Name: ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶ ショウジョウバエ胚における細胞小器官の動態解析法。蛍光プローブを用いた微小注入と共焦点顕微鏡観察により、脂質滴や小胞体などの細胞骨格依存性トラフィッキングを可視化し、発生生物学の理解を深める。

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Pakinee Phromsiri、Brian Jencik、Jinghong (James) Tang、Roger Whiteに原稿に対するコメントに感謝します。パトリック・オークス、ステファノ・ディ・タリア、ビクトリア・デネケがPIV分析の実施方法に関する専門知識を共有してくれたことに感謝します。この研究は、国立衛生研究所の助成金F31 HD100127(M. D. K.へ)およびR01 GM102155(M. A. W.へ)によって支援された。

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著者らは、開示する利益相反はありません。

ショウジョウバエの胚は、細胞生物学および生物生物学における基本的な問題を研究するための強力で便利なモデルです。その比較的単純さ、強力な遺伝学、および小型サイズは、細胞プロセスと発生の両方をイメージングするための優れたシステムです。ここでは、標準的なマイクロインジェクションプロトコルが、胚におけるFP使用を可能にするように適合されている。このアプローチにより、遺伝的にコードされた蛍光色素を必要とせずに特定の細胞構造の蛍光イメージングが可能になり、多くの遺伝的背景がイメージングに開かれます。複数の色素と戦略的に選択された蛍光タグ付きタンパク質を組み合わせることで、可視光の全スペクトルにまたがるマルチチャンネルライブイメージングを開くことができます。
プロトコルの重要な手順: このプロトコルは、BODIPY 493/503 を使用して LD にラベルを付けます。このアプローチは、他の細胞構造をマークするために容易に適合させることができる。その後の画像解析では、最も重要な要因の1つは、信号対雑音比、すなわち背景信号と比較した色素の輝度です。図2、図3、図4、図5に示すように、リソソーム(LysoTracker Red、1mM)、ならびにミトコンドリア(Mitoview 633、200μM)、ER(ERトラッカーグリーン、10μM)、および微小管(SiRチューブリン、DMSOで200nM)の画像化に成功している。また、卵黄小胞は自己蛍光を発し、UV励起時に青色光を放つ(励起波長として405nmを用いた画像(図6))。他の色素については、培養細胞を生きた染色に必要な色素濃度の100~1,000倍にすることを目指してください。これは、細胞培養培地に希釈されるであろう原液の濃度に類似している。このプロトコルは100 fLの注射を要求し、ショウジョウバエの胚は体積18で約9 nLであるため、これらの色素濃度は平均して細胞培養培地に存在するものの1/100未満の内部胚濃度になります。一時的に、局所濃度は注射部位でより高くなり、これはよく拡散しないFP(すなわち、ミトコンドリア色素およびSiR-チューブリン)に最も関連している。これらのFPについては、推奨される高濃度から開始します。予期せぬ死が観察された場合は、生存と信号強度の間の許容可能な妥協に達するまで、連続して2倍に希釈する。
複数の染料を共注入する場合、両方の染料が同じ溶媒中にあるか、または溶媒と染料の両方が混合物と適合性である必要があります(〜10%を超えるアルコール濃度は推奨されません)。
針の品質は、先端ができるだけ細かくする必要があるため、この手順の成功に不可欠です。さもなければ、注射創傷からの損傷は、その後の胚の発生を損なう可能性がある。市販のニードルプーラーは異なるため、メーカーの提案に従い、所望の形状が達成されるまで複数の引っ張りパラメータを試すことが重要です。品質管理ステップ1.1.3を実行することは、ひびの入った、ギザギザの、または大きな穴の針先を扱うと、成功した注射がより困難または不可能になるため、重要です。
胚は、注射中に追加の量の液体を追加できるように部分的に乾燥させる必要がある。胚が過少乾燥されている場合、針は容易には入らず、針が貫通するか、または溶液が注入されるにつれて細胞質が噴出する。胚が過剰に乾燥すると、胚は収縮して見え、適切に発達しません。正確な乾燥時間は、空気湿度などの局所条件に依存し、日々変化する可能性があります。セッションごとに経験的に決定する必要があります。
微量注射後に生存する胚の能力は、針の品質、適切な乾燥、および注射量を1pL未満(理想的には100fL)に制限することに決定的に依存する。これらのパラメータが最適化されている限り、記載された色素が推奨濃度で注入された場合、有意な毒性は明らかではない。胚が乾燥および注入ステップを生き延びる場合、それらは典型的には、高レベルで細胞化欠陥を引き起こした微小管およびERプローブ(各々のストック濃度の100fL注射)である例外である、生殖帯延長に成功する。試験では、DMSO、水、および2つの混合物を推奨量で注射した場合、生殖帯伸長による胚生存率が約75%以上であった場合、明らかな発達上の欠陥は見つからなかった。1 pLを超える注入量は欠陥を引き起こし、〜4 pLの体積で注入された胚は1時間未満で発達した。したがって、注入量を低く抑える必要があり、色素濃度を高くする必要があります。
