胚盤胞の開発と移植をモデル化するためのヒト芽球イドのプロトコル

ヒト胚に関する研究は、その入手可能性の低さと倫理的懸念によって制限されているため、初期のヒト発達を忠実に再現する個々のモデルを得ることは、科学的および医学的進歩を支援するであろう。ヒトの発達を予測するこの技術の能力は、発生配列およびペースに従って、胚盤胞細胞決定および形態形成の配列を効果的に再現する能力に依存し、そのようなモデリングは、胚盤胞段階を真に反映する細胞の形成を確実にするであろう。将来的には、ヒト芽球イドは、治療標的を同定し、例えば、体外受精培地を改善するため、または非ホルモン避妊薬を開発するために、前臨床モデリングに貢献するために使用され得る。

手順を実演するのは、香川春信、アロク・ジャバリ、ハイダル・ハイダリ・コエイ、テレサ・マリア・ゾンマー、ジョヴァンニ・セスティーニです。まず、PXGL培地、N2B27基礎培地、洗浄バッファー、PBS、および凝集培地を準備して予温します。ブラストイドを形成するためのhPSC懸濁液からMEFを除外する。

MEF排除のために、6ウェルプレートのウェルに1ミリリットルの0.1%ゼラチンを加えてゼラチンコーティングプレートを作製した。プレートを摂氏37度で30〜90分間インキュベートする。細胞を回収するには、培地を除去し、1ミリメートルのPBSで細胞を洗浄した。

500マイクロリットルの細胞剥離溶液を6ウェルプレートの各ウェルに加え、摂氏37度で5分間インキュベートした。顕微鏡下で細胞をチェックして、コロニーの単一細胞への解離を追跡します。細胞剥離溶液を1ミリリットルの洗浄緩衝液で希釈する。

プレートから細胞を5〜10回穏やかにピペッティングすることによって集める。細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移す。セルを 200 RCF で 4 分間スピンダウンします。

上清を除去し、各ウェル中の細胞を1.5ミリリットルのPXGL培地に再懸濁した。MEF排除のためにゼラチンコーティングプレート上に細胞を播種し、プレートを摂氏37度で60〜90分間インキュベートする。MEF排除のためにナイーブ細胞を播種したら、マイクロウェルからPBSを除去し、マイクロウェルチップごとに200マイクロリットルの基礎N2B27培地でウェルを平衡化し、摂氏37度で60分間インキュベートする。

結合していないナイーブ細胞を含む上清を集める。それを15ミリリットルのチューブに移し、200RCFで4分間細胞をスピンダウンする。培地を廃棄し、細胞を1ミリリットルのN2B27基礎培地に再懸濁した。

セルカウントスライドを使用してセルをカウントします。セルを 200 RCF で 4 分間スピンダウンします。培地を捨て、10マイクロモルのY27632を含むN2B27培地を適量加え、50マイクロリットルあたり30,000細胞の細胞密度を得た。

平衡化したマイクロウェルアレイから培地を取り出し、10マイクロモルのY27632を含む25マイクロリットルのN2B27培地を加える。50マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、細胞がマイクロウェルの底に落ちるように摂氏37度で15分間インキュベートする。次いで、125マイクロリットルのN2B27培地を加え、10マイクロモルのY27632を補充する。

24時間以内に、素朴なhPSCの凝集体がMicroWellチップ上で観察されます。PALY培地を調製することによりブラストイド形成を開始する。37°Cで30分間予温します。

凝集培地を取り出し、200マイクロリットルの予備加温PALY培地をマイクロウェルズに加える。細胞培養プレートを摂氏37度の低酸素インキュベーターに戻します。1日目にメディアの変更を繰り返します。

2日目に、PARY培地を除去し、200マイクロリットルのN2B27培地を添加し、LPAおよび10マイクロモルY27632を補充した。3日目にメディアの変更を繰り返します。完全なブラストイド形成は4日目までに起こる。

