Name: フラッシュパックアプローチによるシンプルな社内超高性能キャピラリーカラム製造 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: 学ぼう、FlashPackプロトコルを用いた社内UHPLCキャピラリーカラム製造法。100バー圧力ボムで最大10倍の高速充填を実現し、LC-MSプロテオミクス向け高品質カラムを迅速・低コストで調製する方法です。

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この作業は、RSF助成金20-14-00121によってサポートされました。著者らは、P.V.シュリアハ(メモリアルスローンケタリングがんセンター)に実りある議論に感謝しています。

梱包プロトコルは5つのステップ(図1):1)パッキングステーションの準備、2)毛管調製、3)吸着スラリー製剤、4)圧力爆弾内のキャピラリーパッキング、および5)HPLCシステム内のカラムパッキングで構成され、サイズとUHPLC接続の設置に切り取られます。FlashPack 最適化では、共通プロトコルと比較してセクション 3 および 4 で調整を行う必要があります。
1. パッキングステーションアセンブリ
<ol><li>窒素、ヘリウム、またはアルゴンを充填したガスタンクを、出口圧力>50バーを備えた単一ステージのガスレギュレータで供給して準備します。最大圧力は圧力爆弾の互換性によって制限される。</li>
	<li>圧力爆弾のベントバルブにレギュレータを接続します。</li>
	<li>圧力爆弾に統合された磁気スターラーが装備されていない場合は、磁気スターラーに爆弾を置きます。</li>
	<li>狭いIDプラスチックチューブ(例えば、0.13mm)を圧力爆弾の通気口に接続し、水で容器に入れます。</li>
</ol>2. 毛細血管製剤
<ol><li>カシルとホルムアミド15 から形成された一体化ガラスフリットまたはレーザープーラー16によって調製された引っ張られたエミッタキャピラリーでフリットキャピラリーを準備する。毛細管は意図したコラムの長さより10-15 cm長く作られる。 注: さまざまなキャピラリーサイズとフリットタイプに関連する可能性のある問題については、 表 1 を参照してください。 表2 は、プルドエミッタキャピラリーを作るためのP2000レーザープーラープログラムの例を示しています。</li>
	<li>カットされたゲルローディングピペットチップで引っ張られたエミッタの端を保護します。<ol>
<li>チップをカットして、360 μmのOD毛細管の周りにしっかりとフィットします(毛細血管に沿って移動できますが、そのためには何らかの努力が必要です)。</li>
		<li>カットピペットチップをキャピラリーフロントエンドの方向からキャピラリーにスライドさせ、エミッタの端まで移動します。</li>
		<li>柱がスプレーされているときに、保護チップをスライドバックします。柱がスプレーされていないときに(柱が流れの下にあるが、まだスプレーしていない場合でも)、先端の内側にエミッタの端を持つには、先端を前方にスライドさせます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ソルベントスラリー製剤
<ol><li>ストックの吸着剤バイアルを準備する:1.5 mL遠心チューブに乾燥剤の〜50mgを置きます。ここで、Reprosil Pur C18が例として用いられる。</li>
	<li>吸着管に1mLのメタノールを加えます。</li>
	<li>完全に混合するには、渦ミキサーを使用して10sのチューブを渦に入れ。</li>
	<li>10 sのための超音波処理浴で超音波処理。</li>
	<li>20~30分間、ソルベントを十分に浸します。その後、渦ともう一度それを超音波処理します。</li>
	<li>働く吸着剤バイアルを準備します。爆弾に収まる円錐形の底のバイアルを使用してください。 注:それは別の1.5 mL遠心管または特定の圧力爆弾の設計に応じて他のバイアルのいずれかであることができます。この実験では、圧力爆弾の高さに切断された円錐形の底ねじキャップチューブが使用される。</li>
	<li>ストック・ソルベント・バイアルの吸着剤を再び中断し、2 x 3 mmサイズのマグネットバーを使用して500 μLを作動性の吸着剤バイアルに移します。</li>
	<li>作業バイアルに約1 mLまでのメタノールを加えます。</li>
	<li>作業バイアルは、吸着剤が重力によって落ち着くために10分間テーブルの上に立たせます。</li>
	<li>沈降後、吸着剤層が4mm以下の場合は、ストックの吸着スラリーを追加し、さらに10分間落ち着くのを待ちます。 注:準備された働くバイアルは、数ヶ月にわたって複数の列の準備を意図しています。作業吸着バイアルが2時間以上攪拌せずに滞在する場合、それは10 sのために渦巻き、10 sのために超音波処理され、重力によって解決されなければなりません。定期的に、吸着剤は、充填前の午前中に再中断されます。次に、連続列パッキングの間に長い休止がない場合は、一日の梱包に適しています。働くバイアルの吸着剤が乾燥した場合は、メタノールを加え、ストック吸着バイアル(ステップ3.2-3.5)に関して完全な吸着剤調製手順を実行します。</li>
</ol>4. 圧力爆弾でキャピラリーパッキング
注意:圧力爆弾を使用する場合は、常に保護メガネを着用してください。手袋をはめないでください。これらは、小径の毛細血管の適切な取り扱いに必要な触覚を著しく低下させ、間違いにつながります。
<ol><li>圧力爆弾に吸着バイアルを入れ、すべてのナットをしっかりと固定します。</li>
	<li>60~100rpmで回転を開始します。</li>