一般に、胚の側縁に沿った注射は、それらが最も少ない損傷をもたらすので推奨される。しかしながら、注射部位は、使用されるFPの拡散特性に応じて調整する必要があるかもしれない。BODIPY 493/503およびLysoTrackerは、Lipid Spot 610(LDをマークする別の色素)よりも胚全体に速く拡散するが、SiR-TubulinおよびMitoview 633は胚全体に完全に拡散することがない(注射後7時間という遅い画像化)。したがって、関心のある部位またはその近傍への注射が必要であり得る。前部または後部に注射する場合は、特に細い針が推奨される。
画像取得は、小さな細胞小器官およびすべての細胞骨格成分を光学的に切断および分解するために共焦点顕微鏡法に依存しています。多くの画像の解析を必要とする技術(STORMやPALMなど)は、胚の内容物が動いていて、蛍光色素が光スイッチング用に最適化されていないため、機能しません。落射蛍光顕微鏡は、ほとんどの細胞小器官およびより小さな細胞構造を決定するための横方向および軸方向の分解能を欠いている。これらの理由から、共焦点顕微鏡を使用するか、ライトシート技術を採用することを強くお勧めします。
画像解析の再現性は、一貫性のある画像データに大きく依存します。成功の最大のチャンスのためには、注入技術の最適化と画像取得が必要です。目的の色素、注入部位、胚の年齢、注入量、および取得設定がすべて一貫している技術を確立して実践すると、画像解析のための最も堅牢なデータが生成されます。
メソッドの変更とトラブルシューティング このプロトコルは、粒子画像速度測定を用いて卵割段階の胚におけるLDsのバルクフローを分析するための方法を実証する。同じアプローチを、他の細胞小器官、他の発達段階、および他の分析方法にも使用することができる。例えば、 図2 は、BODIPY 493/503とLysoTracker Redを共注入することによって可視化された、胚発生の合胞期に流れるLDおよび酸性細胞小器官の分析を示す。受精後7時間までの胚におけるLD運動のさらなる成功裏のイメージングが達成された。これらの胚は注射創傷を保持するが、数時間発達することができる。
このプロトコルを使用して収集されたデータは、粒子画像速度測定に使用されてきましたが、他の多くの解析技術が利用可能です。たとえば、ImageJ、Imaris、または手動トラッキングに見られるようなパーティクルトラッキングプログラムを使用して、移動する構造物の速度と方向を取得できます。このような追跡ソフトウェアのほとんどは、平面細胞培養システムからのデータで動作するように構築されており、 ショウジョウバエ の胚のような3D構造に必ずしもうまく適応するとは限らないことに注意してください。さらに、最高品質の粒子追跡データを生成するには、複数のZ平面を画像化する必要があります。これは、画像スタックの取得時間が〜2秒未満の場合に実現可能であるはずです。このベンチマークは、回転ディスクコンフォカル、格子光シート、および最近のレーザースキャン共焦点システムで到達可能である必要があります。しかし、LD、ミトコンドリア、リソソームなどの豊富な細胞小器官に対する粒子追跡の実現可能性は、視野内の正のシグナルの量が現在の追跡方法には高すぎるため、低い。核や卵黄小胞のようなあまり豊富でない構造の追跡が可能であるかもしれない。フロー分析用のPIVは、両方の細胞小器官が自由に動くため、切断段階のLDと酸性細胞小器官に適しています。核、ER、ミトコンドリアなどの細胞小器官は他の細胞構造に縛られているため、自由には動かず、自由運動を想定したソフトウェア解析には適していません。研究者は、目的のオルガネラに最も適した技術を選択する必要があります。
合胞体および細胞芽球の段階では、LDs(および他のいくつかの細胞小器官)は放射状に配向した微小管5に沿って移動する。したがって、単一の微小管が長距離にわたって焦点を合わせている断面図( 図5など)を見つけることができ、2Dでの粒子追跡が可能になります。これらの光学面は胚の奥深くにあるため、全体的な信号強度が低下し、信号対雑音比が低下します。
トラッキング解析では、できるだけ早くイメージングすることで、動きの重要な詳細、ひいては運動性機械の重要な詳細を明らかにすることができます。例えば、脂肪滴運動は、遅い運動 - 短い運動(〜200nm/s;平均移動距離〜100nm)および速い - 長い運動(〜450nm/s;平均移動距離〜1,000nm)の2つの運動状態の混合物である19;したがって、画像が毎秒、またはそれほど頻繁に撮影されない場合、スローショート状態は検出不能になります。しかし、頻繁なイメージングは、蛍光色素分子の漂白および光毒性も誘発する。したがって、イメージング条件は、対処する正確な質問に応じて調整する必要があります。
