Name: フロースルーマイクロリアクターとMS検出のためのタンパク質の高速酵素処理 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶフロースルーマイクロリアクターによるタンパク質の高速酵素処理法。電気噴霧イオン化質量分析計を用いたタンパク質同定に適し、迅速かつ低コストなプロテオミクスワークフローを実現します。

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キャピラリーマイクロリアクターの調製<ol><li> 100μmの内径（ID）が360μmの外径（OD）7〜8センチメートルの長さに毛細血管、およびガラスキャピラリー包丁で3〜5センチメートル〜20μmでID×90ミクロンのODキャピラリーをxはカット。任意の突出バリなし、両方のキャピラリー端がきれい、ストレートカットを持って、顕微鏡下で確認してください。 </li><li> 〜6mmの長さのために、100μmのIDのx 360μmの外径キャピラリーの一端には20μmID×90ミクロンのODキャピラリを挿入します。必要な場合には、顕微鏡下でこの動作を観察します。 </li><li> Q-チップの先端と90μmのOD / 100μmのIDを毛細血管の接合の周りに接着剤E6000の小滴を適用し、室温で接着剤の硬化O / Nをしましょう​​。 </li><li> 10~15ミリの長さまで挿入さ20μmID×90ミクロンのODキャピラリーをカット。これは、エレクトロスプレーイオン化エミッタとなります。 </li><li> 1/32 &quot;OD PEEK、1/16&quot; OD PEEKと1/16 &quot;OD PTFE浴槽カット済み長さ4-5センチの作品でる。これらは、漏れのない接続を提供するためのキャピラリー組合で使用袖になります。 </li><li> PEEK組合に100μmのIDのx 360μmの外径キャピラリーの反対側の端を接続します。漏れのない接続を提供するための1/32 &quot;PEEKスリーブを使用します。 </li><li>挿入/労働組合の反対側の端に〜の片5 cmの長さ1/16 &quot;PTFEチューブを締めます。 </li><li> C18の約4 mgの（5μm）と粒子が予備洗浄乾燥/ 2mLのガラスバイアルで計量します。 、0.5ミリリットルのイソプロパノールを追加バイアルを閉じ、超音波処理槽内のスラリーを分散させます。 </li><li> 250μlの注射器で撤退約200μlのスラリー、PEEK組合の1/16 &quot;PTFEチューブに注射針を挿入し、100ミクロンのIDのx 360μmの外径キャピラリーにゆっくりスラリーを分配;のように顕微鏡下で観察しますこれは、マイクロリアクター（ 図1）となります20μ; 2-3ミリメートルパッキングの長さが達成されるまで、毛細管は粒子で満たさm個のIDキャピラリーは、キーストーン効果によりマイクロリアクター中の粒子を保持している。15 </li><li> H 2 O / CH 3 CN 50：50 V / Vの50μlの溶液を〜とマイクロリアクターをすすぎ、その後、H 2 O / CH 3 CN 98の50μlのソリューション〜と：2（v / v）です。 </li></ol>サンプル溶液の調製注：有機溶媒および酸の取り扱いを伴う操作および溶液調製をヒュームフード内で行われるべきです。ゴーグル、手袋、防護服を着用してください。 <ol><li> CH 3 OHで洗浄し、いくつかのガラスバイアル（4ミリリットル）とポリプロピレンチューブ（15ミリリットル）を乾燥させます。 </li><li> 200μlのCH 3 CN 9.8 mlのH 2 Oを混合して15mlのポリプロピレンチューブ中で、H 2 O / CH 3 CN（2 V / V 98）の溶液10mlを調製超音波処理によって混ぜます。 </li><li>溶液10mlを調製し、H 2 O / CH 3 CN（50:50 v / v）の15mlのポリプロピレンチューブ中の5mLのH 2を混合して&lt;/サブ&gt; Oと5ミリリットルのCH 3 CN;超音波処理によって混ぜます。 </li><li> 4 mLのH 2 O / CH 3 CNに4μlのTFA（10％）を加えることにより酸性化した水性溶液4ml（TFA 0.01％V / V）を調製する：4 mLのガラスバイアル中（98 2 V / V）超音波処理によって混ぜます。 </li><li> 4 mLのガラスバイアルに4 mLのH 2 O / CH 3 CN（50:50 v / v）に4μlのTFA（10％）を加えることにより酸性化し、有機溶液4ml（TFA 0.01％V / V）を調製します。超音波処理によって混ぜます。 </li><li> 16 mgのNH 4 HCO 3を計量 4ミリリットルのガラスバイアルにおける分析天秤を持ちます。 （2 V / V 98）溶液を超音波処理によって分散させる; H 2 Oを4ml / CH 3 CNを加えますこれは、水性緩衝液中のNH 4 HCO 3（pH約7.8）の50 mM溶液をもたらします。 </li><li> 4ミリリットルのガラスバイアルにおける分析天秤で、標準的なタンパク質（ 例えば 、ウシ血清アルブミン、ヘモグロビンα/β、チトクロームC、炭酸脱水酵素、α-2-HS糖タンパク質、）5mgを計量します。 4ミリリットルのDIウォートを追加rと超音波処理により分散させます。これは、典型的には、高μMレベルの濃度の溶液をもたらします。 </li><li> NH 4 HCO 3（50 mM）の水性緩衝液の適切な量で高μMレベルの濃度の溶液を希釈することにより1ミリリットルタンパク質溶液（1-2μM）を準備。超音波処理によって混ぜます。 </li><li> NH 4 HCO 3（50 mM）の水性緩衝液μlの170で20μgのシーケンシンググレードのトリプシンを溶解することによりトリプシン溶液（5μM）を準備。超音波処理によって分散させます。 </li></ol> 3.実験のセットアップ注：LTQ-MSシステムは、様々なサンプル入力アプローチに質量分析計のインターフェースを可能に自作XYZステージを含んで修正されたESI源が装備されています。 <ol><li> PEEK組合から毛細管マイクロリアクターを外し、PEEKティーに接続します。 </li><li> PEEKティーのサイドアームに約2センチPt線を挿入します。提供するための1/32 &quot;PEEKスリーブを使用漏れのない接続とPt線を絶縁するため。 </li><li> 50ミクロンのIDのx 360μmの外径（〜0.5メートルの長さ）サンプル移送毛細管は、PEEKティーの反対側の端部に接続します。漏れのない接続を提供するための1/32 &quot;PEEKスリーブを使用します。 </li><li> XYZステージ上PEEKティーを確保し、離れて質量分析計の入口キャピラリーから〜2ミリメートルESIエミッタを配置します。 </li><li>質量分析計のESIの電力供給源に白金線を接続します。 </li><li>ステンレス鋼の組合へのサンプル移送毛細管の反対側の端を接続します。漏れのない接続を提供するための1/16 &quot;PEEKスリーブを使用します。 </li><li> 、ポンプをオンにして所望の値に流量を設定する（ 例えば 、ステンレス鋼労働組合の反対側の端部4〜5 cmの長さ1/16 &quot;PTFEチューブを接続し、PTFEチューブ内の250μlの注射針を挿入2μL/分）。 </li><li> MS機器ANを制御するソフトウェアパッケージに入力タンデムMSデータ収集パラメータ分析を行うための準備セットアップにメソッドファイルとして保存しますdは、 LTQ-MSシステムのために、以下のデータ依存解析パラメータを使用します。除​​外質量幅180秒間有効ダイナミック除外を1.5メートル/ zの±; 1 MSは、トップ5最も強いピークに1ズームとMS 2のスキャンに続いてスキャンし、スキャン幅±5のm / zをズーム。衝突誘起解離分離幅3メートル/ zの、正規化衝突エネルギー35％、活性化Q 0.25、および活性化時間30ミリ秒に設定（CID）パラメータ。 </li></ol> 4.マイクロ流体セットアップ<ol><li> （1）マイクロリアクターからなる、デバイスの16-18レイアウトは、 図2Aに設けられている。（0.13ミリメートル幅×2ミリの長さ×50ミクロンの深）の入口に接続された（2;ガラスまたはポリマー基板からマイクロ流体デバイスを準備します）、出口（3）およびサイドポート（4）。流体操作のための相互接続チャネルである〜110ミクロン、幅〜50μmの深いです。マルチチャネル構造は、（5）、からなる〜1.5〜2ミクロンの深×10ミクロン幅×置か100μmの長いマイクロチャネル25ミクロン離れて、マイクロリアクター中の粒子を保持するためのフィルタとして機能します。 </li><li>入口ポートに専用コネクタを接着することによって、または流体送達（ 図2B）用の金具を収容したポリマースタンドを工夫することにより、チップへの流体送達接続を有効にします。16 </li><li>ステップ1.8で説明したようにC18粒子（5ミクロン）のスラリーを準備します。チップ側ポートに接続された1/16 &quot;PTFEチューブ（4）を用いて注射器でマイクロリアクターにスラリーを送達; 90ºCのオーブン中で1時間、エポキシ接着剤と硬化と、粒子のロード後にポートをシール16。 </li><li> 、出口ポートにキャピラリー（20μmのID×90μmの外径×10ミリの長さ）を挿入E6000接着剤で封止し、そしてキュアO / Nをしましょう​​。