	<li>フリットまたは引っ張られたエミッタキャピラリーを爆弾に挿入します:バイアルの一番下に押し込み、2〜3mm持ち上げてナットを固定します。 注:毛細血管やフェルールの損傷を避けるために毛細血管を固定するために必要最小限の力を適用します。一番の手締めです。六重レンチを使用する場合は、締めるのに十分な労力を最小限にしてください。</li>
	<li>毛細管が正しく固定されているかどうかを確認してください- 手で引き出すことによって毛細血管を動かすことは不可能でなければなりません。</li>
	<li>あなたの顔から離れて指し、毛細血管の開いた端を保ちながら非常にゆっくりと圧力爆弾バルブを開きます。</li>
	<li>梱包プロセスの初期手順をご覧ください。 注:加圧の直後に、吸着剤が毛細管を充填し、全長に対して透明でなくなります。吸着剤が遠位端の内側に詰め始めるとすぐに、背圧が増加し、流れが減速し、毛細管内の吸着スラリーでさえ、吸着剤のないギャップで区切られたいくつかの吸着パケットに変わります。既にパックされた吸着剤は、密集した着色連続成長領域として見える。</li>
	<li>充填された部分は、充填プロセス全体の間、小さな吸着剤の空き隙を持つキャピラリー長さの少なくとも70%に保ちます。</li>
	<li>パッキングプロセス中に注意すべきいくつかの一般的な問題があり、毛細血管への効率的な吸着物の送達を維持するために機内設定調整が必要です。 注: 吸着剤の納期効率調整の詳細については、表 3を参照してください。<ol>
<li>問題1:新しい吸着剤がキャピラリーに入り止まり、すでに内部の吸着剤が動き続ける場合は、次の手順に従ってください。 注: これは最も頻繁な問題です。ほとんどの場合、毛細血管の入り口は自己凝集する吸着団によってブロックされます。次のステップを 1 つずつ適用して、吸着フローが復元され、問題に関連する残りの手順をスキップします。<ol>
<li>回転速度を500rpmに上げ、すぐに60〜100rpmに戻します。通常、それは吸着流を復元します。残りの梱包プロセスでは、回転速度が60rpm以上であることを確認します。</li>
			<li>それが役に立たない場合は、簡単に梱包爆弾を発散し、すぐにそれを加圧します。</li>
			<li>それが役に立たないか、ブロッキングが再び起こる場合は、吸着剤層の内側に毛細血管を再配置します。吸着剤の不在は、キャピラリーオープンエンドがマグネットバーの上に高すぎるか、柱の端がそれに触れないか、またはキャピラリーがバイアル底部に突き刺さったりすることが原因である可能性があります。まず、爆弾を完全に通気し、ナットを緩め、キャピラリーを底に押し付け、2mm戻します。ナットを固定します。</li>
			<li>ブロッキングが持続する場合は、システムを通して、吸着バイアルと渦を取り出し、もう一度超音波処理します。キャピラリー前頭の端部が顕微鏡下で損傷していないかどうかを確認し、必要に応じてフロントエンドの5mmを切ります。</li>
		</ol>
</li>
		<li>問題 2: 吸着剤が長い空の領域で毛細血管のごく一部のみを満たす場合は、次の手順に従います。<ol>
<li>回転速度を確認します。回転が遅すぎると、キューポラの割れが十分に効率的ではありません。回転速度を~150 rpmに上げます。</li>
			<li>回転が速すぎると、吸着剤はより大きなバイアルボリュームに再懸濁され、カラムの入り口の周りの局所的な吸着剤濃度が低くなります。回転速度を 60~100 RPM まで遅くします。</li>
			<li>吸着剤のレベルを確認します。バイアルに十分な吸着剤がない場合、毛細血管内の吸着剤がほとんどない同じ問題が観察されます。吸着剤が使い果たされたら、バイアルに新しい吸着剤を充填して、重力によって起こる沈降後に吸着層を4mm以上高く保ちます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>ターゲット列の長さに 5~7 cm を加えた値が達成されるまで、カラムを梱包し続けます。</li>
	<li>回転を停止し、非常にゆっくりと爆弾を減圧します。<ol>
<li>爆弾弁を少し開けて、水筒の中でバブルが破裂するのを待ちます。その後、バルブを少し広く開き、再びバブルが減速するのを待ちます。</li>
		<li>バルブからガスが出なくなるまで、圧力を段階的に放出します。 注:一度にバルブを開けないでください - それはキャピラリーの中でバブリングし、吸着剤がバイアルに戻ります。その場合は、爆弾を加圧し、列が再びパックされるのを待ちます。</li>
	</ol></li>
	<li>ガスがベントバルブから出てくるのを止めたら、詰まった毛細管を圧力爆弾から取り出します。 メモ:カラムを乾かしてはなりません。HPLCシステムに直ちに接続されていない場合は、パックされたキャピラリーを10%のEtOH溶液に完全に沈めてストレージに入れます。キャピラリー貯蔵用に、液体密閉ポリプロピレン食品貯蔵容器を使用することができます。切断されたHPLCカラムも同様に保存されます。</li>
	<li>それ以上の梱包が計画されていない場合は、爆弾から吸着バイアルを取り出し、しっかりと閉じます。さらなる列の梱包のためにそれを保ちます。</li>
</ol>5. HPLC カラムのパッキング
<ol><li>パックされたキャピラリーをHPLC接続でHPLC システムに 接続します。</li>
	<li>250~300バー圧を目標に95%溶媒B(80または100%アセトニトリル、0.1%のギ酸(FA))で流れ始めます。40 cmパックキャピラリーの場合は、200-300 nL/分の流量を使用してください。 注:パッキングの流量は2μmの吸着剤が詰まった100 μm IDの40-50 cmカラムのための200 nL/minである。表 4に、その他の列サイズを示します。他のカラム長およびIDの流量は、背圧とカラム長と断面の間の直接比例性から推定されます。正確な流量は実際のパックされた長さに調整されます。また、300バーの圧力はHPLC接続の物理的圧力限界をターゲットとしていることにも注意してください。高い圧力接続では、接続圧力限界までの流量が速く充填されます。</li>
