胚発生から変性までの椎間板の光学断面化と可視化
July 8th, 2021
光断面化法を用いて椎間板のアヌル線維化における空間的軟骨細胞組織を調べる方法を提示する。
椎間板変性は、高度な障害と痛みにつながります。我々のプロトコルは、形態学的にディスクの発達と変性の変化を調査することを可能にする。緻密なコラーゲンタイプ1ネットワークは、通常、顕微鏡による椎間板の分析を困難にします。
光学的断面化により、異なる組織内の軟骨細胞の3D配置を調べることができます。術中に得られた椎間板またはIVDサンプルをDMEMに2%体積ペニシリンストレプトマイシンで補い、容量で1.2%容量アンホテリシンBを配置し、すぐにコレクションをポストし、IVDサンプルを摂氏4度で保存し、さらなる処理まで摂氏4度で保存します。凍結した場合、ヒトIVDサンプルを室温で解凍し、大学の密度および配向などの顕微鏡特性に基づいてヒトIVD組織の起源を同定する。
ウシ円盤組織を採取するには、その2つの隣接する椎骨を有するIVDからなる運動セグメントを取り、外科用ブレード番号15を使用して、軟骨下骨から牛盤全体を解剖し、ディスクを反転させて中心領域に到達する。軟骨の異なる領域を特定した後、外科用ブレード番号20または22を使用して、ディスク全体から対象領域を切り取ります。20センチメートル未満のクラウンランプ長を持つウシ胚からのIVDは、解剖なしで処理する必要があります。
原稿に記載された組織の脱灰を行った。20ゲージ針がディスク組織に侵入した場合、または顕著な抵抗なしに椎骨に該当する場合は、正常な脱灰を確認してください。PBSの10倍の体積の組織サンプルを、摂氏4度で一晩PBSで正確に行う。
翌日、水溶性埋め込み培地に組織をクライオトームノブに置き、通常はコラーゲンタイプを垂直に切断する軸平面または平面のいずれかが生成される。標準のCryotomeを使用して、組み込み組織を人間のサンプルで70マイクロメートル、牛サンプルで40マイクロメートルの厚さで切り離します。PBSで3回セクションをすすくう前にガラススライドのセクションを収集し、適切な蛍光色素を加え、その後に取り付け媒体を追加し、カバースリップでセクションを覆います。
構造照明装置を開始することにより、蛍光顕微鏡のサンプルホルダーに染色組織部を有するスライドを置き、蛍光フィルターおよび適切な照明による単一視野イメージングを行う。蛍光顕微鏡と互換性のある画像最適化ソフトウェアを使用して、強度と明るさを最適化することによって画像を処理します。セクション全体を視覚化するには、ツールバーパネルから60件の取得設定を開き、モザイクレジスタでモザイク設定を調整することにより、モザイクイメージング技術を使用します。
これを行うには、後で 1 つの概要画像にマージするビューイメージのフィールドの列と行の数を定義するには、設定を押して、個々のタイルのフォーカス補正を調整します。後処理強度と明るさを最適化することによって画像を処理します。空間コンドロシテ組織を解析するには、スタート/ストップボタンでZスタック設定を調整してソフトウェアに組み込まれた3D機能を使用して、Z軸の開始位置と停止位置やスライス距離などのスキャンパラメータを定義します。
個々の細胞パターンを識別し、細胞パターンの定量的分析のために細胞数プラグインを使用して、選択した対象領域のサイズでカウントされたセルを割って細胞密度を計算する。アヌラス内の緻密なコラーゲン繊維ネットワークと柔らかい核を持つIVDのアーキテクチャは、軸および矢状面で撮影されたモザイク画像で認識することができます。モザイク画像の拡大領域では、単一細胞、対、文字列などの軟骨細胞の異なる空間的組織パターンが注目された。
牛環状線維症の異なる発達および成熟段階の研究は、胚性円盤の発達中に細胞密度の継続的な減少を示した。一方、変性の間に成人ヒトディスクでは細胞密度とクラスター形成が増加し、観察された。牛の環状線維症およびウシ核パルポスのIVD発症初期の細胞密度は、出生まで急速に減少した。
エピトームを用いたIVDのチャネルイメージングにより、細胞質や核などの空間パターンの3Dアーキテクチャを可視化することができ、無傷のIVD単発性ならびに軟骨細胞のペアが発見された。一方、退化したアヌラス細胞クラスターが見つかった。最も困難な部分は、その起源に組織を割り当て、切断のために埋め込まれたを修正することです。
これは、信頼できる結果を得るために不可欠です。異なる段階および起源から正しく解剖し、選択されたIVD組織を有することで、ELISAや原子間力顕微鏡などのさらなる生化学的および生力分析によって分析を深めることができる。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この研究は、光学的断層撮影技術を用いて、椎間板（IVD）の繊維輪内における軟骨細胞の空間的組織を調査します。この方法により、異なる発達段階および変性状態における軟骨細胞の3Dアーキテクチャの可視化が可能になります。
主要な研究構成要素
研究領域
- 椎間板内の軟骨細胞の組織
- 椎間板変性が細胞形態に与える影響
- 椎間板の発達生物学
背景
- 椎間板変性は、痛みおよび運動障害の一般的な原因です。
- 密なI型コラーゲンネットワークは、従来の顕微鏡法による分析を複雑にします。
- 椎間板内の細胞配置の理解は、治療戦略に情報を提供します。
使用された方法
- 軟骨細胞の3Dイメージングのための光学的断層撮影
- ヒトおよび牛の椎間板サンプル
- 蛍光顕微鏡法およびモザイクイメージング技術
主要な結果
- 単一細胞、対、細胞クラスターを含む、軟骨細胞の空間的組織の変化が確認されました。
- 細胞密度は牛の胚発生中には減少し、成人のヒトの椎間板では変性中に密度とクラスター形成が増加しました。
- この研究は、IVD組織の取り扱いの複雑さと適切なサンプル準備の重要性を強調しています。
結論
- この結果は、IVD生物学および変性を理解する上での軟骨細胞の空間的配置の重要性を強調しています。
- この方法論は、椎間板の生化学的および生体力学的特性に関するさらなる調査の枠組みを提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding spatial chondrocyte organization in the intervertebral disc provides mechanistic insights into disc degeneration, a key driver of chronic pain and disability. This optical sectioning approach enables high-resolution 3D visualization of cellular patterns, supporting target validation in musculoskeletal disease research. The method aids in de-risking therapeutic hypotheses by linking cellular architecture to disease progression across developmental and degenerative stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chondrocyte spatial arrangements as a biomarker for disc health and degeneration.