フロースルーマイクロリアクターとMS検出のためのタンパク質の高速酵素処理
2016年4月6日
エレクトロスプレーイオン化(ESI)質量分析計と組み合わせた社内構築のフロースルートリプシンマイクロリアクターによるタンパク質分解の迅速なプロトコルが提示されます。マイクロリアクターの作製、実験装置、データ取得プロセスについて説明します。
このプロトコルの全体的な目標は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計によるタンパク質同定を可能にするために、タンパク質の高速酵素消化を行うフロースルートリプシンマイクロリアクターの作製を説明することです。この分析法は、単離および精製されたタンパク質のアミノ酸配列を例示し、構造および機能の下流の特性評価をサポートするのに役立ちます。このプロトコルの主な利点は、高速で費用対効果が高く、微細加工されたプラットフォームを利用するワークフローに統合しやすいことです。
まず、ガラスキャピラリークリーバーを使用して、大きい方のガラスキャピラリーチューブを7〜8センチメートルの長さに切断し、小さい方のガラスキャピラリーチューブを3〜5センチメートルの長さに切断します。顕微鏡を使用して、毛細血管の両端がきれいにまっすぐにカットされており、バリが突き出ていないことを確認します。小さい方の毛細管を大きい方の毛細管の一方の端に約6mm挿入します。
次に、Qチップを使用して、毛細血管の接合部の周りに接着剤の小さな液滴を塗布し、接着剤を室温で一晩硬化させます。次に、挿入した毛細管を約10〜15ミリメートルの長さにカットします。この端部は、エレクトロスプレーイオン化エミッターとして機能します。
大口径のキャピラリーの反対側の端を、長さが4〜5センチメートルで事前にカットされ、PEEKユニオンに接続された1/32インチのPEEKチューブに挿入します。次に、長さ5cmの1/16 PTFEチューブをユニオンの反対側の端に挿入して締めます。清潔で乾燥した2ミリリットルのガラスヤスリに、4ミリグラムのC18粒子を計量し、次に0.5ミリリットルのイソプロパノールを追加します。
バイアルを閉じます。それを超音波浴に入れ、超音波処理して粒子を溶液中に均一に分散させます。次に、250マイクロリットルの注射器を使用して、200マイクロリットルのC18スラリーを吸い上げます。
シリンジを1/16インチのPTFEチューブに挿入し、スラリーを大きなキャピラリーにゆっくりと分注します。毛細血管が粒子で満たされるのを顕微鏡で観察し、2〜3ミリメートルの粒子充填が達成されるまで観察します。小さなキャピラリーチューブは、キーストーン効果を通じてこれらの粒子をマイクロリアクターに保持します。
最後に、50マイクロリットルの50〜50の水とアセトニトリルの溶液でマイクロリアクターをすすぎ、続いて49マイクロリットルの水を含む溶液50マイクロリットルを1マイクロリットルのアセトニトリルと混合します。キャピラリーマイクロリアクターをPEEKユニオンから外し、PEEK-Tに接続します。次に、1/32インチのPEEKスリーブで絶縁された長さ2センチのプラチナワイヤーを挿入して、PEEK-Tのサイドアームに漏れのない接続を提供します。
長さ半メートルのサンプル移送キャピラリーをPEEK-Tの反対側の端に接続します。1/32インチのPEEKスリーブを使用して、漏れのない接続を提供します。XYZステージにPEEK-Tを固定します。
そして、エレクトロスプレーイオン化エミッターを質量分析計の入口キャピラリーから約2mm離して配置します。次に、白金線を質量分析計のエレクトロスプレーイオン化電源に接続します。また、サンプル移送キャピラリーの反対側の端をステンレス鋼ユニオンに接続し、1/16インチのPEEKスリーブを使用して漏れのない接続を提供します。
次に、長さ4〜5センチメートルの1/16インチPTFEチューブをステンレス鋼ユニオンの反対側の端に接続します。付属のテキストプロトコルに記載されているタンデムMSデータ取得パラメータを、MS装置を制御するソフトウェアパッケージに入力します。それらをメソッドファイルとして保存して、解析を実行するためのセットアップを準備します。
LTQ MSシステムには、自家製のXYZステージを含む改良されたESIソースが取り付けられており、質量分析計をさまざまなサンプルインプットアプローチにインターフェースすることができます。250マイクロリットルのシリンジに、2%のアセトニトリルに溶解した50ミリモルの重炭酸塩の水溶液を入れます。.次に、シリンジをマイクロリアクターに接続し、シリンジポンプの下に置きます。
マイクロリアクターと毎分2マイクロリットルを5分間すすぎ、分析の準備をします。次に、目的のタンパク質サンプルを250マイクロリットルのシリンジにロードし、サンプル溶液を毎分2マイクロリットルで5分間注入します。次に、5マイクロモルのトリプシン溶液を装填した250マイクロリットルのシリンジをシリンジポンプの下に置き、吸収されたタンパク質をマイクロリアクターに1〜3分間毎分2マイクロリットルで注入します。
各実験の前に、トリプシン溶液を新たに解凍して準備することが重要です。これにより、原型溶解酵素がその活性とマイクロリアクターの操作pH(pH約8)を保持することが保証されます。別の250マイクロリットルのシリンジに、0%1%のトリフルオロ酢酸を2%アセトニトリルに添加した水溶液を入れます。.