	<li>毛細管内の緩い吸着物が詰まり、合計パックされた長さに追加されるのを見てください。</li>
	<li>流れを止めずに、カラム本体を超音波浴に2回浸します。 注: 柱の端部と毛細血管接続は、柱本体の一部のみを使用して浸漬しないでください。超音波処理ステップは、特に長さ50cm(未公開のデータ)>非常に長い列の列の再現性を向上させるのに役立ちます。ただし、引っ張られたエミッタキャピラリーのエミッタの端の内側に自己組立の吸着フリットを壊し、カラムを完全にブロックするランダムなチャンスが追加されます。超音波処理は、任意のガラスフリットカラムに普遍的に適用することができますが、我々は50センチメートル>列の長さのためのプルドエミッタカラムを超音波処理することをお勧めします。</li>
	<li>吸着剤のベッドが収縮を停止したら、流れを止めずにカラム本体を超音波浴に2倍以上浸します。</li>
	<li>300 バーで 10 分の列を実行します。</li>
	<li>流れを止め、圧力が3つのバーを下回るのを待ち、列を取り外します。</li>
	<li>ギャップや変色が欠けているかどうかを視覚的に検査します。もし見つかったら、流れの下で超音波処理を繰り返すことができます。重要な実験の場合は、新しい列を作成することを検討してください。</li>
	<li>列を目的の長さに切り取ります。 注: 適切に行われた切断は、カラム効率の前提条件です。筆記者でポリイミドコーティングのノッチを作り、部分的に毛細血管を割り、2つの部分を引き離します。</li>
	<li>セラミックウエハーまたはラッピングフィルムで柱のフロントエンドを磨きます。</li>
	<li>UHPLC 接続を使用して、列を LC システムに再接続します。</li>
	<li>表 4に従って、列 ID に応じて作業流量を 2% B から開始します。圧力が平衡化するのを待ち、カラムの背圧を確認します。 注: 作業流量は、カラムパラメータに従って調整されます。たとえば、長さ30cmの100 μm IDカラムは500 nL/minで実行されます。</li>
	<li>バックプレッシャが期待値の 5% 以内であることを確認します ( 表 5を参照)、列が正しくパックされ、使用できる状態であることを確認します。 注: カラムバックプレッシャは、列が接続された HPLC システムの勾配チャネルの全圧力から、柱の前にあるキャピラリーの背圧を差し引いたものです。同時に、 表 5 の値は任意です (期待するものの任意のスケールを与えます)。カラムからカラムへの背圧の実験室内類似性は、すべてが正常に動作することを示すより重要な指標です。実際の絶対背圧は、吸着剤の大きさや特性、キャピラリーID、製造およびバッチ、引っ張られたエミッタの形状やガラスフリットの密度と長さ、部屋の溶媒特性や周囲温度など、多くのパラメータに依存します。バックプレッシャーが高すぎる場合は、問題の可能性について 表 1 を参照してください。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

社内キャピラリーカラムパッキングは、複数の独立したプロジェクトに取り組む大規模な研究所で非常に人気があります。しかし、低濃度の吸着剤懸濁液からの一般的な充填方法は、速度に大きな制限があり、長いUHPLCカラムを生成することができません。
FlashPackは、非常に高い吸着剤濃度から梱包を可能にする標準的な梱包手順の変更です。この方法の理論的基礎は、全体の梱包期間の柱入口での連続吸着性キューポラ不安定化にあります。後者は、磁石バーで連続的に打たれる列の入り口によって技術的に達成される。キューポラの不安定化の方法は、一般的な梱包プロセスと完全に類似した梱包設定を持つために意図的に開発されていますが、FlashPackのトリックは、充填プロセス中の吸着スラリー製剤、毛管位置、およびマグネットバーの使用の詳細にあります。
この吸着スラリーは、大きな溶媒容積で沈着剤の吸着層として調製される。圧力爆弾ベースの梱包は、列から列に同じ梱包条件を必要としないことは興味深いです。FlashPackでは、列の入り口の周りの正確な吸着スラリー濃度は決してわかりません。梱包プロセス中にも変化するため、正確に測定および制御することは不可能です。しかし、最終的な列は、梱包がどのように達成されたかに関係 なく、まだ非常に再現可能です。
速いパッキングのための基礎は有効な吸着のキューポラ不安定化にある。そのため、毛細管に入る吸着剤を制御し、全体の充填期間全体にわたって最適なキューポラ不安定化条件を維持することが重要です。効率的な吸着物の配信を妨げる可能性のある問題がいくつかあります。これらの幾つかの例は、高速磁気棒回転による吸着層リサスペンション、マグネットバーの位置決めに対する誤った相対毛細血管またはあまりにも遅いマグネットバー回転に起因する非効率的なキューポラ不安定化である。問題自体と、その対処方法については、プロトコルのセクションで詳しく説明します。
列がパックされた後、チェックする主要な列パラメーターは列の背圧です。 表5 に示す圧力値は、一般的なサブ2 μmビーズサイズの吸着剤-ReproSil PUR C18 AQ(1.9 μm)の1つに期待されるものの基準点を提供します。同時に、追加のバックプレッシャは、フリットまたはあまりにも狭く引っ張られたエミッタによって追加され、1つは常にそれを監視する必要があります。充填が引かれたエミッタに入る場合、我々はまだ最初にフリットキャピラを詰めることによって使用されている特定の吸着剤のための期待されるカラムの背圧を測定し、次に自己組立フリットが過剰に追加されるかどうかを確認することを提案する。高圧的な問題については、 表 1 に示すガイドラインを使用して問題を特定します。
