反応フロー高速液体クロマトグラフィー用カラムを使用したポストカラム誘導体化

本手法の全体的な目的は、反応フローカラムを用いることで、高速液体クロマトグラフィーカラム後誘導体化（PCD法）の効率と感度を向上させることです。この手法は、HPLC検出器に対するレスポンスが低い化合物を分析する医薬、生物医学、環境科学などの分野における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、反応コイルが不要である点です。

カラム溶出液と誘導体化試薬の混合が従来法よりも効率的に行われるため、本手法は抗酸化物質、アミノ酸、およびフェノールの解析に用いられてきました。また、チオール、金属、抗生物質、および毒素などの他の化合物群にも適用可能です。

サンプル全体が誘導体化されるわけではありませんが、バンド広がりが抑制されるため、流出液ストリーム中の分析物濃度は、従来のカラム後誘導体化分析よりも高くなります。この手順を開始するには、ラインAに100%水、ラインBに100%メタノールを移動相としてHPLC装置を準備し、メーカーの要件に従ってポンプをパージしてください。HPLCの装置構成部品と、追加の誘導体化ポンプをセットアップします。

次に、UV/VIS検出器を波長520 nmで分析するように設定します。反応フロー（RF）カラムの入口をHPLC装置に接続します。内径0.13 mm、長さ15 cmのチューブを使用して、出口の周辺ポートをUV/VIS検出器に接続します。

次に、DPPHポンプラインをRFカラム出口の周辺ポートに接続します。RFカラム出口の未使用の周辺ポートをカラムストッパーで塞ぎます。内径0.13 mmのチューブを15 cm切り出し、RFカラム出口の中央ポートに接続します。

HPLCポンプの流速を100%メタノールで1 mm/minに設定します。次に、カラムを100%メタノールで10分間平衡化させます。この間に、DPPHの0.1 mg/mLメタノール溶液を調製します。

DPPH試薬を入れたフラスコを10分間超音波処理します。メーカーの指示に従い、調製したDPPH試薬でDPPHポンプをパージします。その後、乾燥した清潔な容器を2つ用意し、一方に「central」、もう一方に「peripheral」とラベルを貼ります。これら2つの容器を正確に秤量します。

中央ポートから流出する液を、「central」と記載された容器に1分間回収します。中央ポート用容器を再度計量し、中央ポートからの流量の重量を算出します。RFカラムの周辺ポートに接続されたUV/VISから流出する液についても、同様の手順を繰り返します。

周辺ポート容器の重量を算出します。次に、中央ポートおよび周辺ポートからの流入量の割合を算出します。流量比が適正になるまで前の手順を繰り返し、その後、DPPHポンプの流量を0.5 milliliters per minuteに設定します。

ランが終了したら、誘導体化試薬ポンプの流れを停止させます。DPPH試薬ポンプラインをペリフェラルポートから取り外し、ポートにストッパーを嵌めます。保存に使用する移動相でカラムを平衡化させ、移動相を1 mm/minの流速で10分間カラムに流します。

次に、HPLC装置のバブルフェーズポンプの流れを停止させます。最後に、DPPH試薬をメタノールに交換し、追加ポンプをパージします。ここでは、従来のPCDおよびRF-PCDの両方の装置を用いてDPPHラジカルで誘導体化したリストレットコーヒーサンプルの2つのクロマトグラムを示します。

RF-PCDおよび従来のPCDモードの両方で分析した各アミノ酸について、算出された定量限界および検出限界をここに示します。従来のPCD法、RF-PCD法、およびRF-PCD法における非誘導体化ストリームを用いて分析した4つのアミノ酸のクロマトグラムをここに示します。従来のPCD法とRF-PCD法の両方を用いて得られた、グリシンおよびロイシンのピークに由来する信号の比較をここに示します。

従来のPCD法、RF-PCD法、およびRF-PCD法における非誘導体化ストリームを用いて分析した際のトリプトファンピークの半値幅の比較をここに示します。誘導体化スキームに対して応答を示す成分と示さない成分の両方を含む21成分のテストサンプルを分離、誘導体化し、検出しました。比較のため、同一の混合物を誘導体化せずに分離および検出しました。

RF-PCDカラムを用いて誘導体化したpara-Cresolと、誘導体化していないもののピーク形状の比較をここに示します。この手法を習得すれば、従来のカラム後誘導体化分析と同等の時間でセットアップすることが可能です。本手順を行う際は、規定の流量比に可能な限り近づけることが重要です。

本手順に従い、OPA、ニンヒドリン、またはハロゲンなどの他のカラム後誘導体化試薬を使用して、他の化合物を分析することが可能です。このビデオを視聴することで、反応フローカラムのセットアップおよび調整方法について十分に理解できるはずです。