これは、（ESIエミッターとなります<strong&gt; 6）。 </li><li> 50μmのIDのx 360μmの外径（〜0.5メートルの長さ）サンプル移送キャピラリーはチップ入口ポート（2）に接続します。 3.6から3.7に記載されているように、250μlのシリンジとシリンジポンプにキャピラリーの反対側の端を接続します。 </li><li>直前の入口ポートへのサンプル移送ライン（2）上の軽量PEEKティーコネクタを配置し、3.2で説明したように、ティーのサイドアームにPt線を挿入します。これは、ESI電極となります。 </li><li>質量分析計の入口キャピラリーから〜2ミリメートル離れて配置さESIエミッタとXYZステージ上にマイクロ流体デバイスを固定します。 3.8で説明したように、分析のためのMSを準備します。 </li></ol> 5.サンプルのロード、MS分析のためのタンパク質分解消化および溶出注：すべての溶液/試料移送ステップは、シリンジポンプの助けを借りて行われ、完了するためにいくつかの追加分を可能にすべきである、デッドvolumを補償するために、マイクロリアクターへとからの転送ラインに関連したエス。必要な時間は、関与の流量に依存します。 <ol><li> 5分間2μL/ minで：（2 V / V 98）、マイクロリアクターを洗浄し、分析の準備をし、H 2 O中のNH 4 HCO 3（50ミリモル）の水溶液を注入することによって/ CH 3 CN 250μlの注射器を使用しています。 </li><li> 5分間、2μL/分で試料溶液を注入することによりマイクロリアクターのタンパク質試料（1μM）を読み込みます。 250μlの注射器を使用しています。 </li><li> 1-3分間2μL/ minでマイクロリアクターに吸着されたタンパク質の上にトリプシン溶液（5μM）を注入します。 </li><li> TFAの酸性化水溶液でマイクロリアクターをすすぐことによって、タンパク質分解消化プロセスを停止（0.01％v / v）のH 2 O / CH 3 CN中の（98：2 v / v）で2μL/分で5分間。 250μlの注射器を使用しています。 </li><li> TFAの酸性化有機溶液（0.01％を注入することによりマイクロリアクターからタンパク質消化物を溶出開始v / v）のH 2 O / CH 3 CN（50:50 v / v）の300 NL /分。 </li><li> MSデータ取得処理とESI電圧（〜2000 V）をオンにします。ステップ3.8において提供されたデータ収集パラメータを使用して、MSデータを取得します。トリプシンペプチドの溶出を観察します。 </li></ol> 6.データ処理<ol><li>生のMSデータフォーマットと互換性のある検索エンジンでタンデムMSデータを処理します。 <ol><li>生物の特定の最小限の冗長タンパク質データベースを使用して、LTQ-MS RAWファイルを処理します。検索のための切断を逃した、検索エンジンで生データをアップロードし、それぞれ2および1ダに親とフラグメントイオン質量許容範囲を設定し、最大2つので唯一の完全にトリプシンフラグメントを使用します。翻訳後修飾のために許可されていません。それぞれ、1％、3％に高、中、自信偽発見率（FDR）を設定し、翻訳後修飾することができません。 </li></ol></li><li>唯一の高自信を選択するために、データをフィルタペプチドは、データベース内のタンパク質にマッチします。タンパク質およびペプチドレベルの結果を評価します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

この研究に記載のマイクロリアクターは、簡単に実装する30分未満でMS分析と識別を可能にするために、タンパク質の酵素消化を実施するための実験を​​提供します。このシステムの明確な利点は、従来の手法と比較して、簡単、高速、低試薬消費と低コストが含まれます。特に、高価な固定化トリプシンビーズおよびカートリッジを必要としません。毛細管マイクロリアクターの製造は簡単な（ 図1A）であり、一般にクロマトグラフィー実験室で見られる標準供給、から数分以内に達成することができます。逆相C18粒子が吸着されたタンパク質またはペプチドを完全に除去するための高有機含量溶媒（CH 3 CNまたはCH 3 OH）でリンスすることができ、マイクロリアクターを再使用することができ、簡単かつ費用対効果の高い製造工程ながらシングルユースAPPLICための使い捨てユニットを製造するための招待状ations。毛細管マイクロリアクターは、 図1（b）に示すように 、自作ESI源に取り付けることができ、または標準的な市販のイオン源に挿入...