私たちの経験では、変色、ギャップ、および適切なバックプレッシャのないパックされたカラムは、ケースの100%で動作し、カラム長さと吸着特性から期待されるものに近い分離品質を与えます。変色を伴う列は、正常に動作するとは限りませんが、満足のいく結果を得ることができます。
ほとんどの場合、分離品質に問題がある場合、それらはカラム自体からではなく、分離システムの他の部分、すなわちポンプ、溶剤、または接続から来ています。特に、列後の接続は、特に有害な可能性があります。エミッタとフリットカラムの間のデッドボリュームとの接続が悪いと、毛細管クロマトグラフィーの流量が非常に低いため、大きなピークの広がりとテーリングにつながります。
FlashPack アプローチに特有のもう 1 つの重要な問題は、作業用の吸着スラリーバイアルに高価な吸着剤を多く使用することです。フラッシュパックの吸着スラリーは、複数の使用を意図していることを覚えておいてください。吸着剤の世話をします。不要なマグネットバーの攪拌を避けて、充填が終了したらすぐに回転を止め、吸着剤の粉砕を減らしてください。そして、吸着剤の乾燥を避けるために圧力爆弾に開いた吸着剤バイアルを残さない。その後も吸着剤は使用できますが、吸着スラリーのリメイクには時間がかかります。
この方法は、フリット毛細血管とプルドエミッタ毛細血管の両方に対して同様にうまく機能します。FlashPack の原則は、キャピラリー ID のパッキング率を 20 ~ 250 μm に増やします(小さく、より大きくテストされていません)。また、完全かつ表面的に多孔質の全ての吸着剤にも適用可能であり、我々は試験することができる(高い吸着スラリー濃度における吸着剤の形成は、RP吸着剤に特に限定されない)。また、溶媒パラメータは、物理的および化学的特性に応じて、明確にパッキングに影響を与えます。例えば、粘性の低いアセトンは、同じパッキング圧力でメタノールよりも高い充填率を与えます。しかし、メタノールよりも極性が低く、互いに付着する吸着剤粒子も減少します。それ自体で、流量が高いときに梱包の初めに吸着性のキューポラ形成を防ぐことができます。しかし、吸着剤粒子相互作用の減少はまた、信頼性の低い自己アセンブルフリット形成および充填中のより頻繁なプルドエンドブロッキングをもたらす。したがって、アセトンはフリットキャピラリーのパッキングに適していますが、プルドエミッタキャピラリーには適していませんが、スラリー溶媒としてのメタノールは遅くなりますが、両方のタイプの結末に適しています。ヘキサンやジクロロメタン(DCM)からのパッキングは、メタノールからアセトンに切り替える極端なケースです:彼らはさらに少ない極性であるため、吸着性キューポラの形成を完全に防ぎますが、プルドエミッタパッキングには全く適していません。また、極度の低いDCM極性は、内部キャピラリー壁に付着し、その上に厚い層を作る吸着粒子につながることに留意された。層の厚さが徐々に大きくなり、ランダムなローカルブロックが形成され、その結果、列は、吸着のない領域で区切られたいくつかの部分に詰め込まれます。このような効果は、C18ペプチド・エーリス・吸着剤に対して観察された。
もう一つの観察された問題は、YMCトリアートC18の吸着剤がメタノールで適切に懸濁されていないが、何らかのフレークを形成することであった。しかし、それはFlashPackでパックされ、非常にまともな分離効率(未公開のデータ)を与えることを妨げるものではありません。したがって、いくつかのケースでは最適ではありませんが、メタノールは、テストされたすべての吸着剤およびカラムに対して最も普遍的な溶媒でした。スラリー溶媒の違いがカラム分離効率に与える影響を分析していないということは、まだ明示する必要があります。同時に、メタノールから詰め込まれたカラムの効率は、すでに同じ吸着剤4の商用カラムと完全に等しい。
UHPLC カラムの充填率を向上させる既存のアプローチは、FlashPack だけではありません。超高圧パッキング7の使用により、高い吸着スラリー濃度からの高速梱包も可能です。FlashPackの利点は、吸着剤の送達と毛細血管接続のための特別な超高圧ポンプと圧力爆弾を必要としないため、はるかに簡単です。同時に、極圧で詰め込まれたカラムは、低圧パックカラム17よりも高い分離効率を有することが実証された。また、FlashPack は比較4で使用される商用列と同じ列を生成していますが、パッキング方法はわかりませんが、FlashPack カラムが超高圧パック列に対してどのように立ち向かうのかはまだテストされていませんでした。
要約すると、説明されたFlashPackメソッドは、セットアップが完全に同じままで、プロトコルにいくつかの調整を加えて、実験室内の既存のパッキングプロトコルに簡単に適応させることができます。HPLCキャピラリーカラムのパッキングを数分にスピードアップし、標準のパッキング手順では明らかに不可能である長いUHPキャピラリーカラムの生産を可能にします。FlashPackアプローチの適用による実験室のための時間とお金の全体の経済は、年間数万ユーロで数えることができます。さらに、UHP毛細血管柱をローカルに生産する能力は、利用可能な商用製品では不可能な実験カスタマイズの可能性を開きます。

現代のプロテオミクスは、液体クロマトグラフィー結合質量分析法に基づいており、超高性能ナノフロークロマトグラフィー(50〜150 μmカラム内径(ID))分離により、最良の分析速度と感度1を提供する。多数の市販のUHPLCキャピラリーカラムが利用可能ですが、特に複数の多様なプロジェクトが実験室で実行され、プロジェクト固有のカラム汚染が頻繁に問題となっている場合、その価格は消耗品コストの大部分を占めています。また、列を社内で梱包することで、カスタム実験専用の吸着剤(例えば、polyCAT-A吸着剤2)や、既製カラムとして購入できないカラム特性を使用できます。