方法の制限事項 所望される色素に応じて、この方法は、注射溶液の色素溶解度と毒性との間の適合性によって制限され得る。イソプロパノールやエタノールなどのアルコールは、粘度が低いため針内での取り扱いが難しく、細胞成分を損傷して胚を殺すように見えます。
この方法は、注射用の胚を準備するのに30分以上かかるため、胚発生の初期段階を視覚化するのにも適していません。室温では、胚の初期細胞周期はそれぞれわずか〜10分の長さである。したがって、ステップ5.2.3で新たに受精卵を摘んだとしても、最初の数個の細胞周期は、胚がイメージングの準備が整うまでにすでに完了しています。
UV/ブルー範囲の光による照明は、より長い波長の場合よりもかなり光毒性が高い。このような条件下で(例えば、自己蛍光性卵黄小胞に従うこと; 図6)では、イメージング時間を制限するか(時系列の短縮につながる)、またはより低いレーザー出力を使用する(その結果、信号対雑音比が低下する)必要があります。
細胞化後、特定の場所に注入された色素は、多くの細胞膜を横断しなければならないため、拡散が悪くなる傾向があります。これは、後の発達段階における観察領域を制限する。
既存/代替方法に対する本手法の意義 初期胚におけるLDおよび他の脂質含有細胞小器官の動きは、遺伝的にコードされた蛍光色素、標識フリー技術、およびFPの導入によって視覚化することができる。後者は、ビテリン膜12 の透過処理またはここで論じるマイクロインジェクションアプローチによって達成することができる。
遺伝的にコードされた蛍光色素は、そのレベルが通常、胚から胚まで再現性の高い汎用性の高いマーカーです。ただし、FPよりも量子収率が低く、漂白が容易です。通常、それらは1つまたは2つのタグ付きバージョン(GFPまたはmCherryなど)でのみ利用可能であり、同時に画像化できる構造の選択が制限されます。一方、FPはしばしば多種多様に存在します。例えば、UV/ブルースペクトルのオートドットから遠赤色スペクトルのリピドックスおよびリピッドスポット610までの発光スペクトルで、さまざまな脂肪滴特異的色素が利用可能です。FPsはまた、関心のある任意の株に直接適用することができ、したがって、例えば、目的の変異株に所望の細胞小器官マーカーを導入するための株構築を必要としない。この利点は、複数の構造に同時にラベルを付ける場合に特に顕著です。これは、複数の世代にまたがる時間のかかるクロスの代わりに、関連する染料を混合し、同時に導入することによって、1日で達成することができる。最後に、細胞プロセスを薬理学的阻害でプローブする場合、薬物と色素を一緒に導入することができます。
ラベルフリー法は、特定の細胞構造を検出するための非常に強力なアプローチです。例えば、LDsは、第三高調波発生顕微鏡20 またはフェムト秒刺激ラマンロス顕微鏡21によって初期胚において特異的に検出され得る。FPと同様に、これらのアプローチはあらゆる遺伝的背景に適用することができ、漂白を引き起こさないため、より高速な画像取得を可能にする可能性があります。しかし、それらは通常、特定の細胞小器官に限定されているため、それ自体ではマルチプレックスイメージングをサポートしていません。彼らはまた、特殊な顕微鏡を必要とします。
胚に小分子を導入するための2つの一般的な戦略があります。1つは、ここで採用されているマイクロインジェクションアプローチです。もう一つは、ビテリン膜を透過処理するための化学的(テルペン)処理である。後者のアプローチ12 は、マイクロインジェクションよりも関与が少ないが、胚から胚へのより可変性もある。さらに、透過処理後、ビテリン膜によって提供される保護が損なわれ、適切な胚が外部培地にアクセスできるため、生存を維持することがより困難になる。マイクロインジェクションは、透過処理よりも胚発生を頓挫させる可能性がはるかに低い。しかし、多くの胚を同時に監視する必要がある場合、例えば薬物スクリーニングの目的で透過処理が推奨される。細胞構造の動きを追跡し、画像解析に適した再現性のある画像系列を得るためには、マイクロインジェクションが最適な方法です。
特定の研究分野におけるこの方法の重要性と潜在的な応用 ショウジョウバエの胚は、多くの細胞生物学的および発生過程を研究するための重要なモデルシステムである1,5,6。細胞小器官に蛍光タンパク質のタグ付けは、初期胚がどのように発達するか、様々な細胞小器官がどのように輸送するか、およびそのような輸送が発生的および遺伝的にどのように調節されるかの理解に大きく貢献した。しかし、漂白剤に対するそれらの傾向と、複数の細胞小器官が異なる色でラベル付けされた株を生成するという課題は、このアプローチの適用を制限する。マイクロインジェクションによって導入されたFPの使用は、これらの課題の多くを解決し、蛍光標識されたタンパク質と組み合わせることさえできる。この技術は、任意の遺伝的背景における複数の細胞小器官、細胞構造、および細胞骨格成分のイメージングを可能にする。その結果、いくつかの遺伝子型をライブイメージングを介して比較することができ、複数の細胞小器官のトラフィッキングに対する突然変異の影響を決定することが可能になる。
このプロトコルは、 ショウジョウバエのメラノガスターの胚に対するFP注射アプローチを実証するが、原則として、このアプローチは、ショウ ジョウバエの他の種、クリケット22、およびアブラムシ23を含む、マイクロインジェクション技術が確立されている昆虫の卵に適用される。