精製タンパク質の同定および特徴付けは、しばしばMS技術を使用することによって達成されます。タンパク質が酵素で消化され、そのペプチドは、さらに単純な注入実験を用いてMSによって分析します。タンパク質分解性消化は、ほとんどのMS分析器の有用な質量範囲に小さいペプチド断片を生成するために必要であり、それは容易に、アミノ酸配列情報を生成する低エネルギー衝突誘起解離を介して断片化することができます。単離されたタンパク質または単純なタンパク質混合物のために、MS検出の前に、ペプチドのクロマトグラフ分離のための更なる必要はありません。 25-50ペプチドの混合物は、容易にMSのイオン源に直接シリンジポンプを用いてサンプルを注入することによって分析することができます。 質量分析計は、分析を実行し、短い時間枠内でタンパク質の配列を確認することができます。現代のデータ取得方法と、この方法は、wを実現することができます数分あるいは秒をithin。短い時間スケールで全体のプロセスを完了するの制限要因は、タンパク質分解消化ステップです。 （50-100）の酵素比：一般的に、これは、基板を使用して、37ºCでは、溶液中で、数時間（またはO / N）を介して実行される1。分または秒に酵素消化時間を短縮するために、固定化酵素マイクロリアクタ、マイクロ流体リアクターまたは市販のカートリッジの形で記載されている。1-6一般的に、酵素は、共有結合、非共有結合的/物理吸着、錯体によって固定されています形成またはカプセル化、大規模な対体積表面と酵素-基板の比率によって有効にされている酵素プロセスの3,6効率化。固定化された反応器のさらなる利点は、MS分析における酵素の自己消化との干渉を低減した酵素安定性および再利用性を向上させることを含みます。様々なアプローチ、ガラスを使用して、またはポリマーの微細加工装置が記載されており、抗体-抗原相互作用によって磁気ビーズ上に固定化酵素を使用して、7,8 9 は 、チタニア-アルミナゾル-ゲル10とnanozeolites 11の中に封入又はNi-NTAまたはHisタグ複合体形成を介して捕捉され、金ナノ粒子のネットワーク中に取り込ま。6あるいは固定化酵素を用いたオープン管状キャピラリーは同様に、開発されてきた。12また、強化されたタンパク質分解的切断が30-120に反応時間を減少させるために制御マイクロ波照射13または圧力補助または圧力循環技術（PCT）を使用して実証されています分。14 固定化酵素リアクターの複数の利点にもかかわらず、商業的なカートリッジのコストが高く、日常的な使用のためのマイクロ流体デバイスの利用可能性は制限され、そして追加の計測のために必要とするマイクロ波またはPCT技術の結果を使用します。この作業の目的は、circumve方法を開発することでしたこれらの欠点をNTS、それは容易に分以内MS分析のための調製物中のタンパク質の酵素的切断を行うための簡単​​かつ効果的なアプローチの研究に力を与えるために、すべての実験室で実施することができます。アプローチは、疎水性、キャピラリーまたはマイクロ流体デバイスにあらかじめロードされているC18-粒子、及び以上の酵素の注入の間に酵素消化に続いて、これらの粒子上の目的のタンパク質の吸着の使用に依存しています充填床と撮影したタンパク質（複数可）。このアプローチでは、基板は、非共有結合相互作用を介して固定化され、酵素を固定化されたタンパク質上に注入されます。タンパク質分解消化効率は、酵素処理、還元および粒子の表面からの距離と拡散時間の蛋白質を露出大きな粒子表面積増加物質移動、酵素の活性に影響を与える可能性がない共有結合、能力を向上させることが迅速にevaluat異なる酵素、廃棄、および多重化の電子の組み合わせ処理は、マイクロ流体形式で実行された場合。このアプローチは、標準的なタンパク質およびESI-MS検出の前にタンパク質分解消化のためのトリプシン最も一般的に使用される酵素の混合物を使用して実証されています。この研究において検出のために使用される質量分析計は、線形トラップ四重極（LTQ）装置でした。

<table><tbody><tr><td>イオントラップ ESI-MS</td><td>サーモエレクトロン</td><td>LTQ</td><td>LTQ質量分析計は、タンデムMSデータの取得に使用されます</td></tr><tr><td>XYZステージ</td><td>ニューポート</td><td>複数の部品</td><td>自作のXYZステージは、市販のLTQ nano-ESIソースを適応させて、さまざまなサンプル送達システムからの入力を受け入れるために使用されます</td></tr><tr><td>ステレオ顕微鏡</td><td>エドモンド光学</td><td>G81-278</td><td>顕微鏡は、マイクロリアクターのパッキングプロセスを観察するために使用されます</td></tr><tr><td>分析天びん/メトラーVWR</td><td></td><td>46600-204</td><td>天びんは、タンパク質サンプルの計量に使用されます</td></tr><tr><td>超音波浴/ブランソン</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>ソニックバスは、サンプルの混合/均質化とC18粒子スラリー</td></tr><tr><td>シリンジポンプ22</td><td></td>の分散に使用されます <td>552222</td><td>マイクロポンプは、パックキャピラリーマイクロリ</td></tr><tr><td>アクターMilli-Q超純水システム</td><td>EMDミリポア</td><td>ZD5311595&nbsp;</td><td>MilliQ水システムは、精製された純水の調製に使用されます</td></tr><tr><td>ピペッター/エッペンドルフ (1,000&nbsp;&マイクロ;l)</td><td>VWR</td><td>53513-410</td><td>ピペッターは、少量のサンプル溶液を測定するために使用されます</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (100&nbsp;&マイクロ;l)</td><td>VWR</td><td>53513-406</td><td>ピペッターは、少量のサンプル溶液を測定するために使用されます</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (10&nbsp;&マイクロ;l)</td><td>VWR</td><td>53513-402</td><td>ピペッターは、少量のサンプル溶液を測定するために使用されます</td></tr><tr><td>溶融シリカキャピラリー(100 & マイクロ;m ID x 360 & マイクロ;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>この毛細管は、マイクロリアクター</td></tr><tr><td>溶融シリカ毛細管(20&nbsp;&マイクロ;m ID x 100 & マイクロ;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP020090</td><td>このキャピラリーは、ESIエミッタ</td></tr>フュー<tr><td>ズドシリカキャピラリー(50&nbsp;&マイクロ;m ID x 360 & マイクロ;m OD)</td><td>Polymicroの技術</td><td>TSP050375</td><td>この毛細管は、サンプルと溶離液をシリンジポンプから毛細管マイクロリアクターに移すために使用されます</td></tr><tr><td>ガラス毛細管クリーバー</td><td>Supelco</td><td>23740-U</td><td>これは、溶融シリカ毛細血管を所望の長さで切断するためのツールです</td></tr><tr><td>接着剤</td><td>折衷的な製品</td><td>E6000クラフト</td><td>この接着剤は、ESIエミッターをキャピラリーマイクロリアクターまたはマイクロ流体チップに固定するために使用されます</td></tr><tr><td>エポキシ接着剤</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td><td>この接着剤は、C18粒子がロードされるマイクロ流体入口穴をシールするために使用されます</td></tr><tr><td>逆相C18粒子(5&nbsp;&マイクロ;m)</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>これらは、タンパク質が吸着されるC18粒子であり、粒子は4&nbsp;mm x 20 cm C18 LC カラム Agilent</td></tr><tr><td>シリンジ/ガラス製 (250 &micro;l)</td><td>Hamilton</td><td>81130-1725RN</td><td>ガラスシリンジは、C18粒子スラリーをキャピラリーマイクロリアクターに装填し、サンプルと溶離液をマイクロリアクターに送るために使用されます</td></tr><tr><td>内部還元PEEKユニオン(1/16インチから1/32インチ)</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>このユニオンは、250 & microを接続するために使用されます。l 5 & MICROを装填するためのマイクロリアクターへのシリンジ;m粒子スラリー</td></tr><tr><td>ステンレス鋼ユニオン(1/16インチ)</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>ステンレス製ユニオンは、ガラスシリンジニードルを注入キャピラリー</td></tr><tr><td>マイクロボリュームPEEKティーコネクタ(1/32インチ</td>)に接続するために使用されます<td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>ピークティーは、サンプル移送キャピラリーをキャピラリーマイクロリアクターに接続するために使用されます;そのサイドアームでは、Ptワイヤー</td></tr><tr><td>ティーコネクタ(軽量)</td>の挿入を可能にしますバル<td>コ</td><td>C-NTXFPK</td> このティーコネクタは、サンプル転送ラインPtワイヤー(0.404mm)VWR 