前述のように、ブラスト様形成のためのナイーブhPSC細胞懸濁液を調製する。培地を捨て、10マイクロモルのY27632を含むN2B27培地を適量加え、培地100マイクロリットルあたり70個の細胞密度を得た。ウェルの底部に細胞をクラスター化するために、プレートを200RCFで室温で2分間遠心分離する。

プレートを摂氏37度で低酸素培養条件下でインキュベートする。24時間以内に、素朴なhPSCの凝集体が井戸上に観察される。新たに調製し、2回予備温めたPALY培地をウェルに100マイクロリットル加える。

細胞培養プレートを摂氏37度の低酸素インキュベーターに戻します。24時間後、培地の半分を捨て、100マイクロリットルの予備加温PALY培地と交換する。4日目までこの手順を繰り返します。

前述のように対流圏形成のためのナイーブHPSC細胞懸濁液を調製する。24時間後にナイーブHPSCの凝集体が形成されたら、凝集培地をLIFを含まないPALYと交換し、3つのマイクロモルSC144を添加して、初期の対流球を表す対流圏を形成する。成熟した対流球を表す対流球圏を形成するために、凝集培地をPALYと交換し、2つのマイクロモルXMUMP1を補充する。

メディアを毎日リフレッシュします。完全な対流圏形成は4日目までに起こる。細胞状態を評価するには、芽球様および対流圏からのトランスクリプトームデータを、移植後様ヒト栄養芽細胞幹細胞を含む適切な対照と比較する。

PXGLで培養されたナイーブhPSCは、PALY誘導後48〜72時間の間に出現し、96時間以内に直径150〜250マイクロメートルに達した凝集およびキャビテーション構造であった。形態測定パラメータおよび3つの系統の存在に基づいて、誘導効率は70〜80%に達し、トロホスフェールは誘導から96時間以内に50〜60%の効率で形成された。ブラストイド形成は、最適化された誘導条件下で市販の超低付着96ウェルプレートにおいて成功した。

単一細胞RNAシーケンシング技術を用いて、ブラスト様細胞状態をさらに特徴付けた。細胞は、データのクラスタリングおよび視覚化を実行するために使用されるパラメータに関係なく、顕著に再現性よく異なるクラスタリングプロファイルを表示し、3つの胚盤胞系統を自信を持って区別することができた。24〜60時間の間に、PXGL多能性幹細胞は、エピブラストおよび栄養胚葉の類似体を形成する。

次いで、60〜96時間の間に、極性栄養胚葉の類似体、および原始内胚葉の類似体が形成される。これは胚盤胞内の仕様のシーケンスであり、したがってブラストイドは系統仕様の発生シーケンスを反復する。発育の異なる段階で胚から単離された細胞の参照データセットとブラストイドデータセットのマージは、ブラストイド由来の細胞の97%が胚盤胞細胞とクラスター化したが、着床後の胚からの細胞とはクラスター化していないことを示した。

独立した分析により、幹細胞は時間の経過とともに、5日目から7.5日目の間にヒト胚の細胞と転写的に一致する細胞を形成することが確認された。これは確かに人間の胚盤胞が形成される発達段階です。彼らはまた、胚盤内の細胞の95%以上が胚盤胞の3つの細胞系譜と一致するトランスクリプトームを有する一方で、細胞の3%が標的から外れており、移植後の段階と一致していることを確認した。

注目すべきは、我々の初期の2D培養物もオフターゲット細胞の約5%を占めることを観察した。同等の発生段階は、胚盤胞栄養胚葉に対するCDX2、および胚盤胞上芽細胞に対するPRMD14などの特異的マーカーの発現パターンを見ることによっても可視化することができる。初期のPXGL培養の品質は絶対に重要であり、初期凝集体内の細胞数も重要であり、MicroWellsを使用して制御することができます。

24時間後の細胞凝集体の全体的なサイズは、約50〜70マイクロメートルでなければならない。相全胚盤の効率的な形成は、ヒト胚の着床および着床後の発達の過程を研究するための道を開いています。