重要な色素と分子プローブは、特定の細胞構造と細胞小器官を生きた画像にするための強力なツールです。ショウジョウバエの胚では、多くの異なる細胞小器官が細胞骨格駆動の局在1,2,3,4を示すが、卵殻はそれらの多くに不透過性であるため、これらの小分子の適用は困難である。このプロトコルは、細胞小器官の大規模なトラフィッキングを検出するために、マイクロインジェクションを介して生きている胚に蛍光プローブ(FP)を使用する方法を記述している。この手順は、注射液の調製、卵子の採取および胚の調製、マイクロインジェクション、イメージング、および画像解析をカバーする。
細胞小器官の劇的な空間的再配列は、これらの細胞のサイズが大きいため、多くの動物の卵母細胞、卵、および胚で一般的である。 ショウジョウバエ 胚においては、例えば、脂肪滴(LDs)および卵黄小胞が細胞化直前の胚中心に向かって移動する5。この運動は微小管に依存し、2つの細胞小器官の枯渇した胚の周囲全体に〜40μmの領域を残す。初期の卵割段階では、多くの細胞小器官は、胚表面6におけるアクチン−ミオシンベースの収縮によって駆動される細胞質流によって輸送される。多くの種の胚は同様の再配列を示すが、 ショウジョウバエ の胚は、標準的な実験室の「室温」で外部から発達し、比較的透明で、ほとんどの顕微鏡セットアップに収まるほど小さく、強力な遺伝子ツールを使用して操作することができるため、イメージングによってこれらのプロセスに従うのに特に適している。
いくつかの細胞小器官では、これらの構造を特異的に標識する蛍光標識タンパク質が利用可能である。例えば、LSD-2(dPLIN2としても知られる)は、胚においてLDs7を特異的に標的とするタンパク質である。緑色蛍光タンパク質(GFP)とLSD-28との間の融合をコードする誘導性導入遺伝子、または黄色蛍光タンパク質(YFP)が内因性LSD-2遺伝子9,10のコード領域に挿入される遺伝子トラップのいずれかを運ぶフライ株が利用可能である。しかしながら、このアプローチには限界があり、これらの融合タンパク質は量子収率が低く、漂白しやすい傾向がある。さらに、複数の異なる構造を同時に標識することは困難な場合があります:多くの細胞小器官では、現在利用可能な蛍光タグ(GFPまたはmCherry)は1種類しかないため、2つのオルガネラを同時にイメージングするには新しい導入遺伝子または挿入が必要な場合があります。また、互換性のあるタグが利用可能であっても、それらを単一の株に導入するには、時間のかかるクロスが必要になることがあります。また、例えば、2つのオルガネラマーカー、Gal4ドライバー、および誘導性RNAi構築物がすべて同じ母親に存在しなければならない場合、多くの強力な遺伝資源の使用が不便になる。
原理的には、これらの制限は、重要な色素(例えば、リソソームをマークするLysoTracker)、分子プローブ(例えば、微小管を標識するSiR-チューブリン)、および蛍光標識された生体分子(例えば、脂肪酸代謝をプローブするC12 BODIPY)を含むFPの使用によって克服することができる11。培養細胞での使用から、それらは通常、細胞生物学をプロービングするための強力なツールとして十分に検証されています。FPは汎用性が高く、優れた写真特性を有し、蛍光タンパク質と互換性があります。複数の染料を同時に混合して塗布することができ、多くの場合、スペクトルの紫/青および遠赤色領域への分離と小さなストークスシフトの利点により、チャネルのブリードスルーを防ぎます。小さなストークスシフトにより、複数のイメージングチャンネルを同時にキャプチャでき、一度に複数の細胞小器官を追跡できます。最後に、それらは、他の ショウジョウバエ 種の胚または蛍光標識されたタンパク質が利用できない他の昆虫の細胞小器官の標識にも同様に適用することができる。
しかし、これらのFPのほとんどはショウ ジョウバエ の胚の精巧な卵殻を横断することはできません。それは5つの層からなる:機械的損傷を防ぐ3つの外側の絨毛膜層(絨毛膜)と、化学的障壁12を作り出すビテリン膜を囲むワックス状の層。簡単のため、ワックス状層とビテリン膜との組み合わせを、以下で「ビテリン膜」と呼ぶことにする。卵殻を迂回するために、このプロトコルは、ショウ ジョウバエ の胚にFPを導入するために確立された胚マイクロインジェクションアプローチを適応させる。このプロトコルは、卵割段階の胚におけるLDの細胞質流をモニターする方法を記載している。それは注射針および採卵ケージの調製、採卵の過程、および絨毛膜の機械的除去を含む。胚をマイクロインジェクションして画像化する方法と、粒子画像速度測定(PIV、6から適応)を使用してLDのバルクフローを分析する方法について説明します。胚の生存を確保し、イメージングに最適なシステムを作成するためのトラブルシューティングに関するアドバイスを提供します。また、LDと微小管を同時に画像化したり、リソソーム、ミトコンドリア、卵黄小胞体、小胞体(ER)などの他の細胞小器官の研究に適用したりするために、プロトコルをどのように変更できるかについても議論されています。