66260-126<td>を介してマイクロ流体チップにESI電圧を印加するために使用されます</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>PtワイヤーはESI生成用の電気接続を提供し、質量分析計ESI電源</td></tr><tr><td>PTFEチューブ(1/16インチ)に接続されていますOD)</td><td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>テフロンチューブは、シリンジ針とステンレス鋼ユニオンとの間の気密接続を可能にするために使用されます&nbsp;</td></tr><tr><td>PEEKチューブ(0.015インチID x 1/16インチOD)</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>Peekチューブは、ステンレス鋼ユニオンと50&nbsp;&マイクロ;m IDトランスファーキャピ</td></tr><tr><td>ラリーPEEKチューブ(0.015インチID x 1/32インチOD)</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>ピークチューブは、溶融シリカキャピラリーとピークティー</td></tr>クリーン<tr><td>カットポリマーチューブカッターValco</td><td>JR-797</td>との間の漏れのない接続を可能にするスリーブとして使用されます <td>この</td><td>カッターは、1/16インチと1/32 'を事前にカットするために使用されます長さが4~5 cmの琥珀色のバイアル(2 ml)の小片で漏れのない接続のためのスリーブとして使用されるピークポリマーチューブ</td></tr><tr><td></td><td>Agilent&nbsp;</td><td>HP-5183-2069</td><td>バイアルは、サンプル溶液とC18粒子スラリーの調製に使用されます&nbsp;</td></tr><tr><td>琥珀色のバイアル(4 ml)</td><td>VWR</td><td>66011-948</td>バイ<td>アルは、サンプル溶液の調製に使用されます</td></tr><tr><td>ポリプロピレンチューブ(15&nbsp;ml)</td><td>フィ</td><td>ッシャー12-565-286D</td><td>バイアルは緩衝液を調製するために使用されます</td></tr><tr><td>シリンダー(100ml)</td><td>VWR</td><td>24710-463</td><td>シリンダーは溶剤の容量を測定するために使用されます</td></tr><tr><td>シリンダー(10ml)</td><td>VWR</td><td>24710-441</td><td>シリンダーは溶剤</td></tr><tr><td>ピペットチップ(1,000 &micro;l)</td><td>VWR</td><td>83007-386</td>ピ<td>ペットチップは、少量のサンプル溶液ピ</td></tr><tr><td>ペットチップ(100&micro;l)</td><td>VWR</td><td>53503-781</td><td>ピペットチップは、少量のサンプル溶液を測定するために使用されます</td></tr><tr><td>ピペットチップ(10&micro;l)</td><td>VWR</td><td>53511-681</td>ピ<td>ペットチップは、少量のサンプル溶液を測定するために使用されます</td></tr><tr><td>ガラス基板</td><td>ナノフィルム</td><td>B270ホワイトクラウン、3 "x 3"</td><td>マイクロチップ製造用ガラス基板です</td></tr><tr><td>オスナットフィッティング(1/16インチ)</td><td>アップチャーチ</td><td>P203X</td><td>このフィッティングは、マイクロ流体チップへのトランスファーキャピラリーの接続に使用されます</td></tr><tr><td>ナノポートアセンブリ</td><td>アップチャーチ</td><td>N-122H</td><td>このフィッティングは、マイクロ流体チップへのトランスファーキャピラリーの接続に使用されます</td></tr><tr><td>タンパク質標準</td><td>シグマ</td><td>マルチプル #</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル、HPLCグレード</td><td>フィ</td><td>ッシャーA955</td><td></td></tr><tr><td>メタノール、HPLCグレード</td><td>フィ</td><td>ッシャーA452</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール、HPLCグレード</td><td>シグマ</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>シグマ</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td>アル<td>ドリッチ</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン、シーケンシンググレード</td><td>プロメガ</td><td>V5111</td><td></td></tr></tbody></table>

