グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

この実験の全体的な目標は、細胞接着の初期段階で発生する区画化された翻訳イベントを視覚化し、定量化することです。この方法は幅広い用途があります。細胞の遊走、接着、または初期の薬物応答を分析する場合など、迅速な特異的翻訳応答がアッセイになる可能性がある場合はいつでも使用します。

この手法の主な利点は、簡単、迅速、および費用対効果が高いことです。必要なのは、ピューロマイシン、ピューロマイシンに対する抗体、および標準的な共焦点スキャンイメージングシステムのみです。はじめに、MRC-5細胞の懸濁液を作ります。

トリプシン処理を使用し、続いて遠心分離を行い、上清を除去し、次に10%のFBSを含むDMEMで40,000細胞/ミリリットルで再懸濁します。.懸濁液を20分間穏やかに回転させてインキュベートし、焦点接着複合体を完全に解離させます。これは非常に重要です。

次に、2つの35ミリメートルガラス底皿に、2ミリリットルのアリコート懸濁液を加え、それらをインキュベートして細胞接着とSiC形成を可能にします。40分後、1つのプレートをシクロヘキシミドで処理し、インキュベーターに戻します。このプレートはネガティブコントロールとして機能します。

55分後、所定の濃度で両方のプレートにピューロマイシンを塗布し、プレートをさらに5分間インキュベートします。1時間の播種と5分間のピューロマイシンの協力を得て、各プレートを2ミリリットルの氷冷PBSで2回洗浄します。次に、細胞をPBS中の1ミリリットルの4パーセントホルムアルデヒドで室温で15分間固定します。

固定後、PBSで細胞を3回洗浄し、PBS中の0.5μLトリトンX-100を500マイクロリットルで室温で20分間細胞を透過します。次に、プレートをPBSで3回洗浄し、次にPBSに500マイクロリットルの1パーセントBSAを塗布します。室温でのインキュベーションをさらに20分間続けます。

余分なBSAを除去するには、PBS中の0.1%Tween-20で細胞を3回洗浄します。次に、細胞を300マイクロリットルの抗ピューロマイシン抗体とインキュベートします。0.1% Tween-20 で 3 回洗浄し、未結合の抗体を除去します。

次に、2つの蛍光色素標識二次抗体の混合物を300マイクロリットル適用して、ピューロミコレートポリペプチドとデファクタムを視覚化します。暗所で室温で1時間細胞をインキュベートします。1時間後、プレートを3回洗浄して未結合の抗体を除去し、次にDAPIを添加した0.1%Tween-20溶液を300マイクロリットル塗布します。

DAPIを室温で5分間細胞内に留まらせます。最後に、細胞をさらに4回洗浄し、純粋なPBSで洗浄して仕上げます。次に、細胞を2ミリリットルのPBSに保存してイメージングします。

市販の共焦点イメージングシステムを使用して、まず、定量のダイナミックレンジを最大化する適切な設定を決定します。定量に焦点を当てるには、ピークサイズの飽和を回避し、濃度が適切に調整されている必要があります。この設定は、レーザー出力の利点とオフセットを慎重に調整することで実現できます。

まず、ズーム倍率とピクセル数を調整して、ピクセルサイズを最適化します。これは、ナイキスト定理に従って行います。次に、スキャン速度を下げ、平均化を使用して信号対雑音比を改善します。

次に、Z 軸に沿った適切な上部と下部の焦点面を手動で決定し、軸方向の解像度を計算してこの距離を 2.3 で割って StepSize を設定します。一般的な結果は 20 から 25 の画像レイヤーです。設定を微調整したら、開口数1.42の60倍Plan Apo油浸対物レンズを使用して、シングルセル全体の共焦点画像を取得します。

フルロフォア信号を定量化および分析するには、まず、画像Jで目的のz平面層に対応する画像を開き、次に描画ツールを使用して、定量化が必要なセルを通る線を作成します。次に、ストレートをダブルクリックしてラインのウィフを変更します。強度値は線の幅全体で平均化されるため、異なる構造からの信号の重なりを避けるために、細い線を使用します。

次に、線に沿って信号密度をプロファイリングします。次に、フルロフォアに対応するチャネル内の同じ線に沿って信号密度を収集するプロセスを繰り返します。値は常に線の向きを使用して順序付けられます。

次に、プロファイルデータをコピーして、分析のためにスプレッドシートに貼り付けます。統計解析に進む前に、対象のすべてのZ平面画像からデータを収集するこのプロセスを繰り返します。あるいは、軸に沿って信号を収集する代わりに、画像の領域から信号を収集することもできます。

まず、幾何学的形状関数を使用して、関心のある領域を選択します。次に、背景がないようにしきい値レベルを調整します。ピクセル強度のヒストグラムで、スライダーを動かして、定量化に含めるピクセルを調整します。

しきい値を設定して、セルの外側にあるすべての赤いピクセルを削除します。次に、バックグラウンド信号ではなく、対象の信号を測定するために必要な測定パラメータを定義します。制限をしきい値および積分密度オプションに切り替えます。

次に、measure コマンドを使用します。これにより、選択した領域の平均グレー値とピクセル数を含む新しいウィンドウが開きます。次に、このプロセスを繰り返し、同じしきい値を適用して、セル全体のシグナル強度を決定します。

次に、このデータを使用して、選択した領域の信号とセル全体の信号の比率を計算します。プルマイシンの組み込みを用いた翻訳事象の正確な測定のために、まず軸方向の測定に最適な条件を評価しました。濃度のスペクトルと5分または10分の治療を比較しました。

MRC-5細胞およびHeLa細胞の許容ピューロマイシン濃度は、Huh-7細胞に必要な濃度よりもわずかに高かった。高ピューロマイシン濃度で10分間処理した細胞は、主に小さなピューロマイコレートポリペプチドを生成しました。より小さなポリペプチドはより迅速に拡散し、望ましくない。

したがって、インキュベーション時間が短いことがより望ましいと考えられました。シクロヘキシミド治療は、効果的で重要なネガティブコントロールです。MRC-5細胞では、シクロヘキシミドによる処理後に弱いピューロマイシンシグナルのみが検出された。

軸方向シグナル定量法を用いて、新たに合成されたタンパク質に対応するピューロミコレート化されたポリペプチドの一般的な局在を、細胞内のさまざまなレベルで評価することができました。細胞全体にわたるシグナルの定量的分布も実現可能でした。どちらの手法でも、画像スタック内のすべてのZ面の信号を定量化して、セル全体の翻訳イベントを正確に評価することが重要でした。

このビデオを見た後、細胞内コンパートメントの翻訳イベントを評価する方法について十分に理解しているはずです。一度習得すれば、このテクニックは適切に実行すれば、1日以内に行うことができます。この手順を考えるとき、ピューロマイシンの濃度とそのインキュベーション時間が重要であることを覚えておくことが重要です。

拡散を制限するためには、インキュベーション時間を制限することが好ましい。また、画像取得タイプの品質が良好な結果を得るために重要であることを認識することも重要です。ホルムアルデヒドでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、化学フードでの作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。