グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳
2017年8月22日
本稿では、可視化し、細胞内コンパートメントのローカライズされた翻訳イベントを定量化する方法について説明します。本稿で提案する手法は基本的な共焦点イメージング システムと試薬が必要です、迅速かつ費用対効果。
この実験の全体的な目標は、細胞接着の初期段階で発生する区画化された翻訳イベントを視覚化し、定量化することです。この方法は幅広い用途があります。細胞の遊走、接着、または初期の薬物応答を分析する場合など、迅速な特異的翻訳応答がアッセイになる可能性がある場合はいつでも使用します。
この手法の主な利点は、簡単、迅速、および費用対効果が高いことです。必要なのは、ピューロマイシン、ピューロマイシンに対する抗体、および標準的な共焦点スキャンイメージングシステムのみです。はじめに、MRC-5細胞の懸濁液を作ります。
トリプシン処理を使用し、続いて遠心分離を行い、上清を除去し、次に10%のFBSを含むDMEMで40,000細胞/ミリリットルで再懸濁します。.懸濁液を20分間穏やかに回転させてインキュベートし、焦点接着複合体を完全に解離させます。これは非常に重要です。
次に、2つの35ミリメートルガラス底皿に、2ミリリットルのアリコート懸濁液を加え、それらをインキュベートして細胞接着とSiC形成を可能にします。40分後、1つのプレートをシクロヘキシミドで処理し、インキュベーターに戻します。このプレートはネガティブコントロールとして機能します。
55分後、所定の濃度で両方のプレートにピューロマイシンを塗布し、プレートをさらに5分間インキュベートします。1時間の播種と5分間のピューロマイシンの協力を得て、各プレートを2ミリリットルの氷冷PBSで2回洗浄します。次に、細胞をPBS中の1ミリリットルの4パーセントホルムアルデヒドで室温で15分間固定します。
固定後、PBSで細胞を3回洗浄し、PBS中の0.5μLトリトンX-100を500マイクロリットルで室温で20分間細胞を透過します。次に、プレートをPBSで3回洗浄し、次にPBSに500マイクロリットルの1パーセントBSAを塗布します。室温でのインキュベーションをさらに20分間続けます。
余分なBSAを除去するには、PBS中の0.1%Tween-20で細胞を3回洗浄します。次に、細胞を300マイクロリットルの抗ピューロマイシン抗体とインキュベートします。0.1% Tween-20 で 3 回洗浄し、未結合の抗体を除去します。
次に、2つの蛍光色素標識二次抗体の混合物を300マイクロリットル適用して、ピューロミコレートポリペプチドとデファクタムを視覚化します。暗所で室温で1時間細胞をインキュベートします。1時間後、プレートを3回洗浄して未結合の抗体を除去し、次にDAPIを添加した0.1%Tween-20溶液を300マイクロリットル塗布します。
DAPIを室温で5分間細胞内に留まらせます。最後に、細胞をさらに4回洗浄し、純粋なPBSで洗浄して仕上げます。次に、細胞を2ミリリットルのPBSに保存してイメージングします。
市販の共焦点イメージングシステムを使用して、まず、定量のダイナミックレンジを最大化する適切な設定を決定します。定量に焦点を当てるには、ピークサイズの飽和を回避し、濃度が適切に調整されている必要があります。この設定は、レーザー出力の利点とオフセットを慎重に調整することで実現できます。
まず、ズーム倍率とピクセル数を調整して、ピクセルサイズを最適化します。これは、ナイキスト定理に従って行います。次に、スキャン速度を下げ、平均化を使用して信号対雑音比を改善します。
次に、Z 軸に沿った適切な上部と下部の焦点面を手動で決定し、軸方向の解像度を計算してこの距離を 2.3 で割って StepSize を設定します。一般的な結果は 20 から 25 の画像レイヤーです。設定を微調整したら、開口数1.42の60倍Plan Apo油浸対物レンズを使用して、シングルセル全体の共焦点画像を取得します。
フルロフォア信号を定量化および分析するには、まず、画像Jで目的のz平面層に対応する画像を開き、次に描画ツールを使用して、定量化が必要なセルを通る線を作成します。次に、ストレートをダブルクリックしてラインのウィフを変更します。強度値は線の幅全体で平均化されるため、異なる構造からの信号の重なりを避けるために、細い線を使用します。
次に、線に沿って信号密度をプロファイリングします。次に、フルロフォアに対応するチャネル内の同じ線に沿って信号密度を収集するプロセスを繰り返します。値は常に線の向きを使用して順序付けられます。
次に、プロファイルデータをコピーして、分析のためにスプレッドシートに貼り付けます。統計解析に進む前に、対象のすべてのZ平面画像からデータを収集するこのプロセスを繰り返します。あるいは、軸に沿って信号を収集する代わりに、画像の領域から信号を収集することもできます。
