近接ライゲーションアッセイを用いた異流体せん断応力条件下でのTGFβ/BMP/SMADシグナル伝達の可視化と定量化

このプロトコルは、科学者が異なるせん断応力条件下で転写因子複合体の数を定量的に比較することを可能にし、血管生物学の研究に有益である。このプロトコルの主な利点は、複数の抗体ペアの調査を可能にするマイクロ流体流路の使用であり、それぞれの制御を同時に含む。まず、PBSで作られた0.1%のブタの皮ゼラチンを37°Cで30分間チャネルに加えて、6つのチャンネルスライドをコーティングします。

事前にコード化された6つのチャンネルスライドのゼラチン溶液とシードHuvecsのチャネルを、M199完全培地の30マイクロリットルで1ミリリットル当たり6細胞に2.5倍の密度で空にします。加湿インキュベーターで37°Cで細胞が1時間接着するようにします。各リザーバに警告済みのM199完全培地60マイクロリットルを加えます。

24時間後に培地交換を加湿したインキュベーターで2日間摂氏37度で細胞を培養する。シリコンチューブを流体ユニットに取り付け、事前に警告されたM199完全培地の最低10ミリリットルで貯水池を満たします。流体ユニットをチューブとポンプシステムに接続し、セルなしでプリランを実行して、媒体を平衡化し、残りの空気を取り除きます。

シリアル接続チューブを使用して、6 チャンネルスライドの単一チャネルを接続します。スライドの最初と最後のチャンネルを、流体ユニットに取り付けられたチューブに接続します。細胞を高レベルの応力にさらした場合は、適応段階で完全な応力ステップを上げ、30分あたり平方センチメートルあたり5つのダイン単位でステップを設定します。

チューブ上の束を使用して、流体せん断応力暴露後のポンプからスライドを取り外し、インキュベーター内での媒体のこぼれを避け、氷上の流れスライドを移動します。貯留槽からチューブを取り外しながら、指を使って貯留槽の反対側を閉じ、チャネル内の気泡をトラップしないようにします。流れは氷の上に流れ続け、細胞が存在するチャネルから慎重に貯留から媒体を吸引する。

1つの貯水池にPBSを加え、もう一方の貯水池から慎重に吸引して90マイクロリットルの冷たい無菌PBSでサンプルを洗い、すべてのチャネルについて繰り返します。90マイクロリットルの緩衝された4%PFA溶液をPBSを加えた同じリザーバに加えて細胞を固定し、示されているように他のリザーバから液体を吸引する。6つのチャネルすべてで細胞を固定した後、氷から室温にサンプルを移し、20分間インキュベートします。

PBSを1つの貯留層に加え、すべてのチャネルの他の貯水池から慎重に吸い込んでPBSで細胞を3回洗い、チャネルを乾燥させないように注意してください。クエンチは、PBSで調製した塩化アンモニウム15ミリモルの90マイクロリットルを貯留槽の1つに加えることによってPFAにアクセスする。他の貯蔵所から吸気し、10分間細胞をインキュベートする。

空の貯留槽内のPBSで調製した0.3%トリトンX 100の90マイクロリットルを加えることによって細胞を透過させる。各チャネルに対して他の貯留層から吸引し、10分間インキュベートし、前に示したようにPBSで3回洗浄した。1つの貯蔵所に無菌PLA遮断液の90マイクロリットルで。

各チャネルの反対側から吸気し、加湿室で摂氏37度で1時間インキュベートする。PLA抗体希釈剤および渦液中の一次抗体を添加する。慎重に貯蔵所およびチャネルからのブロッキング溶液を吸引する。

一次抗体溶液の30マイクロリットルを、溶液を加えながらスライドを傾けることで、すぐに空のチャネルに加えます。すべてのチャンネルで繰り返し、加湿室で一晩または37°Cで1時間インキュベートします。希釈マイナスウサギおよびプラスマウスPLAはPLA抗体希釈剤中で1〜5個をプローブする。

90マイクロリットルの洗浄バッファーAを加え、実証したように吸い出すことによって、すべてのチャネルを2回洗浄します。洗浄バッファーを吸引した後、PLAプローブ溶液の30マイクロリットルを加え、加湿チャンバ内でインキュベートする。Dイオン化水でライゲーションバッファーを1~5個希釈し、希釈したライゲーションバッファーでライガス酵素を 1 ~ 40 希釈します。

洗浄バッファーAを洗浄し完全に吸引した後、スライドを傾けながら30マイクロリットルのライゲーション溶液を空のチャネルに加え、加湿チャンバ内でインキュベートする。増幅バッファーを脱イオン水で1~5個希釈し、氷上の希釈増幅バッファーでポリメラーゼ酵素を1~80で希釈します。洗浄バッファーAを洗浄して完全に吸引した後、スライドを傾けながら30マイクロリットルの増幅溶液を空のチャネルに加え、加湿チャンバーにインキュベートする。

洗浄バッファーBでDAPIを1~500まで希釈し、洗浄バッファーBを含むDAPIを90マイクロリットル加えて、核を蒸すため発汗して、全てのチャネルを1回洗浄する。次に、DAPIなしで洗浄バッファBで一度すべてのチャネルを洗浄します。洗浄バッファーBを脱イオン水で1~10に希釈し、90マイクロリットルの希釈洗浄バッファーBですべてのチャネルを1回洗浄し、洗浄バッファーBを吸引した後、すぐに2~3滴の液体取り付け媒体を1つのリザーバに加え、スライドを傾けてすべてのチャネルに実装媒体を分配します。

サンプルは、イメージングまで加湿環境で摂氏4度で保存します。Huvecsは高い、低い完全なストレスにさらされました。低剪断応力は、細胞質ゾルおよび核におけるSMADタンパク質相互作用を増加した。

単一の抗体コントロールは、実験の成功を証明し、非常に少数の信号にノーを示しました。抗体濃度の上昇は細胞当たりのPLA事象の数が多くなったが、高い、低い純粋なストレス暴露細胞間のPLA信号の差は減少した。ブロッキングおよび抗体希釈用の自作バッファーは、市販バッファーの代替として使用できます。

商業的および自作の希釈剤およびブロッキング溶液のPLA事象の定量化は、サイトソリックおよび核領域におけるPLA信号の同じパターンを示した。しかし、市販のソリューションでは、セルあたりのPLAイベントの総数が多かった。SMAD Two/Threeの組み合わせにより、SMAD Four抗体が免疫蛍光実験に適していない場所にSMAD Four抗体が使用されました。

実験と対照条件におけるPLA事象に違いはなく、PLA事象を検出するための正しい抗体組み合わせを選択することの重要性を示す。記載されたプロトコルは、SMADとは異なる転写因子複合体の相互作用を検出するために適応することができ、したがって、アテロームの起こりやすいおよびアテローレの保護条件における遺伝子調節を理解するのに役立つ。