完全長タンパク質の発現を維持しながらmRNAからの内部翻訳開始部位を除去する
2022年3月16日
本プロトコールは、完全長コネキシン43生成を保持するが、より小さなGJA1-20k内部翻訳アイソフォームの翻訳を防止する、Gja1における単一のM213L変異を記載する。
単一残基置換の難しさは、単一残基の違いにもかかわらず動物を効率的にジェノタイピングすることである。制限酵素を特別に使用すると、典型的なPCRベースのジェノタイピングに1つの迅速で低コストのステップしか追加されません。このプロトコルは、標的配列が制限酵素によって認識される場合、変異点を有する他の任意のマウスモデルに適用することができる(これは通常そうである)。
尾の先端をきれいなハサミで1~3ミリカットし、0.2ミリリットルの8ストリップPCRチューブに移します。原稿に記載されているように尾部サンプルを入れた後、抽出までTマイナス20°Cで、約1週間まで保管してください。チューブあたり100マイクロリットルの組織溶解溶液を加え、よく混合し、続いて卓上小型遠心分離機を用いて2,200倍Gで室温で10秒間スピンダウンした。
テールサンプルが溶液に沈んでいることを確認します。組織溶解、不活性化、および保持のパラメータをプログラミングすることによって、チューブをサーマルサイクラーにセットします。PCRをすぐに実行できない場合は、組織溶解液を摂氏4度で最大1週間保存してください。
サンプルあたり 5 マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、0.75 マイクロリットルの 10 マイクロモルのフォワードプライマーとリバースプライマー、および 7.5 マイクロリットルの PCR マスターミックスを含む PCR 溶液を新しい PCR チューブに準備します。予め調製した組織溶解液1マイクロリットルをPCR溶液に加える。PCR溶液をよく混合し、卓上型ミニ遠心分離機で2,200倍のGで室温で10秒間スピンダウンします。
チューブをプログラムされたサーマルサイクラーにセットします。反応が完了したら、PCR産物を摂氏4度で1~2ヶ月間、またはマイナス20度で約1年間保管してください。ヌクレアーゼを含まない水 7 マイクロリットル、10 倍の強度で 2 マイクロリットルの CutSmart バッファー、および 1 マイクロリットルの NlaIII 制限酵素を含む酵素溶液を調製します。
複数のサンプルがある場合は、各含有量を掛けて混合物を作り、チューブあたり10マイクロリットルをアリコートします。以前に得られた10マイクロリットルのPCR産物を酵素溶液に1本のチューブあたりに加える。よく混ぜて、前に示したように卓上ミニ遠心分離機でスピンダウンします。
チューブをプログラムされたサーマルサイクラーまたはヒートブロックにセットします。低温条件下でのインキュベーション後に製品を保管する。50ミリリットルの単一強度TAEバッファーに0.75グラムのアガロースを加える。
アガロースが完全に溶解するまで電子レンジでアガロースを混ぜて加熱する。それを冷却した後、5マイクロリットルのDNA染色剤を加え、穏やかに混ぜる。25ミリリットルのアガロースゲルをゲルモールドに注ぎ、ゲルを固化させる。
10マイクロリットルの消化PCR産物をウェルにロードする。ゲルを100ボルトで35分間実行します。紫外線下でアガロースゲルを画像化します。
消化されたPCR産物を用いて行われたアガロース電気泳動は、各遺伝子型において異なるサイズのいくつかのバンドをもたらし、それぞれ野生型に2つのバンド、ヘテロ接合型で3つ、およびホモ接合型で1つのバンドをもたらした。胚盤胞分析による試験注入は、ドナーオリゴのマイクロリットル当たり50ナノグラムを注入することにおいて76.9%の成功率をもたらし、同じドナーオリゴのマイクロリットル当たり25ナノグラムを注入することにおいてそれぞれ25%の成功率をもたらした。最後に、エタノール沈殿を用いてドナーオリゴのマイクロリットル当たり50ナノグラムを注入し、50%の成功率で創始者動物を得た。
エタノール沈殿によるオリゴドナーの精製は、高いゲノム編集効率を維持しながら毒性を低下させた。慎重な取り扱いと少量の試薬を添加する上では非常に重要です。それらが正しく追加され、よく混合されていることを確認してください。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本プロトコルでは、Gja1遺伝子に単一のM213L変異を持つ動物のジェノタイピング方法について概説します。この変異は、フルレングスのConnexin43の産生を維持しつつ、より小さいGJA1-20kアイソフォームの翻訳を阻止するものです。本手法では、PCRベースのジェノタイピングに制限酵素を併用することによる効率性とコスト効率の高さを強調しています。
研究の主要構成要素
研究分野
- 遺伝学
- 分子生物学
- 動物モデル
背景
- 遺伝子変異を特定することの重要性
- 単一残基置換における課題
- ジェノタイピングにおける制限酵素の応用
使用した手法
- PCRベースのジェノタイピング
- 点変異を有するマウスモデル
- DNA解析のためのアガロースゲル電気泳動
主要な結果