フロースルーマイクロリアクターとms検出のためのタンパク質の高速酵素処理

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

質量分析（MS）の大部分は、タンパク質分析方法は、典型的にはトリプシン、検出前に酵素消化工程を含むベース。この工程は、質量分析計測器の有効走査範囲内MW &lt;3,000-4,000ダで一般に、低分子量ペプチドの生成のために必要です。従来のプロトコルは、37ºCでO / N酵素消化を伴います。最近の進歩は、典型的には、例えば 、マイクロ波または高固定化酵素または数分にタンパク質分解消化に必要な時間を短縮する相補的な物理的プロセス（の範囲のマイクロリアクターの使用を含む様々な戦略の開発につながっています圧力）。この研究では、タンパク質の迅速な酵素消化を達成するための任意の実験室で実施することができる簡単で費用効果的なアプローチを記載します。タンパク質（またはタンパク質の混合物）は、C18結合逆相高速PERFに吸着されていますキャピラリーカラムにプリロード液体クロマトグラフィー（HPLC）、シリカ粒子をormance、そして水性緩衝液中のトリプシンを短時間で粒子上に注入されます。オンラインのMS検出を有効にするには、トリプシンペプチドは、MSイオン源で直接増加有機含有量の溶媒系で溶出されています。このアプローチは、高価な固定化酵素粒子の使用を回避し、プロセスを完了するための任意の援助を必要としません。タンパク質消化および完全なサンプルの分析は、それぞれ、2〜3分と約30分未満で達成することができます。

タンパク質分解性消化プロセスの代表的な結果は、上述したマイクロリアクター（ 図1または2）、 表1に提供されて、タンパク質の混合物を同時に行う。テーブルは、特定のタンパク質を同定する独特のペプチド配列を含み、クロス切れ残りの相関スコア（XCORR）（ すなわち 、対応するタンデム質量スペクトルの実験対理論上のマッチの品質を特徴付けるスコア）、数字、ペプチドの荷電状態（Z）、および質量/電荷（プロトン化ペプチドののm / z）。タンパク質レベルでは、テーブルは、UniProtのタンパク質ID、タンパク質、タンパク質スコアおよびタンパク質カバレッジの説明（名前）を提供します。タンパク質分解消化を90秒間行った後、全てのタンパク質は、多数のペプチドによって同定しました。 ために必要な時間全てのペプチドの溶出は、ナノESI最適な動作と互換性の流量300 NL / minで酸性...

エレクトロスプレーイオン化(ESI)質量分析計と組み合わせた社内構築のフロースルートリプシンマイクロリアクターによるタンパク質分解の迅速なプロトコルが提示されます。マイクロリアクターの作製、実験装置、データ取得プロセスについて説明します。

フロースルーマイクロリアクターとMS検出のためのタンパク質の高速酵素処理

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

本プロトコルの全体的な目的は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計を用いたタンパク質同定を可能にするため、タンパク質の迅速な酵素消化を行うフロースルー型トリプシンマイクロリアクターの作製について記述することである。この手法は、単離および精製されたタンパク質のアミノ酸配列を明らかにし、それに続く構造および機能の特性解析を支援するのに役立つ。本プロトコルの主な利点は、迅速で費用対効果が高く、マイクロファブリケーションプラットフォームを利用したワークフローへの統合に適している点にある。まず、ガラスキャピラリーカッターを使用して、太い方のガラスキャピラリー管を7〜8 cmの長さに、細い方を3〜5 cmの長さに切断します。顕微鏡を用いて、両方のキャピラリーの端面がバリなく、きれいに直線的に切断されていることを確認してください。細いキャピラリーを、太いキャピラリーの一方の端に約6 mm挿入します。次に、綿棒を用いてキャピラリーの接合部に少量の接着剤を塗布し、室温で一晩硬化させます。続いて、挿入したキャピラリーを約10～15 mmの長さに切断します。この端がエレクトロスプレーイオン化エミッターとして機能します。外径の大きいキャピラリーの反対側の端を、あらかじめ4～5 cmの長さにカットし、PEEKユニオンに接続した1/32インチのPEEKチューブに挿入します。次に、5 cmの1/16 PTFEチューブをユニオンの反対側の端に挿入し、締め付けます。清潔で乾燥した2 mLのガラスバイアルに、C18粒子を4 mg量り取り、0.5 mLのイソプロパノールを加えます。バイアルを閉じます。超音波洗浄機に入れ、粒子が溶液中に均一に分散するようにソニケーションを行います。次に、250 µL シリンジを使用して、C18スラリーを200 µL 分取します。シリンジを1/16インチのPTFEチューブに挿入し、スラリーを大きなキャピラリー内にゆっくりと注入します。顕微鏡下で観察しながら、粒子が充填され、2〜3mmの粒子充填層が形成されるまで注入を続けます。小さなキャピラリーチューブがキーストーン効果によって、これらの粒子をマイクロリアクター内に保持します。