この溶液を使用して、マイクロリアクターを毎分2マイクロリットルで5分間すすぐことにより、タンパク質分解分解プロセスを急冷します。次に、50%アセトニトリルに01%トリフルオロ酢酸を添加したシリンジに切り替え、エレクトロスプレーイオン化電圧を約2000ボルトにしたMSデータ収集プロセスをオンにします。酸性化した溶液を使用して、マイクロリアクターからタンパク質消化物を毎分300ナノリットルで20〜30分間溶出し始めます。
付属のテキストプロトコールに記載されているデータ取得パラメータを使用して、質量分析データを取得します。LTQ MS の生ファイルを最小限の冗長性を持つタンパク質データベースを使用して処理し、まず検索エンジンに生データをアップロードします。次に、親イオンとフラグメントイオンの質量許容誤差をそれぞれ 2 ダルトンと 1 ダルトンに設定し、最大で 2 つの切断が欠落している完全トリプシンフラグメントのみを検索に使用します。
さらに、高信頼度と中信頼度の偽検出率をそれぞれ 1% と 3% に設定し、特定の変更を特に探さない限り、翻訳後の変更を許可しません。最後に、データをフィルタリングして、信頼度の高いペプチドの一致のみを選択します。ここに示されているのは、マイクロリアクターでタンパク質分解を行ったタンパク質混合物から生成されたトリプシンペプチドからなるマススペクトルです。
これらの標識は、最も強度の高いトリプシンペプチドイオンを表し、その配列と対応するタンパク質識別子を提供します。このマイクロリアクターは、タンパク質の酵素消化を行うための実装が容易な実験セットアップを提供し、30分以内に質量分析と同定を可能にします。この手順を試行する際には、溶液と接触するバイアルや機器の清浄度を維持することが、サンプルの汚染を避けるために重要であることを覚えておくことが重要です。
この手順に続いて、他の質量分析データ取得法を使用して、生成ペプチドのより優れた特性評価を可能にし、タンパク質の構造に関連する追加の質問に答えることができます。この技術は、その開発後、プロテオノミクスの分野の研究者がタンパク質分析のためのより迅速なプロトコルを開発し、生物学的サンプルのハイスループット探索を可能にする新しい微粒子分析プラットフォームの開発を探求する道を開きました。この手法は、25〜50個のペプチドを生成するかなり単純なタンパク質混合物の分析に限定されています。
これらのペプチドは、簡単な注入実験で分析でき、MS分析の前に液体クロマトグラフィーを分離する必要はありません。有機溶剤での作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に裸火を避けるなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
本プロトコルでは、タンパク質の迅速な酵素消化を目的として設計されたフロースルー型トリプシンマイクロリアクターの作製について説明します。これにより、エレクトロスプレーイオン化質量分析によるタンパク質同定が容易になります。本手法では、速度、コスト効率、およびマイクロファブリケーションワークフローとの互換性を重視しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- プロテオミクス
- 質量分析
- 微細加工
背景
- タンパク質分析には、タンパク質分解による消化が不可欠である。
- エレクトロスプレーイオン化質量分析法は、タンパク質同定のための重要な技術である。
- マイクロリアクターは、酵素反応の効率を高めることができる。
- プロテオミクスのワークフローには、迅速で費用対効果の高い手法が求められている。
研究目的
- 迅速なタンパク質消化のためのマイクロリアクターを作製する。
- 質量分析を用いた効率的なタンパク質同定を可能にする。
- この手法を既存のマイクロファブリケーションプラットフォームに統合する。
使用方法
- ガラスキャピラリーチューブを特定の長さに切断する。
- マイクロリアクターを組み立てるため、太いキャピラリーに細いキャピラリーを挿入する。
- 顕微鏡を用いてキャピラリー端部の品質管理を行う。
- マイクロリアクターをエレクトロスプレーイオン化質量分析計に接続する。
主な結果
- このマイクロリアクターにより、タンパク質の迅速な酵素消化が可能になります。
- 質量分析との統合により、タンパク質の同定がサポートされます。
- 本手法は効率的であり、ハイスループットアプリケーションに適しています。
- 品質管理により、マイクロリアクターの信頼性の高い性能が保証されます。
結論
- 本プロトコルは、タンパク質消化のための迅速かつ費用対効果の高いアプローチを提供します。