<table><tbody><tr><td>AUTODO</td><td>abcepta</td><td>SM1000a</td><td>脂質液滴をバイオレット/ブルーに染色</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>ThermoFisher</td><td>D3922</td><td>脂質液滴をグリーンに染色</td></tr><tr><td>乾燥剤ビーズ &ndash;乾燥剤-無水表示ドライライト</td><td>W.A. ハモンド ドライエライト カンパニー</td><td>21001</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡 SteREO DiscoveryV20 透過照明ベース付き</td><td>ツァイス</td><td>4350030000000000</td><td></td></tr><tr><td>両面テープ-永久両面テープ</td><td>スコッチ (3M)</td><td>-</td><td>多くのベンダーが販売</td></tr><tr><td>ER-トラッカー グリーン (BODIPY FL Glibenclamide)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>E34251</td><td>ER/核膜</td></tr><tr><td>Femptotip II</td><td>Eppendorf</td><td>H129354N</td><td>すぐに使える</td></tr><tr><td>ガラス毛細管 -ガラス Thinw w/fil 1.0mm 4インチ</td><td>ワールド精密機器</td><td>TW100F-4</td><td>引っ張る必要があります</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td> <td>-</td><td></td><td>-対物レンズに適した屈折率を購入してください</td></tr><tr><td>ガラススライド -ダブルフロスト顕微鏡スライド 事前にクリーニング</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>ハロカーボンオイル 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ハロカーボンオイル 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898-50ML</td><td></td></tr><tr><td>ヘプタン より環境に優しい代替品 無水、99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654-1L</td><td>ヘプタンは、米国のOSHA</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>Sp5</td>によって有毒と見なされています 多くの<td>異なるタイプの共焦点顕微鏡が機能します。</td></tr><tr><td>LipidSpot 610</td><td>Biotium</td><td>#70069</td><td>遠赤色の脂質液滴を染色</td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>赤のリソソームを染色</td></tr><tr><td>MitoView 633</td><td>Biotium</td><td>#70055</td><td>ミトコンドリアを染色</td></tr><tr><td>ニードルローディングピペットチップ - 20uL マイクロローダーチップ</td><td>Eppendorf</td><td># 5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>P-1000, Next Generation Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>使用される設定は、熱-470、プル-70、速度-60、遅延-90、圧力-200、1x1でのランプ-479です。それらは、加熱の強度と長さ、引っ張る力のタイミング、および力が直線的に加えられるかどうかを指します。これらの条件を利用して、1つの毛細管から先端に微細な開口部を持つ2本の使用可能な針が生成されます。</td></tr><tr><td>SiR-Tubulin</td><td>Cytosketon Inc</td><td>CY-SC014</td><td>スピロクローム製;Cytoskeleton Inc.は北米の販売代理店です。微小管を遠赤色のTransferMan</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>で染色する&nbsp;5178 NK</td><td></td></tr><tr><td>ViaFluor 405</td><td>Biotium</td><td>#70064</td><td>微小管を紫/青で染色</td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