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating cellular patterns with tissue maturation and disease states.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by identifying cluster formation as a hallmark of advanced degeneration.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative chondrocyte density and spatial distribution data for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible, high-resolution imaging outputs suitable for multi-site validation.
- Scalability: Enables preparation of validated biological systems for downstream biochemical and biomechanical analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges developmental biology observations in bovine models to pathological changes in human degenerative discs.
- Disease-Relevant System: Uses human disc tissue from degeneration patients to ensure clinical relevance.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by linking cellular clustering to degenerative progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling spatial analysis from early development through degeneration, informing target selection and validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on chondrocyte organization and its role in disc pathophysiology.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based readouts for assessing cellular density and structural patterns.
- Analytics: Provides Z-stack and mosaic imaging outputs for 3D morphometric analysis and pattern recognition.
- Translational Research: Connects embryonic bovine findings to adult human degeneration, enhancing preclinical validity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying extracellular matrix-cell interactions in connective tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in disc degeneration by visualizing 3D chondrocyte architecture.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized sectioning, staining, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves portfolio decisions by enabling objective assessment of degenerative biomarkers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on spatial cellular phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, decalcification, and cryosectioning of dense collagenous tissues.
- Dependent on fluorescence microscopy with optical sectioning (Apotome) and mosaic imaging capabilities.
- Necessitates cross-team standardization for tissue orientation, region-of-interest selection, and cell counting.
- Adaptation across model systems must account for species-specific differences in disc anatomy and maturation timing.
- Practical limitations include tissue allocation challenges and embedding artifacts affecting section quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Harvest and Preparation of Intervertebral Disc (IVD) Samples
2:11
Tissue Fixation and Histologic Sectioning
3:00
Microscopic Imaging and Processing
4:11
Cellular Pattern Identification and Density Assessment
4:29
Results: Microscopic Analysis of IVDs Through Various Developmental Stages
5:45
Conclusion