それに対処するために、多くの研究所はキャピラリーカラムを社内に詰め込んでいます。しかし、100棒圧力爆弾(圧力注入電池)3 を用いた一般的な充填手順は、2μm以下のUHPLC吸着剤の高い背圧によるUHPLCカラムパッキンに適していないため、大型のHPLC吸着剤と比較して劇的な充填率低下を生じる。短いUHPLCカラムはまだ非常にゆっくりと詰め込むことができますが、長いUHPLCカラムの製造は物理的に不可能です4.
標準的な毛管コラムの詰め物は100までの棒まで比較的低い圧力で、そして非常に低い吸着スラリーの集中で行われる。したがって、プロセスを高速化する2つの可能な方向が利用可能です。充填圧力5を高くすることができる。しかし、これは特別な装置を必要とし、実際には、実験室で新しい方法のインストール。もう一つの方法は、吸着スラリー濃度6を増加させることである。高い吸着スラリー濃度パッキングは、前の出版物7で超高いパッキング圧力と組み合わせて説明される。しかし、既存の梱包爆弾のほとんどで使用されている100バー圧では、より高い吸着剤濃度は、充填率が遅くなるか、またはあからさまな梱包停止につながります。この効果は、最近、カラムの入り口での吸着剤のクラスタリングによるものであることが実証され、吸着バイアル内に磁石バーを持つ柱の入り口を叩いて吸着性のキューポラ不安定化の簡単なトリックが示唆された4。FlashPack という名前の方法は、同じ 100 棒圧爆弾のパッキング設定を使用します。同時に、パッキング手順のマイナーだが重大な変化は、非常に高い吸着スラリー濃度からのパッキングを可能にし、非常に長いUHPLCカラム(50〜70cm、および長い)を1時間未満で製造し、短いカラムは同じパラメータ4の商業カラムに等しい分離品質で数分で製造することができる。FlashPackアプローチは、逆相(RP)8、9、10、11、12、13、14および親水性相互作用(HILIC)2毛管柱の両方の調製のために、すでに複数のプロテオミクスプロジェクトで使用されています。
ここでは、FlashPackアプローチを標準の100バー圧力爆弾梱包手順に適応させるために必要な変更について詳しく説明します。

<table><tbody><tr><td>0.1% (v/v) ギ酸</td><td>メルク</td><td>1.59002</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離管 1.5 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>セラミック スコアリング ウェーハ</td><td>Restek</td><td>20116</td><td>任意のセラミック ウェーハはキャピラリー研磨に適しています</td></tr><tr><td>ダイヤモンドチップブレードスクライブ</td><td>NewObjective</td><td>キャピラリー切断</td><td></td></tr><tr><td>に推奨されるダイヤモンドチップブレードスクライブ溶融シリカキャピラリー 100 mm ID 375 mm OD</td><td>CM Scientific</td><td>TSP100375</td><td></td></tr><tr><td>GELoader tips</td><td>Eppendorf</td><td>30001222</td><td></td></tr><tr><td>HPLC システム</td><td>ThermoScientific</td><td>Ultimate3000 RSLCnano</td><td></td></tr><tr><td>レーザープーラー</td><td>Sutter</td><td>P2000/F</td><td></td></tr><tr><td>マグネットバー 2x5 mm</td><td>Merck</td><td>Z283819</td><td></td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Merck</td><td>1.06018</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスパチュラ</td><td>Merck</td><td>Z193216</td><td></td></tr><tr><td>PEEK フェルール 360 mm</td><td>VICI</td><td>JR-C360NFPK</td><td>カラムを UPLC ユニオン</td></tr><tr><td>ピペットチップ、1000 uL</td><td>Merck</td><td>Z740095</td><td></td></tr><tr><td>ピペット、1000 uL</td><td>Gilson</td><td>Pipetman L P1000L</td><td></td></tr><tr><td>圧力爆弾</td><td>NextAdvance</td><td>PC-77 MAG</td><td></td></tr><tr><td>レギュレータ</td>ー <td>GCE</td><td>Jetcontrol 600 200/103</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm</td><td>Dr. Maisch</td><td>r13.aq.0001</td><td></td></tr><tr><td>キャップなしのスクリューキャップチューブ、円錐底、自立型、0.5 