ショウ ジョウバエ の初期胚は、膨大な数の従来型および胚特異的細胞小器官を含む大きな細胞である。胚発生の最初の3時間の間に、これらの細胞小器官は、アクチンベースの細胞質ストリーミングと微小管に沿ったモーター駆動のトラフィッキングによって駆動される劇的な動きを受ける。多数の小型のオルガネラ特異的蛍光プローブ(FP)の開発により、あらゆる遺伝子型における広範囲の異なる脂質含有構造を可視化することが可能になり、遺伝的にコードされた蛍光色素分子を必要とせずにライブイメージングが可能になります。このプロトコルは、ショウ ジョウバエ の胚に重要な色素と分子プローブを注入し、ライブイメージングによる特定の細胞小器官の輸送を監視する方法を示しています。このアプローチは、脂肪滴(LD)を標識し、粒子画像速度測定(PIV)によってそれらのバルク移動に従うことによって実証される。このプロトコルは、リソソーム、ミトコンドリア、卵黄小胞、およびERを含む他の細胞小器官の研究に適した戦略を提供し、微小管に沿った個々のLDの動きを追跡するための戦略を提供する。市販の染料を使用すると、スペクトルの紫/青および遠赤色領域に分離の利点がもたらされます。マイクロインジェクション による 細胞小器官および/または細胞骨格要素の多重共標識により、 ショウジョウバエ のすべての遺伝資源は、蛍光標識されたタンパク質を導入することなく、輸送研究に利用可能である。量子収率が低く、漂白が容易な遺伝的にコードされた蛍光色素とは異なり、利用可能な色素の多くは、高い光子収率で複数のチャネルを迅速かつ同時に捕捉することを可能にする。

注射後、染料は針先が挿入された部位にのみ局在化する。色素は、その拡散特性に応じて注射部位から離れて拡散する。 図1 は、BODIPY 493/503の注入、注入直後(パネル A)および24分後(パネル B)を示す。24分後、色素は胚の長軸のほぼ中点に到達した。
オルガネラの運動性の分析は、色素注入およびタイムラプスイメージングによって達成することができる。図2では、胚をBODIPY 493/503(図2A)およびLysoTracker Red(図2B)と共注入し、それぞれ488および596nmでのレーザー励起を用いて画像化した。次いで、この胚をタイムラプス画像化した(30秒間に1フレーム、5分間解析)。その後、時系列はPIV分析を通して実行され、その出力は図2A,Bの合理化によって示されています。流線は個々の粒子の軌道を表していないが、細胞質の流れは細胞質のその領域内のすべての粒子を分析することから推測されることに注意してください。PIV解析では、2つの独立した細胞構造(LDと酸性細胞小器官)の標識を通して、細胞質が胚の内部に流れ込んでいる胚の中央領域に両方の標識が収束する同様の流れが見つかりました6。
現在利用可能なFPは、他の多くの細胞小器官および細胞構造の標識を可能にする。 図3 は、ERトラッカーグリーン による ERの標識を示しています。ERトラッカーは、核エンベロープの優れた分解能を提供し、主要な細胞周期段階の視覚化を可能にします。ERトラッカーグリーンは、488nm励起を使用して画像化されています。
ミトコンドリアの標識は、テストされたほとんどの染料が最初に入るミトコンドリアに閉じ込められているように見えるため、トリッキーです。一方、色素毒性の徴候は検出されず、細胞化および外胚葉核サイクル15を介して標識されたミトコンドリアに従うことが可能となった。 図4 は、Mitoview 633(励起波長633nm)による注射後数時間後の外胚葉系細胞を示す。
BODIPY、Lysotracker、およびLipidSpotは堅牢で、512 x 512、ライン平均3、1/sから0.1/sのフレームレートで約500以上の画像を取得するために使用できます。
胚芽細胞段階から始まり、LDは極細管に沿って双方向に移動し、反対極性モーターのキネシン-1および細胞質ダイニン5によって駆動される。この動きは、BODIPY 493/503とSiR-Tubulin の両方 を注入することによってLDと微小管を共標識することによって視覚化することができます(図5)。LDは頻繁に移動方向を反転させるため(キネシン-1と細胞質ダイニンを切り替えるため)、取得中のフレームレートが高いほど、LD運動性の重要な詳細をよりよく捉えることができます。
自己蛍光性卵黄小胞のライブイメージングは、いかなる形態の色素注入もなしに可能です(図6)。しかし、自家蛍光は薄暗く、励起レーザーは光毒性である。したがって、自己蛍光性卵黄のライブイメージングは、色素注入に対して低いシグナル対ノイズ比を有する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig01.jpg"> 図1:胚を介したBODIPY 493/503の拡散。 色素を側縁に沿って前端(右上)に向かって注入し、この注入部位から胚内に拡散させ、LDsを標識する。(B)約24分/2核サイクル後、色素は胚の中点を越えて拡散した。スケールバー:100μm。