとも1時間乾燥させます。プラーク数が20〜200プラークを含む井戸から得られるようにしてください。mL当たりのプラーク形成単位(PFU)でウイルスの価価率を算出するには、感染量とカウントされるウェルの希釈係数を乗算し、この数をそれぞれのウェルに存在するプラークから割る。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62486/62486eq01.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 市販の抗体および回復期の患者血清によるSARS-CoV-2擬似ウイルスの中和測定のためのめっき細胞(1日目)
<ol><li>組織培養の準備<ol>
<li>セクション1に記載されているように培地及び組織培養フードを準備する。さらに、サンプルあたり最低2回の反復(すなわち、6サンプルあたり1プレート)を収容するために必要な数の96ウェルプレートを準備します。サンプル・ボリュームが許可されている場合は、追加の反復を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>めっきと細胞の維持<ol>
<li>セクション 1 で説明されているように、Vero E6 細胞を成長および維持します。96ウェルプレート当たり少なくとも10mLの細胞懸濁液を、1mL当たり2×10個の5細胞の濃度で調製する(必要に応じて48時間後に行われるアッセイの場合、プレート1.5×10細胞/mL当たり10個)。マルチチャネルピペットを使用して96ウェルプレートの各ウェルに100μLのセル懸濁液を加え、5%CO2で37°Cで24時間インキュベートします。 注:細胞の懸濁液をよく混ぜ、細胞の均等な分布を確保するために、すべての方向に穏やかに各プレートを揺らす。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 抗体または血清希釈および感染症(2日目)
注:このプロトコルは、市販の抗体と患者血清の両方によるVSV-S-eGFPの中和を測定するために適用することができ、また、前臨床ワクチン開発研究のために動物から採取された血清。*患者/動物血清サンプルを取り扱う際に記載されている追加のステップに注意してください。
<ol><li>シリアル希釈シリーズ<ol>
<li>血清サンプルを希釈する前に、各サンプルを56°Cの水浴中で30分間加熱不活性化し、補体を不活性化します。患者のサンプルを取り扱う際に必要な安全対策を講じる。開いたサンプル容器は、組織培養フード内で、適切な封じ込めレベル2の個人用保護具が着用されていることを確認する。</li>
		<li>空の96ウェルプレート(プレート1)に希釈シリーズを設定します。</li>
		<li>80 μL の 96 ウェルプレートの行 A ですべての希釈を開始します。 注:使用される中和抗体の濃度は、メーカーが予測した活性に依存します。ここで使用されているSARS-CoV-2スパイク中和抗体( 材料表を参照)については、5μg/mLから始めて、少なくとも50%の中和を観察します。</li>
		<li>40 μL の無血清 DMEM (ペニシリン/ストレプトマイシン 1%) を行 B から G に、80 μL を行 H に加えます。行 H にウイルスを追加しないでください。</li>
		<li>12ウェルマルチチャネルピペットを使用して、40 μLの希釈された血清または抗体を行Aから行Bに混合して転送し、行Fまで繰り返し、行Fから40 μLを廃棄します。ウイルス専用制御行を表すため、行 G に血清を追加しないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>感染とオーバーレイ<ol>
<li>MOI 0.05(または2000 pfu)で各井戸を治療するために、希釈されたVSV-S-eGFPの適切な量を準備します。(この計算を完了する際には、合計80 μLの体積の60 μLのみが細胞に移動することに注意してください。 注:VSV-S-eGFPは温度に敏感であるため、使用していないときはいつでもウイルスストックが氷の上にとどまることを確認し、凍結を繰り返した後にタイターが異なるように複数の凍結融解サイクルを避けてください。</li>
		<li>40 μLの希釈ウイルスをプレート1のG行AからGの各ウェルに加え、上下4〜5回ピペットで混ぜます。5%CO2で37°Cでプレートを1時間インキュベートします。</li>
		<li>インキュベーター(プレート2)から細胞を含むプレートを取り出し、すべてのウェルから慎重に吸引します。プレート1からプレート2に60μLの抗体/ウイルス混合物を移し、5%CO2で37°Cで1時間インキュベートし、20分ごとにプレートを揺らします。</li>
		<li>DMEMにCMCを含む140 μLのオーバーレイで各ウェルをトップアップし、最終的な濃度は3%のCMC(10%FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシン)です。プレート2を34°Cに設定し、5%CO2をイメージング前に約24時間置きます。 注:感染工程中に15分間、37°Cの水浴でオーバーレイ混合物を事前に温めます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. イメージングと定量化(3日目)
<ol><li>自動蛍光イメージャーを使用したイメージプレート(フルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)フィルタまたは励起波長488nmの代替フィルタを使用)。個々のeGFP病巣を自動的に識別してカウントするプロトコルを作成することで、ウイルス感染を定量化します。自動カウント機能が使用できない場合は、ImageJ ソフトウェアを使用して eGFP フォシの数を定量化します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は、この出版物に関連する競合する財政的利益を持っていません。