最後に、マイクロリアクターを水とアセトニトリルの50:50混合溶液50 µLで洗浄し、続いて水49 µLにアセトニトリル1 µLを混合した溶液50 µLで洗浄します。キャピラリーマイクロリアクターをPEEKユニオンから取り外し、PEEK-Tに接続します。次に、漏れのない接続を確保するために1/32インチのPEEKスリーブで絶縁した長さ2 cmの白金線を、PEEK-Tのサイドアームに挿入します。長さ0.5 mのサンプル転送キャピラリーをPEEK-Tの反対端に接続します。1/32インチのPEEKスリーブを使用して、漏れのない接続にします。PEEK-TをXYZステージに固定します。そして、エレクトロスプレーイオン化エミッターを質量分析計のインレットキャピラリーから約2 mm離して配置します。次に、白金線を質量分析計のエレクトロスプレーイオン化電源に接続します。また、サンプル転送キャピラリーの反対端を、1/16インチのPEEKスリーブを用いてステンレス製ユニオンに接続し、漏れのない接続を確保します。次に、4〜5 cmの長さの1/16インチPTFEチューブを、ステンレス製ユニオンの反対側に接続します。付属のテキストプロトコルに記載されているタンデムMSデータ収集パラメータを、MS装置を制御するソフトウェアパッケージに入力します。これらをメソッドファイルとして保存し、分析の準備を整えます。LTQ MSシステムには、自作のXYZステージを含む改良型ESIソースが備わっており、これにより質量分析計をさまざまな試料導入手法とインターフェースさせることが可能です。2%アセトニトリルに50 mM重炭酸塩を溶解させた水溶液を250 µLシリンジに充填します。次に、シリンジをマイクロリアクターに接続し、シリンジポンプの下に配置します。分析の準備として、マイクロリアクターを2 µL/minの流速で5分間洗浄します。次に、目的のタンパク質サンプルを250 µLシリンジに充填し、サンプル溶液を2 µL/minの流速で5分間注入します。続いて、5 µMのトリプシン溶液を充填した250 µLシリンジをシリンジポンプに取り付け、マイクロリアクター上に吸着したタンパク質に対し、2 µL/minの流速で1〜3分間注入します。各実験の前に、トリプシン溶液を直前に解凍し、調製することが極めて重要です。これにより、タンパク質分解酵素の活性と、マイクロリアクターの動作pHである約pH 8が維持されます。別の250 µLシリンジに、2%アセトニトリルに0.1%トリフルオロ酢酸を添加した水溶液を満たします。この溶液を用いて、マイクロリアクターを2 µL/minで5分間洗浄し、タンパク質分解プロセスを停止させます。次に、0.1% トリフルオロ酢酸を添加した50% アセトニトリルを満たしたシリンジに切り替え、エレクトロスプレーイオン化電圧を約2000 Vに設定して、MSデータ収集プロセスを開始します。この酸性溶液を用いて、300 nL/minの流速で20〜30分間、マイクロリアクターからタンパク質消化物を溶出させます。付属のテキストプロトコルに記載されているデータ収集パラメータを用いて、質量分析データを取得します。検索エンジンにRAWデータをアップロードし、冗長性を最小限に抑えたタンパク質データベースを用いてLTQ MSのRAWファイルを処理します。次に、親イオンとフラグメントイオンの質量許容誤差をそれぞれ2 daltonおよび1 daltonに設定し、検索には最大2回の切断ミスを許容する完全なトリプシン消化フラグメントのみを使用します。さらに、高信頼度および中信頼度の偽発見率（false discovery rate）をそれぞれ1%および3%に設定し、特定の修飾を意図的に探索する場合を除き、翻訳後修飾は許可しないでください。最後に、データをフィルタリングして高信頼度のペプチスマッチのみを選択します。ここに示されているのは、マイクロリアクター内でタンパク質消化に供されたタンパク質混合物から生成されたトリプシン消化ペプチドで構成される質量スペクトルです。これらのラベルは、最も強度の高いトリプシン消化ペプチドイオンを表しており、その配列と対応するタンパク質識別子を示しています。このマイクロリアクターは、タンパク質の酵素消化を行うための導入しやすい実験セットアップを提供し、30分未満での質量分析および同定を可能にします。この手順を試みる際は、溶液に接触するバイアルや器具の清潔さを維持することが、サンプルの汚染を避けるために極めて重要であることを忘れないでください。本手順に続き、他の質量分析データ収集法を用いることで、生成ペプチドのより詳細な特性解析が可能となり、タンパク質の構造に関するさらなる疑問を解消することができます。本手法の開発後、プロテオノミクス分野の研究者は、タンパク質分析のためのより迅速なプロトコルの開発や、生物学的試料の高スループット探索を可能にする新たなマイクロ分析プラットフォームの開発へと道を切り拓きました。なお、本手法は、25から50本のペプチドを生成する比較的単純なタンパク質混合物の分析に限定されます。これらのペプチドは単純な注入実験によって分析可能であり、MS分析前の液体クロマトグラフィーによる分離は不要です。有機溶媒を取り扱う際は極めて危険を伴うため、本手順の実施中は、裸火を避けるなどの予防策を常に講じてください。

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