1024 x 1024 フレーム (行平均 4) は 30 秒ごとに取得されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig02.jpg"> 図2:LDおよび酸性細胞小器官の粒子画像速度測定(PIV) 胚にBODIPY 493/503とLysoTracker Redの両方を注射した。(A) BODIPYチャネル。(B) リソトラッカーレッドチャンネル。(A',B') A と Bに示すものを含む10の連続したフレームから生成された2つのチャンネルのPIV分析によって生成された合理化図。 A 'はLDsの流れに対応し、 B' は酸性細胞小器官の流れに対応する。 A 'と B' はどちらも、胚の内容物が視野から胚の中心に流出している中心の左側の合流点を示すことに注意してください。また、BODIPYは、異なる染料が異なる拡散特性を有するため、LysoTrackerよりも拡散していることに注意してください。スケールバー:100μm。1024 x 1024 フレーム (行平均 4) は 30 秒ごとに取得されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig03.jpg"> 図3:ERトラッカーは合胞体核分裂にラベルを付けます。 合胞体芽球胚葉胚をERトラッカーでマイクロインジェクションし、その表面の一部を経時的に画像化した。(A)原子力分割中のスピンドルアセンブリ。(B)同じ分割中の核エンベロープの棄却。(C) その後の相間。(D)次の分裂の開始は、セントロソーム外観(矢印でマークされた円形のERフリー領域の発生)によって示される。徐々に染料の漂白に注意してください。励起波長:488nm。 A:初期フレーム、 B:3分経過、 C:10分経過、 D:13分経過。1024 x 1024 フレーム (行平均 4) は 30 秒ごとに取得されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig04.jpg"> 図4:ミトコンドリアのMitoview 633標識。 胚を合胞胚葉期にMitoview 633で注入し、細胞化後4時間後に画像化した。画像は、生殖帯伸長中の胚の神経外胚葉系細胞を示す。スケールバー:5μm。1024 x 1024 フレーム (行平均 4) は 30 秒ごとに取得されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig05.jpg"> 図5:LDsと微小管の共標識細胞化胚に、BODIPY 493/503(黄色のA,B,C)およびSiRチューブリン(マゼンタA',B',C')の混合物を注入した。A''、B''、C'' はマージされたチャンネルを表示します。パネル A、A'、および A'' は初期フレームを示し、パネル B、B'、および B'' は 5 秒後のフレームを示し、パネル C、C' および C' ' は 10 秒後のフレームを示します。スケールバー:5μm。512 x 512 フレーム (行平均 3) が 2.5 秒ごとに取得されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig06.jpg"> 図6:合胞切断段階中の卵黄小胞自己蛍光のイメージング。(B)8分後、(C)16分後。励起波長:405nm。胚を生き続けるために低い励起強度が用いられた。スケールバー:100μm。1024 x 1024 フレーム (行平均 4) は 30 秒ごとに取得されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足データ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/PIV_analysis_script_Kilwein_Welte_JoVE_2021.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

初期のショウジョウバエの胚では、多くの細胞小器官は運動性である。原則として、それらは特定の蛍光プローブを介して生きたまま画像化することができるが、卵殻は胚への直接適用を妨げる。このプロトコルは、マイクロインジェクションを介してそのようなプローブを導入し、次いで粒子画像速度測定を介してバルクオルガネラ運動を分析する方法を記述している。

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