ここで説明する方法は、必要に応じてさまざまなラボ環境やリソースに合わせて調整できます。重要なことに、このプロトコルの主な制限は、封じ込めレベル2空間および組織培養フードの必要性である。VSV-S-eGFPのようなSARS-CoV-2スパイクを擬似型複製するRNAウイルスの適用は、封じ込めレベル3の作業領域を必要とするSARS-CoV-2ウイルスに代わる手ごわい代替手段であるが、一部のグループでは制限されたままである可能性がある。ここで説明する他のすべての手順は非常に柔軟であり、ほぼすべての包含レベル 2 のラボで実行できます。例えば、自動計数機能を備えた蛍光イメージャーの使用は必要ありません。ここで使用される 96 ウェル形式は、利用可能な最も低い目標(2x)を使用してほぼ全体のウェルをイメージするために必要な約 4 つの視野のみを意味します。 
手動蛍光顕微鏡を使用して各ウェルの複数のフィールドを画像化し、ImageJ(フリーソフトウェア)を使用してeGFP病巣を定量化することができます。さらに、96ウェル形式を使用して、可能な限り低い量の血清を使用し、消耗品の使用量を最小限に抑...

2019年12月、コロナウイルスの新しいコロナウイルスが同定され、コロナウイルス病2019(COVID-19)1の原因物質であるSARS-CoV-2と知られています。SARS-CoV-2はコロナビリダ科に属するベタコロナウイルスである。これらのエンベロープウイルスは、大きな陽性感覚RNAゲノムを含み、ヒトおよび動物両方における呼吸器および腸感染症の原因である2。2021年5月時点で、世界中で1億5,700万人以上のCOVID-19の症例が報告されており、320万人以上が死亡しています。効果的なワクチンの開発は、少なくとも77の前臨床ワクチンを調査中で、90は現在臨床試験を受けている世界中の研究者の主要な目標となっています4.
コロナウイルスは、スパイクタンパク質(S)、ヌクレオキャプシド(N)、エンベロープタンパク質(E)、膜タンパク質(M)を含む4つの構造タンパク質をコードする。SARS-CoV-2の侵入には、Sの受容体結合ドメイン(RBD)と宿主受容体、ヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)、および宿主細胞セリンプロテアーゼによるタンパク質分解性切断後の膜融合、トランス膜プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)5、6、7、8、9、100との相互作用が必要です。.SARS-CoVのSタンパク質の液性免疫優位性は、以前に報告されており、SARS-CoV-211、12、13についても示されています。実際、Sに対する中和抗体応答は、感染24ヶ月後のSARS-CoV患者から回復血清中に検出されており、長期的な免疫応答におけるそれらの重要な役割を強調している。Sタンパク質は有望なワクチン標的として同定されており、開発中のほとんどのワクチンの重要な成分となっています15,16.
中和抗体の迅速な検出はワクチン開発の重要な側面であるが、影響を受けた領域における感染率および血清疫学的サーベイランスの速度に光を当てる可能性もある17。SARS-CoV-2 S糖タンパク質を擬似型の複製能力VSVは、野生型VSV糖タンパク質の代わりに、バイオセーフティレベル2の設定でSARS-CoV-2感染を研究するために、Whelanと同僚18によって親切に寄贈された。VSV発現スパイク(VSV-S)は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体応答を決定するために利用される。ここで使用されるVSV-Sは増強された緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するので、eGFP病巣は感染を定量化するために24時間以内に検出され、プラーク形成には48〜72時間かかることがあります。ここに要約すると、VSV-S-eGFP感染を中和する回復期の患者血清の能力を決定するための簡単で効果的なプロトコルがあります。この方法はまた、SARS-CoV-2 Sタンパク質の宿主とウイルスの相互作用を妨害することを目的とする他の潜在的な治療を尋問するために容易に適応され得る。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA (Gibco)</td><td>Fisher scientific</td><td>LS25200114</td><td></td></tr><tr><td>ArrayScan VTI HCS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>自動蛍光イメージャー</td></tr><tr><td>カルボキシメチルセルロース</td><td>Sigma</td><td>C5678</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグル培地 (Gibco)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグル's medium (Powder) (Gibco)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-800-017</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'</td><td>Fisher scientific</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher scientific</td><td>BP-310-500</td><td></td></tr><tr><td>IgG Isotype Control (マウス)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31903</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Research 15070063</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td><td>SinoBiological</td><td>40592-MM57</td><td></td></tr><tr><td>Vero E6 細胞</td><td>ATCC</td><td>&nbsp;CRL-1586</td><td></td></tr></tbody></table>

疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたsars-cov-2中和抗体の検出

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)によって引き起こされるCOVID-19パンデミックが進化し続ける中、ウイルスに対する中和抗体の存在が将来の感染に対する保護を提供することが明らかになりました。したがって、有効なCOVID-19ワクチンの作成と翻訳が前例のないスピードで続く中、SARS-CoV-2に対する中和抗体を測定するための迅速かつ効果的な方法の開発は、以前に感染した個人と予防接種を受けた個人の両方に対する感染に対する長期的な保護を決定するためにますます重要になります。本論文では、最近COVID-19から回復した患者から回復血清中中和抗体の存在を測定するために、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を擬似型にしたウイルス性口内炎ウイルス(VSV)を用いた高スループットプロトコルについて説明する。複製擬型ウイルスを使用すると、SARS-CoV-2 処理に必要な封じ込めレベル 3 の機能が不要になり、このプロトコルは事実上すべてのコンテインメント レベル 2 ラボにアクセスできます。96 ウェル形式を使用すると、短いターンアラウンドタイム 24 時間で多くのサンプルを同時に実行できます。

本プロトコルは、VSV-S-eGFP擬ウイルス感染の阻害(検出されたeGFP病巣の喪失によって定量化可能)を介してSARS-CoV-2 Sタンパク質に対する中和抗体を検出するための迅速かつ効果的な方法を概説する。図1に、プロトコルの概略図を示します。市販の抗体は、アッセイが実行されるたびに正のコントロールとして使用して、アッセイの一貫性を確保することが推奨されます。ここでは、IGG対照と比較してSARS-CoV-2スパイクRBDに対して市販の中和IgG抗体を用いた希釈曲線を示す(両方の抗体の詳細については、材料表を参照してください。図2)。
回復期患者サンプルは、SARS-CoV-2感染後約3ヶ月で採取し、かつ、上述の方法を用いて疑似ウイルス中和を決定した(図3)。重要なことに、健康なドナー血清を用いて最小限のバックグラウンド阻害が観察された。さらに、このアッセイは、入院...

ここで説明するプロトコルは、スパイク糖タンパク質に擬似的に結合した強化された緑色蛍光タンパク質標識付き小胞性口内炎ウイルスによる感染を阻害する回復血清サンプルの能力を評価することによって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体を測定するための迅速かつ効果的な方法を概説する。

疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

この方法は、開発中のSARS-コロナウイルス-2ワクチンに関するより重要な質問の1つに答える方法を提供する。ワクチンは中和抗体応答を引き出すことができるか?この手法の主な利点は、格納レベル 2 の施設で行うことができる点です。また、比較的高速で安価で、一度に多くのサンプルを分析するのに適しています。中和酸手順を実証し、研究室のシニア技術者であるリカルド・マリウスとMD博士課程の学生であるテイラー・ジェイミーソンがいます。摂氏37度と5%の二酸化炭素で10%FBSを補ったDMEMでベロE6細胞を培養することから始めます。細胞を通過するには、まずPBSの10ミリリットルを加えて、皿を4〜5回静かに揺らすことでそれらを洗います。PBSを吸引した後、3ミリリットルのトリプシンEDTAを加え、37°Cでインキュベートする前に表面全体が覆われているように皿を揺らします。細胞が切り離されたら、10%FBSで補ったDMEMの7ミリリットルを加えることによってトリプシンを非アクティブ化し、数回上下にピペットを作って細胞を再中断する。遠心分離によってトリプシンを除去し、新鮮なDMEMの10ミリリットルで細胞を再懸濁する前に細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引する。計数後、7番目の細胞に約10を各15センチメートルプレートに10回加え、細胞が100%コンフルエントになるまで1〜2日間培養をインキュベートする。VSVスパイクEGFP擬似ウイルスを整えるため、12ミリリットルの無血清DMEMで希釈したストックウイルスに感染する多重度0.01で細胞に感染する。ウイルスを追加した後、摂氏37度で1時間、時折揺れる5%の二酸化炭素をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、接種を2%FBSおよび20ミリモルヒープで補った新鮮なDMEMに置き換え、摂氏34度と5%の二酸化炭素で24時間培養する。翌日、蛍光顕微鏡を用いて、感染した細胞のEGFP発現を可視化する。広範な細胞パシー効果と細胞剥離が観察されたら、培養上清を収集し、遠心分離によって破片を除去する。複数の凍結融解サイクルを避けるために、マイナス80°Cで貯蔵する前に上清をアリクォートする。ウイルス性チターを決定するために、ベロE6細胞を6回のウェルプレートに10〜5番目の細胞の6倍の播種密度でプレートし、一晩インキュベートする。翌日、7つのマイクロ遠心分離管に900マイクロリットルの培地を加え、1番目のチューブに100マイクロリットルのウイルスストックを加えることで、ウイルスストックの10倍のシリアル希釈シリーズを設定しました。短いボルテックスの後、希釈されたウイルスの100マイクロリットルを後続の各チューブに移し、各チューブ間の渦を起分させる。次に、ベロE6培養プレートの各ウェルの上清を、マイナス7のウイルス希釈液に対してマイナス秒から10までの10~10の500マイクロリットルに置き換えます。細胞培養インキュベーターで45分間のインキュベーションを行い、15分ごとに穏やかに揺れ動いた後、接種液をオーバーレイ溶液に置き換え、34°Cで細胞を5%の二酸化炭素で48時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、結晶紫色染色によってプラークを可視化し、各ウェルに0.1%の結晶紫色の2ミリリットルを加える前にPBSで細胞を1回洗浄する。プレートを室温で約20分間ロッカーに置き、PBSで2回ずつゆっくりと洗います。最後の洗浄後、プレートが少なくとも1時間空気乾燥してから、示された式を使用して、各ウェルのウイルスの価価をミリリットル当たりのプラーク形成単位で計算するようにします。中和アッセイのために細胞をプレートするには、マルチチャンネルピペットを使用して、1ミリリットル当たり5番目の細胞の2倍から5番目の細胞の密度で96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルのベロE6細胞を追加し、37°Cと5%の二酸化炭素でプレートを24時間インキュベートします。翌日、熱は、56°Cの水浴で30分間試験される患者血清サンプルを不活性化する。その後、空の96ウェル組織培養プレートに患者の血清サンプルの10倍希釈シリーズを設定し、血清の8マイクロリットルを72マイクロリットルの無血清DMEMに加え、各ウェルAの各ウェルに抗生物質を加え、40マイクロリットルの無血清DMEMを行BからG、80マイクロリットルの各ウェルに追加します。 行Aでサンプルを混ぜ、行Aの各ウェルから行Bの各ウェルにサンプルの40マイクロリットルを転送し、混合後、行F.Nextまでウェルの後続の各行に希釈を繰り返し、0.05のVSVスパイクEGFPの40マイクロリットルを0.05の多重性で追加します。 37°Cと5%の二酸化炭素で1時間プレートをインキュベートする前に4〜5回ピペットで混ぜます。インキュベーションの終わりに、Vero E6培養プレートの各ウェルから上澄み物を慎重に吸引し、サンプル希釈板の各ウェルから細胞培養板の対応するウェルに60マイクロリットルの抗体ウイルス混合物を移管する。すべてのサンプルが転送されたら、細胞培養プレートを摂氏37度、20分ごとに揺れ動かしながら1時間5%の二酸化炭素を置きます。インキュベーションが完了したら、カルボキシメチルセルロースオーバーレイ溶液140マイクロリットルを細胞培養プレートの各ウェルに加え、プレートを摂氏34度と5%の二酸化炭素インキュベーターに移します。24時間後、488ナノメートル波長の自動蛍光イメージャー上のプレートを画像化し、イメージャーの自動計数機能を使用して個々のEGFP病巣を定量化します。本代表例では、SARS-コロナウイルス-2スパイク受容体結合ドメインに対して市販の中和抗体を陽性対照として用いた、IgGと並んで陰性対照として用いた。阻害率は、蛍光イメージングを介して検出されたEGFP病巣の数に基づいて算出した。SARS-コロナウイルス-2感染後約3ヶ月後に採取された回復期の患者サンプルによる擬似ウイルス中和は、入院を必要としない患者と比較して中和能力の増加を示した。この手順は、ウイルス感染を阻止することを目的とする他のCOVID-19予防および治療剤を評価するためにも使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

