反応フロー高速液体クロマトグラフィー用カラムを使用したポストカラム誘導体化

この分析法の全体的な目標は、反応フローカラムを使用して、高速液体クロマトグラフィーポストカラム誘導体化(PCD)の効率と感度を向上させることです。この方法は、HPLC検出器に対する応答性が低い化合物を分析する製薬科学、生物医学、環境科学などの分野で重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、リアクションコイルが不要であることです。

カラム廃液と誘導体化試薬の混合が従来の方法よりも効率的に行われるため。この方法は、抗酸化物質、アミノ酸、およびフェノール類に関する洞察を提供するために使用されています。また、チオール、金属、抗生物質、毒素などの他のクラスの化合物にも適用できます。

サンプル全体が誘導体化されるわけではありませんが、バンドの広がりが小さいため、流出流流内の分析種の濃度は従来のポストカラム誘導体化分析よりも高くなります。この手順を開始するには、移動相としてライン A に 100%の水、ライン B に 100% のメタノールを含む HPLC 装置を準備し、製造元の要件に従ってポンプをパージします。HPLC機器コンポーネントと追加の誘導体化ポンプをセットアップします。

これに続いて、UV / VIS検出器を520ナノメートルの波長で分析するように設定します。反応フロー(RF)カラムの入口をHPLC装置に接続します。UV/VIS検出器には、内径15mm、内径0.13mmのチューブを使用して、コンセント周辺ポートを接続します。

次に、DPPHポンプラインをRFカラムの出口にある周辺ポートに接続します。RFカラムの出口にある未使用の周辺機器ポートを、カラムストッパーで塞ぎます。長さ15センチメートル、内径0.13ミリメートルのチューブをRFカラムの出口中央ポートに接続します。

HPLCポンプの流量を100%メタノールで毎分1mmにします。次に、カラムを100%メタノールで10分間平衡化します。この時点で、DPPHとメタノールの0.1ミリグラム/ミリリットル溶液を準備します。

DPPH試薬を含むフラスコを10分間超音波処理します。製造元の要件に従って、準備したDPPH試薬でDPPHポンプをパージします。これに続いて、2つの乾燥した清潔な容器を取り、一方を「中央」、もう一方を「周辺」とラベル付けします」2つの容器を正確に計量します。

中央港から出る排水を「中央」とラベル付けされた容器に1分間収集します。中央港湾の船舶の重量を再計量した後、中央港からの流れの重量を計算します。RF カラムの周辺ポートに接続されている UV/VIS から出る排水について、前の手順を繰り返します。

周辺港湾の重量を計算します。次に、中央ポートと周辺ポートから来るフローの割合を計算します。流量比が正しくなるまで前の手順を繰り返してから、DPPHポンプの流量を毎分0.5ミリリットルに設定します。

ランが終了したら、誘導体化試薬ポンプの流れを停止します。DPPH試薬ポンプラインを周辺ポートから取り外し、ポートをストッパーします。カラムを保存対象の移動相と平衡化し、移動相が1分間に1ミリメートルでカラムを通過できるようにします。

次に、HPLC装置の気泡相ポンプの流れを停止します。最後に、DPPH試薬をメタノールに交換し、追加のポンプをパージします。ここでは、従来の PCD 装置と RF-PCD 装置の両方を使用して DPPH ラジカルで誘導体化したリストレット コーヒーサンプルの 2 つのクロマトグラムを示します。

RF-PCDモードと従来のPCDモードの両方で分析した各アミノ酸の定量と検出の計算された限界をここにリストアップしています。従来のPCD法、RF-PCD法、RF-PCD法で分析した4種類のアミノ酸のクロマトグラムと、RF-PCD法の非誘導体化ストリームを示します。ここでは、従来のPCD法とRF-PCD法の両方を使用して、グリシンとロイシンによるピークについて得られたシグナルの比較を示します。

ここでは、従来のPCD法、RF-PCD法、RF-PCD法による未誘導体化ストリームを用いた分析時のトリプトファンピークのピーク幅の比較を示します。誘導体化スキームに対する応答を示す成分と、分離、誘導体化、および検出されなかった成分を含む21成分の試験サンプル。同じ混合物も分離し、比較のために非誘導体化して検出しました。

ここでは、RF-PCDカラムを使用して誘導体化したパラクレゾールと非誘導体化したパラクレゾールのピーク形状の比較を示します。この手法を習得すれば、従来のポストカラム誘導体化分析と同時にセットアップできます。この手順を実行するときは、規定の流量比にできるだけ近づけることを覚えておくことが重要です。

この手順に従うと、OPA、ニンヒドリン、ハロゲンなどの他のポストカラム誘導体化試薬を使用して、他の化合物を分析できます。このビデオを見れば、リアクションフローカラムのセットアップ方法とチューニング方法についてよく理解できるはずです。