- これにより、研究環境におけるタンパク質分析のワークフローが効率化されます。
- このマイクロリアクター設計は、プロテオミクスのさまざまなアプリケーションに適応可能です。
よくある質問
産業界における重要性
タンパク質の迅速な酵素消化は、質量分析ベースのプロテオミクスワークフローにおける重大なボトルネックであり、ターゲットのバリデーションやリード化合物の同定までのタイムラインに直接的な影響を与えます。このフロースルー形式のマイクロリアクターアプローチは、消化時間を一晩から3分未満に短縮し、初期探索における迅速な仮説検証とメカニズムのリスク低減を可能にします。コスト効率が高く統合可能な設計により、スケーラブルなアッセイ開発と、後続の分析における信頼性を担保する再現性の高いペプチド生成がサポートされます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：タンパク質配列の迅速な解析を可能にし、機能的なターゲット検証およびパスウェイの解明を支援する。
- 運用上の価値：タンパク質分解消化時間を数時間から数分に短縮し、仮説検証サイクルを加速させる。
- 予測的価値：信頼性の高い質量分析検出のために一貫したトリプシン消化ペプチドを生成し、実験間のデータ再現性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：ターゲットエンゲージメント研究における定量MSベースのアッセイに適した、標準化されたペプチド出力を生成します。
- 運用の価値：高価な固定化酵素の必要性を排除し、ハイスループットスクリーニング準備における試薬コストを削減します。
- アッセイへの適用性：ダイレクトインフュージョンMSに対応した消化済みサンプルを提供し、ワークフローの統合を効率化します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性： 創薬から前臨床検証段階に至るまで、一貫したタンパク質同定をサポートします。
- メカニズム面でのリスク低減： ペプチド生成のばらつきを抑え、ターゲットエンゲージメントおよびバイオマーカー測定の信頼性を向上させます。
- 予測の信頼性： MS検出による迅速な構造的知見を提供することで、リード最適化における高速なイテレーションを可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットバリデーションからリード化合物同定に至る創薬の探索プロセスに適合し、迅速なタンパク質消化によってタイムリーなMSベースの特性解析を可能にすることで、開発の継続（go/no-go）の意思決定に寄与します。
- 発見生物学： タンパク質を検出可能なペプチドへ迅速に変換させることで、仮説駆動型のタンパク質解析を促進します。
- スクリーニング： クロマトグラフィーによる分離を行わずに消化サンプルを調製し、迅速なスクリーニングキャンペーンを可能にすることで、スループットを向上させます。
- 分析学： 定義された質量許容範囲を持つ完全なトリプシン消化ペプチドを生成し、信頼性の高いデータベース検索と偽発見率（FDR）の制御を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ： 前臨床モデルにおける構造的および機能的な連続性を裏付けるペプチドレベルのデータを提供します。
- エンタープライズ再利用： 標準的なキャピラリーおよびチューブコンポーネントを使用しているため、さまざまなプロテオミクスプラットフォームや研究室への適応が可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値：再現性のある迅速なペプチド生成により、ターゲットバリデーションの信頼性を向上させる。
- 運用的価値：実作業時間と試薬コストを削減し、ラボのスループットを向上させる。
- 戦略的価値：タンパク質解析ワークフローを短縮することで、リード化合物の同定までの期間を加速させる。
- ポートフォリオへの影響：ターゲットバリデーションデータにおける生物学的不確実性を低減し、より迅速なgo/no-go判断を可能にする。
実施上の検討事項
- マイクロ流体アセンブリおよびエレクトロスプレーイオン化セットアップの専門知識が必要です。
- 互換性のあるイオン化源を備えた質量分析システムへのアクセスに依存します。
- 酵素活性を維持するために、標準化されたトリプシン調製およびクエンチングプロトコルが必要です。
- 出典資料にある通り、25–50本のペプチドを生成する単純なタンパク質混合物に限定されます。
- アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸を使用するため、慎重な溶媒取り扱いが必要です。