このビデオでは、SARS-CoV-2サブゲノムRNAの空間分布を可視化するためのHybridization Chain Reaction(HCR)-Fluorescence In Situ...

Immuno-RNA Fluorescence In Situ ハイブリダイゼーションを使用した SARS-CoV-2 の可視化

このビデオでは、SARS-CoV-2ウイルスの中和における血清の有効性を測定する中和アッセイを紹介しています。これには、偽型ウイルス、血清希釈、および発光ベースの定量が含まれ、中和力価が明らかになります。...

機能性SARS-CoV-2中和抗体の評価

SARS-CoV-2の中和IgGおよびIgM抗体を同時に測定できる多重血清および抗体中和アッセイの開発には、2レポーターの読み出しを提供するビーズベースの多重化アッセイのフロー分析システムが使用されました。...

多重化ビードベースの流れ分析システムのための高速多重デュアルレポーターIgGおよびIgM SARS-CoV-2中和アッセイ

概説されたプロトコルは、HiBiT受容体結合ドメインタンパク質複合体を産生するための手順と、SARS-CoV-2抗体の迅速かつ感度的な検出のためのその応用について説明する。...

HiBiTベースバイオレポーターを用いたSARS-CoV-2受容体結合ドメイン抗体の検出

このプロトコルは、インビボでSARS-CoV-2感染を研究するために必要な二次的アプローチの必要性を克服するために、K18...

レポーター発現組換えSARS-CoV-2を用いたK18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるウイルス感染のライブイメージングと定量

このプロトコルでは、組換えSARS-CoV-2スパイクにコンジュゲートした量子ドットは、細胞ベースのアッセイを可能にし、原形質膜でのhACE2へのスパイク結合およびその後の細胞質への結合タンパク質のエンドサイトーシスをモニターする。...

HEK293T細胞における結合およびエンドサイトーシスを追跡するための量子ドット共役SARS-CoV-2スパイク三量体のハイスループット共焦点イメージング

偽型ウイルス(PV)は、複製欠損のあるウイルス粒子であり、本物のウイルスを扱うよりも安全な条件下で宿主とウイルスの相互作用を研究するために使用されます。ここでは、SARS-CoV-2...

中和アッセイを介してSARS-CoV-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス

このプロトコルでは、SARS-CoV-2変異体の感染力と中和抗体に対する感受性を迅速に定量化するためのプラットフォームとして、新しいハイブリッドアルファウイルス-SARS-CoV-2偽ウイルス(Ha-CoV-2)のアプリケーションについて説明します。...

SARS-CoV-2変異株の迅速定量と中和抗体へのHa-CoV-2偽ウイルスの応用

ここでは、デュアルレポーターフローサイトメトリーシステムを使用して、アンジオテンシン変換酵素-2結合磁気マイクロスフェアによって捕捉された無傷の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)ウイルス粒子上の2つのユニークなスパイクタンパク質エピトープを同時に検出する、新たに開発されたマルチプレックス蛍光免疫測定法について説明します。...

マルチプレックスデュアルレポーター法によるウイルス粒子上の表面タンパク質エピトープのプロファイリング

本記事では、ルシフェラーゼレポーターシステムを用いてSARS-CoV-2疑似型粒子を生成する方法論と、それを用いたエントリー阻害剤の同定について説明しています。これらのプロトコルは、組換えヒトACE2-Fc融合タンパク質と小分子化合物アルビドールという2種類のエントリー阻害剤を用いて実証されています。...

MLVベースの偽ウイルスを用いたSARS-CoV-2侵入阻害薬の潜在的な抗ウイルス薬同定の手順

学ぶSARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体の高速測定法。疑似ウイルス感染と蛍光イメージングを用いて、回復期血清サンプルの中和活性を評価します。BSL-2施設で実施可能なハイスループット法です。

疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出

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