mL</td><td>メルク</td><td>AXYST050SS</td><td></td></tr><tr><td>キャップなし、円錐底、自立型、1.5 mL</td><td>メルク</td><td>AXYST150SS</td><td></td></tr><tr><td>Oリング付きスクリューキャップ</td><td>メルク</td><td>AXYSCOC</td><td></td></tr><tr><td>超音波処理槽</td><td>エルマ</td><td>エルマソニックS30 H</td><td></td></tr><tr><td>ユニオンHPLC</td><td>VICI</td><td>JR-C360RU1PK6</td><td>1/16 OD HPLCキャピラリーから360 umキャピラリーカラムユニオンへのHPLC接続</td></tr><tr><td>UPLC</td><td>VICI</td><td>JR-C360RU1FS6</td><td>1/16 OD HPLCキャピラリーから360 umキャピラリーカラムボルテックスへのUPLC接続</td></tr><tr><td></td><td>BioSan</td><td>V-1plus</td><td></td></tr><tr><td>0.1%(v / v)ギ酸</td><td>メルクの水</td><td>1.59013</td><td></td></tr></tbody></table>

フラッシュパックアプローチによるシンプルな社内超高性能キャピラリーカラム製造

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

キャピラリー超高性能液体クロマトグラフィー(UHPLC)は、現在、LC-MSベースプロテオミクスにおけるサンプル分離工程に選択される方法です。ただし、キャピラリーカラムは、その高いフローカウンタータイプに比べてはるかに堅牢ではありません。汚染やブロッキングが容易なため、交換が必要な場合が多い。これにより、LC-MS 分析コストの大幅なコストが大幅に高くなります。UHPLC毛細管柱の社内梱包は、多くのお金を節約し、カスタマイズすることができます。しかし、100棒圧力爆弾の標準的な梱包手順はHPLCカラムに対してのみ有効ですが、UHPLC吸着剤には遅すぎます。ここでは、同じ100バー圧力爆弾の設定に適用される最適化されたFlashPackプロトコルの説明を提供します。この方法は、超高吸着剤濃度スラリーからのパッキングに基づいており、合理的な時間で無制限の長さのUHPLCキャピラリーカラムの社内製造のために開発されています。

FlashPack アプローチは標準のパッキング設定に基づいており、同じパッキングパイプラインに従います。パッキングは標準的なフリットまたは引っ張られたエミッタの毛細管に行われる。主な最適化は吸着スラリー濃度にあります:標準的な方法はFlashPackで使用される高濃度の吸着剤懸濁液と互換性がありません。結果は、長いUHPLCカラムの高速生産方法、例えば、1.9μmの吸着剤を1h未満で50cm長く詰めたカラム(図2)である。
FlashPackアプローチの応用例を示すために、30cm 100 μm IDキャピラリーカラムを用意しました(表6)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table1_HighColPressurev2.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table2_P2000F%20laser%20puller%20program.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table3_sorbentDeliveryIssuesss.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table4%20Exemplary%20packing%20and%20working%20flow%20rates.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table5_Expected%20backpressure.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table6_Exemplary%20packing%20of%2030%20cm%20UHPLC%20columnv2.xlsx" target="_blank"></a><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig03large.jpg" target="_blank"></a>

ここでは、最適化された FlashPack キャピラリーカラムパッキング手順のプロトコルを紹介します。一般的な100バー圧力爆弾セットアップに最適化されたプロトコルを適用することで、長い超高性能キャピラリーカラムの10倍のパッキングと製造が可能になります。

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