- 異なるバンドパターンを持つ遺伝子型の同定に成功
- ファウンダー動物の作製において高い成功率を達成
- 記述された遺伝子解析手法の効率性を検証
結論
- 本研究では、マウスモデルにおける変異のジェノタイピングのための効率的なプロトコルを提示しています。
- 本研究は、発生生物学における遺伝学研究に有用な手法を提供します。
よくある質問
産業界における重要性
本プロトコルは、マウスモデルにおける点突然変異の精密なジェノタイピングを可能にし、アイソフォーム特異的なタンパク質発現を解析する必要があるターゲットバリデーション研究を支援します。フルレングスのタンパク質機能を維持しつつ、混同の原因となる切断型アイソフォームを排除することで、初期創薬段階におけるメカニズムのデリスキングを強化します。このアプローチにより、Connexin 43の生物学および関連するギャップ結合経路に関する治療仮説の予測信頼性が向上します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 全長Cx43の機能的寄与をN末端切断アイソフォームから分離することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 大規模コホートにおいて、野生型、ヘテロ接合体、およびホモ接合体変異アレルを区別するための、スケールアップ可能なジェノタイピング手法を提供する。
- 予測的価値： 観察された表現型が全長タンパク質の消失によるものか、あるいはアイソフォーム特異的なメカニズムによるものかを明確にすることで、ポートフォリオの優先順位付け（トリアージ）を支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備状態：ハイスループットスクリーニングのワークフローに適した制限断片パターンを持つDNAサンプルを生成します。
- 定量的な出力：PCR-制限断片長多型分析による対立遺伝子特異的な定量を可能にします。
- 再現性：既存のPCRプロトコルに低コストな単一酵素を添加することで、研究室間でのジェノタイピングを標準化します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：Cx43の輸送およびギャップ結合の形成が関与する心疾患、神経疾患、または腫瘍性疾患の前臨床モデルの構築を容易にします。
- トランスレーショナルな連続性：GJA1-20kを減少させつつ、フルレングスのCx43発現を維持することで、分子遺伝型と表現型のアウトカムを関連付けます。
- リスク調整後の意思決定：in vivoにおけるアイソフォームの発現レベルと機能的リードアウトの相関を可能にし、go/no-go判断基準に情報を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期のターゲットバリデーションから前臨床での有効性試験に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、特にアイソフォーム特異的なタンパク質機能を解明する必要がある場合に有用です。
- 探索生物学： 全長タンパク質の機能と切断されたアイソフォームの活性を区別する遺伝子モデルを可能にし、仮説検定をサポートします。
- スクリーニング： CRISPRの検証や繁殖コロニーの管理などのダウンストリームアプリケーションに使用可能な、アッセイ ready なゲノム DNA を提供します。
- 分析： アガロースゲル上に明確でスコア付け可能なバンドパターンを提供し、シーケンシングなしでの迅速なジェノタイプ判定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： Cx43 の膜局在および細胞間コミュニケーションが主要なメカニズムのエンドポイントとなる前臨床研究を可能にします。
- 企業の再利用： 制限酵素部位を導入または破壊できるあらゆる点変異に適応可能であり、再利用可能なジェノタイピングプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：アイソフォーム特異的な寄与を分離することで、ターゲットバリデーションにおける機序の曖昧さを軽減する。
- 運用的価値：単一のPCR後制限酵素消化ステップにより、スループットを向上させ、サンプルあたりのコストを削減する。
- 戦略的価値：遺伝子型と表現型の関係を明確にすることで、リード最適化における意思決定の信頼性を高める。
- ポートフォリオへの影響：Cx43依存性パスウェイを標的とする候補化合物の、リスク調整済み推進を可能にする。
実施上の考慮事項
- PCRプライマー設計および制限酵素選択に関する分子生物学的な専門知識が必要です。
- サーマルサイクラー、アガロースゲル電気泳動システム、およびUVイメージング装置へのアクセスが必要です。
- 一貫した結果を得るためには、組織溶解およびPCR条件のユーザー間での標準化が不可欠です。
- 代替モデルシステムへの適応は、配列コンテキストおよび制限酵素の適合性に依存します。
- 制限酵素認識部位を変更または作成する変異に限定されます。サイレント変異の場合は、別の戦略が必要になる可能性があります。