ショウジョウバエの初期胚では、多くの細胞小器官が大規模な運動を受ける。私たちのプロトコルは、細胞培養用に開発された蛍光色素を使用してこの動きを監視する方法を説明しています。蛍光タンパク質と比較して、市販の蛍光プローブはより明るく、より広い範囲のスペクトルにまたがる。それらは多重コラベリングを可能にし、任意の遺伝的背景で使用することができる。胚を乾燥させるのにどれくらいの時間がかかるかを知るには、注射中に破裂するか、乾燥して発達を止めるかを知るために練習と試行錯誤が必要です。まず、ニードルプーラーのキャピラリーホルダーにキャピラリーを入れ、ウィングナットを使用して固定して、注射針の準備を開始します。キャピラリーの中心を発熱体に合わせます。製造元の指示に従って、ニードルプーラーの適切な設定を選択します。解剖顕微鏡を用いて、精度管理試験を行う。針先を空中に吊り下げた状態で、針をパテに水平に押し込みます。針を蓋で覆い、使用時まで保管してください。マイクロピペットに取り付けられたニードルローディングチップを使用して、気泡を捕捉することなく、1マイクロリットルの注射液をチップに引き込む。手袋を使用して、先端を遠ざけた状態で針を片手で持ち、ローディングチップを挿入します。針先の近くに液体を分配し、ピペットを取り出し、液体が先端に流れるまで針を垂直に保持する。染料の漂白を防ぐために、針先を傷つけずに容器をアルミホイルで覆います。トランスファーピペットまたはマイクロピペッターを使用して、長方形のカバースリップの中央にヘプタン接着剤の小さな滴を置き、蒸発させます。絨毛膜を機械的に除去するために、適切に老化した胚板をハロカーボン油27の薄層で覆い、卵殻を透明にする。プレートをトランス照明で解剖顕微鏡で見て胚段階を確認し、卵割段階の胚を選択します。細かいピンセットを使用して、背側付属器をつかんで所望の段階の胚を拾い上げ、両面テープで覆われた準備されたスライドガラスに移す。胚をテープの上に置き、油の移動を最小限に抑えます。胚を直接突くことなくピンセットの先端の側面でなでることによって、テープの表面を横切って静かに転がします。絨毛膜がテープに付着して亀裂が入るまで胚を転がし続けます。絨毛膜が割れたら、胚を転がして、テープに貼り付けられたままの絨毛膜から分離します。胚をテープよりも接着性の低い絨毛膜の上にロールバックします。胚をピンセットで優しくこすり、ピンセットに付着させて転写します。次に、胚をカバースリップに移し、接着剤に接触させて胚を所定の位置に保持し、ピンセットから分離する。カバースリップ上の胚の向きを調整します。胚の入ったカバースリップを乾燥室に入れ、密封することにより、胚を5〜12分間乾燥させる。カバースリップをチャンバーから取り出し、ハロカーボンオイル700を一滴入れ、さらなる乾燥を防ぐために胚を覆う。解剖範囲でそれらを調べ、胚が適切に乾燥されていればマイクロインジェクションに進みます。4X対物レンズを光路に配置し、顕微鏡のフォーカスノブを使用して、胚を焦点を合わせます。ステージコントロールを使用して、胚を水平方向に視野の中心に移動します。胚を視野の端に保ち、針を下げる準備をするためにパンを離します。同じ焦点面にとどまり、針先を下げ、胚と一緒に視野に見えるようにします。注射液の一部をハロカーボンオイル700に分配して、針が機能していることを確認してください。成功すると、針先の近くの油に溶液の泡が現れます。ステージコントロールを使用して、先端が胚を優しく穿刺してその中に入るまで、胚を針先に向かって動かします。同時に、一過性の透明な斑点が針先の部位に現れ、胚への溶液移入が成功したことを示すまで、注射溶液の流れを開始する。スライドホルダーを使用して、共焦点顕微鏡のカバースリップを固定します。カバースリップは壊れやすいので注意してください。共焦点顕微鏡の落射蛍光機能を使用して胚を40倍の対物レンズで検査し、進行する前に胚中の蛍光4が見えることを確認します。ライブ イメージングでは、同期段階で、画像サイズを 512 x 512 ピクセル、行平均を 3、フレーム レートを 0.1 フレーム/秒に設定します。BODIPY 493 503色素を注入した後、針先が挿入された部位に局在し、次いで注射部位に隣接して拡散した。24分後、色素は胚の中点を越えて拡散した。オルガネラの運動性を、BODIPY 493 503およびLysoTracker Redで胚に注入することによってモニターした。粒子像速度測定解析により、胚内容物が胚の中央領域に収束し、細胞質が胚の内部に流れ込んでいることが明らかになった。ER-Tracker Greenを使用したERのラベリングは、核エンベロープの鮮明な分解能を提供し、主要な細胞周期段階の視覚化を可能にします。胚を胚盤皮段階でMitoView 633で注射し、4時間後に画像化した。画像は、生殖帯伸長中の胚の神経外胚葉系細胞を示す。細胞化胚にBODIPY 493 503とSiRチューブリンの混合物を注入し、これは脂肪滴が微小管に沿って双方向に移動することを示している。液体を注入できるように、胚を部分的に乾燥させなければならない。乾燥が少なすぎると、注入時に胚が漏れ、乾燥が多すぎると胚が死滅します。動く細胞小器官のビデオは、多様な画像解析技術によって特徴付けることができる。粒子追跡は個々の細胞小器官の挙動を明らかにし、粒子イメージング速度測定はバルクフローを明らかにする。

visualizing-cytoskeleton-dependent-trafficking-lipid-containing

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出典:Wagner, K. et al., Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-tagged Proteins. J. Vis. Exp.

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