フラッシュパックアプローチによるシンプルな社内超高性能キャピラリーカラム製造。この手順の目的は、LC-MSプロテオミクス分析のための高速かつ容易な超高性能キャピラリーカラムパッキングのための最適化されたプロトコルを導入することです。現代のプロテオミクスは、超高性能キャピラリー液体クロマトグラフィーと組み合わせた質量分析に基づいています。ペプチド分離は、主に75マイクロメートルの内径の毛細血管カラムで行われます。市販品と同等に、キャピラリーカラムを社内で用意することが可能です。カスタムで用意されたカラムは、商業的な類推に似た分離品質を示す一方で、多くのお金を節約し、吸着剤やカラムサイズのカスタマイズを可能にします。ここでは、FlashPack と呼ぶ社内キャピラリーカラム製造用の最適化されたパッキング手順を示します。最適化の背後にある考え方は、同じ共通の100棒圧力爆弾のパッキング設定を使用しながら、非常に高い吸着スラリー濃度から梱包することです。これは、高い吸着濃度でカラムの入り口の周りに形成され、新しい吸着材料が毛細血管に入るのを防ぐ吸着クラスターを連続的に分解する必要があります。技術的には、磁石バーをハンマーとして使用し、常に吸着線の中の毛細血管の周りを常に加熱し、移動することによってそれを達成します。適切に適用された FlashPack は、最大 10 回の梱包率を増加させます。これは、より柔らかいマイクロメトリックビートサイズの超高性能吸着剤を梱包し、合理的な時間でメートルの長さまでの非常に長い列を製造するのに適しています。列の準備手順は、5 つのステップで構成されます。3つの準備ステップは、パッキングステーションアセンブリとキャピラリーと吸着スラリー製剤を含みます。その後、キャピラリーは、最初に60〜100バー圧力で圧力爆弾に詰め込まれます。その後、パックされたキャピラリーをHPLCシステムに接続し、高圧で吸着剤を詰め、カラムの切断を大きさにします。FlashPack プロシージャーでは、共通プロトコルのステップ 3 と 4 で変更を行う必要があります。まずは梱包ステーションを用意します。それは少なくとも50棒出口圧力が付いている窒素のガスタンクから成っている。タンクは、磁気攪拌機に置かれる圧力爆弾のベントバルブに接続されています。ベント弁の出口は狭いID PEEK毛細管を通して水のびんに挿入され、減圧の細かい制御が可能になる。次に毛細血管を用意します。パッキングは、カシルとフォルマミドから形成された統合ガラスフリットを備えたフリットキャピラリーのいずれかに行うことができます。別のオプションは、サッターレーザープーラーで調製された引っ張られた毛細血管にパックすることです。毛細管は、意図した列の長さよりも10〜15センチメートル長くする必要があります。次のビデオは、引っ張られたエミッタキャピラリーパッキングの例で準備されています。カットされたゲルローディングピペットチップで引っ張られたエミッタの端を保護します。詳しくは原稿のテキスト版をご覧ください。次の段階は、吸着スラリー製剤です。まず、約50ミリグラムの乾燥吸着剤を1.5ミリリットル遠心管に入れます。それはストック吸着バイアルになります。このビデオは、Dr.MaischのReprosil Pur C18 AQ 1.9マイクロメトリック吸着剤を使用して作成されました。ストックの吸着剤バイアルに1ミリリットルのメタノールを加えます。10秒間渦を起分させます。そして、さらに10秒間超音波処理浴で超音波処理。ソルベントを20〜30分間徹底的に浸し、その後、渦を再び超音波処理します。働く吸着剤バイアルを準備します。それは爆弾に収まる円錐形の底のバイアルでなければなりません。それは特定の圧力爆弾の設計に応じて別の1.5ミリリットル遠心管または他のバイアルのいずれかである場合があります。我々は、圧力爆弾の高さにカットスカート円錐ボトムスクリューキャップチューブを使用しています。ストック吸着バイアルの吸着剤を再び中断し、500マイクロリットルをマグネットバー2 x 3ミリメートルの大きさで作業用の吸着剤バイアルに移します。メタノールで1ミリリットルに働くバイアルに上に。作業バイアルは、吸着剤が重力によって解決するために10分間テーブルの上に立たせます。このステップの結果は、高さ4ミリメートルの周りの緩い吸着剤の底層を持つ円錐底バイアルでなければなりません。層が低すぎる場合、およびストックバイアルからいくつかのより多くの吸着剤。したがって、準備された作業バイアルは、数ヶ月の時間にわたって複数の列の準備のために意図されています。作業吸着バイアルが2時間以上かき混ぜることなく滞在する場合は、充填する前に渦巻き、超音波処理し、重力によって再び落ち着かなければなりません。すべてが準備されたら、ステージ4に進み、圧力爆弾に詰めます。融合したシリカ毛細血管と圧力爆弾を使用する場合は、常に保護メガネを着用してください。同時に、保護手袋はお勧めできません。小径毛細血管の適切な取り扱いに必要な触覚を著しく低下させ、ミスを招く。圧力爆弾に吸着バイアルを置き、すべての結び目をしっかりと固定します。毎分60〜100ラウンドで回転を開始し、フリットまたは引っ張られたエミッタキャピラリーを爆弾に挿入します。バイアルの一番下に押し込み、2〜3ミリメートルまで持ち上げて結び目を固定します。毛細血管を固定するために必要な最小限の力を適用します。毛細血管が正しく固定されていることを確認します。毛細血管を手で引っ張り出して動かすことは不可能でしょう。非常にゆっくりと、あなたの顔から離れて指し、毛細血管の開いた端を保ちながら、圧力爆弾バルブを開きます。梱包プロセスの初期手順をご覧ください。加圧の際、吸着剤は毛細管を満たし、全長に対して透明化しなくなります。吸着剤が遠位端の内側に詰め込み始めるとすぐに、背圧が増加し、流れが減速し、毛細管内の吸着スラリーでさえ、吸着剤の自由なギャップで区切られたいくつかの吸着パケットに変わります。既にパックされた吸着剤は、密集した着色連続成長領域として見える。充填された部分は、充填プロセス全体の間、小さな吸着剤の空き隙を持つキャピラリー長さの少なくとも70%に保ちます。梱包プロセス中に注意すべきいくつかの一般的な問題があります。それらは毛細管への有効な吸着物の配達を保つために機内のセットアップの調節を要求する。最も頻繁な問題は、すでに内部の吸着剤が動き続けている間に新しい吸着剤が毛細血管に入るのを止めるときである。ほとんどの場合、毛細血管の入り口は自己凝集する吸着クラスタによってブロックされます。これらのステップを、吸着フローが復元されるまで 1 つずつ適用してから、問題に関連する残りのステップをスキップします。回転速度を毎分500ラウンドに上げ、すぐに60RPMに戻します。ほとんどの場合、吸着剤の流れを復元します。残りの梱包プロセスでは、回転速度が 60 RPM 以上であることを確認します。それが役に立たない場合は、簡単に梱包爆弾を発散し、すぐにそれを加圧します。それが役に立たない場合、またはブロッキングが再び起こる場合は、吸着剤層の内側に毛細血管を再配置します。吸着剤の不在は、キャピラリーのオープンエンドがマグネットバーの上に高すぎるか、したがって、柱の端がそれに触れない可能性があります。または毛細血管が低すぎる位置にあり、バイアル底部にくっつきます。まず、爆弾を完全に通気し、ナットを緩め、毛細管を底に押し付け、2ミリメートル戻します。ナットを固定します。バルブを開けて爆弾を加圧し、梱包を続けます。パッキングの問題の詳細については、メソッドのテキストバージョンで説明します。目標列の長さと 5 ~ 7 センチが達成されるまで、列を梱包し続けます。回転を停止し、非常にゆっくりと爆弾を減圧します。爆弾弁を少し開けて、水筒の中でバブルが破裂するのを待ちます。その後、バルブを少し広く開き、再びバブルが減速するのを待ちます。したがって、段階的なステップでは、バルブからガスが出なくなるまで圧力を放出します。バルブを一度に開けないでください。それは毛細血管の中でバブリングし、吸着剤がバイアルに戻ります。その場合は、爆弾を加圧し、列が再びパックされるのを待ちます。ガスがベントバルブから出てくるのを止めたら、詰まった毛細管を圧力爆弾から取り出します。カラムを乾かさないで下してください。HPLCシステムに直ちに接続されていない場合は、パックしたキャピラリーを10%エタノール溶液に完全に浸して保存します。切断されたHPLCカラムも同様に保存されます。今日の梱包がこれ以上計画されていない場合は、爆弾から吸着バイアルを取り出し、しっかりと閉じます。さらに列の梱包のためにそれを保ちます。ステージ5、HPLCパッキング。パックされたキャピラリーをHPLC接続でHPLCシステムに接続します。高有機溶剤の流れを開始します。約300本をターゲットにしたパック長さに応じて流量を調整します。40センチメートルパック毛細血管のために毎分200〜300の通常のリットルの流量を使用してください。キャピラリーの中の緩い吸着物が詰め込まれているのを見て、詰まった長さの合計に加えます。流れを止めずに、カラム本体を超音波浴に2回浸します。列本体の一部のみを浸漬することが重要です。柱の端部と毛細管接続を浸さない。吸着剤のベッドが収縮を停止したら、流れを止めずにカラム本体を超音波浴に2倍以上浸します。300 バーで 10 分の追加の列を実行します。流れを止め、圧力が3本のバーを下回るのを待ち、列を切り離します。ギャップや変色が欠けているかどうかを視覚的に検査します。もし見つかったら、流れの下で超音波処理を繰り返すことができます。重要な実験の場合は、新しい列を作成することを検討してください。列を目的の長さに切り取ります。適切に行われた切断は、カラム効率の前提条件です。ポリアミドコーティングのノッチを筆記者で作ります。毛細管を部分的に割り、2個離して引き離します。セラミックウエハーまたはラッピングフィルムで列のフロントエンドを磨きます。超高圧接続を使用して、列をLCシステムに再接続します。作業流量を 2%B で開始し、作業流量は列パラメータに従って調整します。たとえば、100 マイクロメートルの ID カラムは、毎分 500 ナノリットルで実行されます。圧力が平衡化するのを待ち、列の背圧を確認します。適切に準備されたカラムは、長さと吸着特性に比例したバックプレッシャーを与えます。例えば、2マイクロメートルの吸着剤を詰めた30センチメートルのキャピラリーカラムは、2%の溶媒Bで450〜500バーの背圧を有する。バックプレッシャーが期待範囲外である場合、列またはLCシステムのいずれかで何か問題があります。FlashPackを使用したパッキングは、100バーの充填圧力で1時間未満で1.9マイクロメートルの吸着剤を備えた50センチメートルに詰め込まれたキャピラリーを生成します。一例として、1.9マイクロメートルReprosilPur C18 AQ吸着剤を用いた引き出されたエミッタキャピラリーに詰め込まれた30センチメートル100マイクロメートルID超高圧カラムを製造しています。パッキングは、長いエミッタ毛細管を50センチメートルに60バーで行われました。毛細血管は40分で40センチメートルに詰め込まれ、キャピラリーの中にもう少し吸着剤が詰め込まれていませんでした。パックされたキャピラリーはHPLCシステムに接続され、溶媒Bで毎分300ナノリットルで動作し、私たちの場合は80%アセトニトリル、0.1%のギ酸でした。最終的なパック長さは43センチメートルでした。柱は30センチカットされた。99%の溶媒Bを用いた毎分500ナノリットルの作業流量で、カラムは予想値に近い275本のバーのバックプレッシャーを与えた。カラムをテストするために、2〜50%Bから15分間の勾配でシトクロムCタンパク質のトリプティック消化器の50 fmolを分離した。平均FWHMは約3秒でした。記載されたプロトコルは、合理的な時間で設定された共通の100バーパッキングでUHPLCカラムを生成することができます。短いHPLCまたはUPLCカラムは数分でパックすることができ、長い30〜50センチメートルのカラムは1時間未満でパックされます。この方法は、RP と任意の列 ID に他の化学を使用して吸着剤を梱包するために効率的です。生産されたカラムは、同じようなサイズおよび吸着変数の他の商業コラムと同じくらい効果的である。

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