まず、幾何学的形状関数を使用して、関心のある領域を選択します。次に、背景がないようにしきい値レベルを調整します。ピクセル強度のヒストグラムで、スライダーを動かして、定量化に含めるピクセルを調整します。
しきい値を設定して、セルの外側にあるすべての赤いピクセルを削除します。次に、バックグラウンド信号ではなく、対象の信号を測定するために必要な測定パラメータを定義します。制限をしきい値および積分密度オプションに切り替えます。
次に、measure コマンドを使用します。これにより、選択した領域の平均グレー値とピクセル数を含む新しいウィンドウが開きます。次に、このプロセスを繰り返し、同じしきい値を適用して、セル全体のシグナル強度を決定します。
次に、このデータを使用して、選択した領域の信号とセル全体の信号の比率を計算します。プルマイシンの組み込みを用いた翻訳事象の正確な測定のために、まず軸方向の測定に最適な条件を評価しました。濃度のスペクトルと5分または10分の治療を比較しました。
MRC-5細胞およびHeLa細胞の許容ピューロマイシン濃度は、Huh-7細胞に必要な濃度よりもわずかに高かった。高ピューロマイシン濃度で10分間処理した細胞は、主に小さなピューロマイコレートポリペプチドを生成しました。より小さなポリペプチドはより迅速に拡散し、望ましくない。
したがって、インキュベーション時間が短いことがより望ましいと考えられました。シクロヘキシミド治療は、効果的で重要なネガティブコントロールです。MRC-5細胞では、シクロヘキシミドによる処理後に弱いピューロマイシンシグナルのみが検出された。
軸方向シグナル定量法を用いて、新たに合成されたタンパク質に対応するピューロミコレート化されたポリペプチドの一般的な局在を、細胞内のさまざまなレベルで評価することができました。細胞全体にわたるシグナルの定量的分布も実現可能でした。どちらの手法でも、画像スタック内のすべてのZ面の信号を定量化して、セル全体の翻訳イベントを正確に評価することが重要でした。
このビデオを見た後、細胞内コンパートメントの翻訳イベントを評価する方法について十分に理解しているはずです。一度習得すれば、このテクニックは適切に実行すれば、1日以内に行うことができます。この手順を考えるとき、ピューロマイシンの濃度とそのインキュベーション時間が重要であることを覚えておくことが重要です。
拡散を制限するためには、インキュベーション時間を制限することが好ましい。また、画像取得タイプの品質が良好な結果を得るために重要であることを認識することも重要です。ホルムアルデヒドでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、化学フードでの作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
本稿では、細胞接着時における細胞内コンパートメントでの局所的な翻訳イベントを可視化および定量化する方法について述べる。このアプローチは迅速かつ費用対効果が高く、基本的な共焦点イメージングシステムと特定の試薬のみで実施可能である。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- イメージング技術
背景
- 局所的な翻訳イベントの解析は、細胞プロセスを理解する上で極めて重要です。
- 細胞接着は、さまざまな生物学的機能における重要なステップです。
- 既存の手法では、効率性や簡便さが不足している場合があります。
- 本研究は、簡便な代替手法を提供することを目的としています。
研究目的
- 区画化された翻訳イベントを可視化すること。
- 細胞接着時の翻訳を定量化すること。
- 簡便でコスト効率の高い手法を開発すること。
使用方法
- ピューロマイシンを用いて、新たに合成されたタンパク質を標識します。
- ピューロマイシンに対する抗体を適用します。
- 標準的な共焦点イメージングシステムを利用します。
- 実験用にMRC-5細胞懸濁液を調製します。
主な結果
- この手法により、翻訳イベントの迅速な評価が可能になります。
- 細胞の遊走および接着の解析における有効性が示されています。
- 結果から、局在化した翻訳が明確に視覚化されていることがわかります。
- この技術は、初期の薬物反応研究に適用可能です。
結論
- この手法は、細胞内における翻訳を研究するための実用的なアプローチを提供します。
- これにより、接着時における細胞応答の理解が深まります。
- 本技術は、さまざまな研究アプリケーションに有用です。
よくある質問
産業界における重要性
本手法により、初期の細胞応答における区画化されたタンパク質合成を迅速かつ費用効率よく可視化することができ、接着、遊走、および薬剤応答パスウェイにおける標的バリデーションを支援します。細胞内コンパートメントにおける局所的な翻訳を定量化することで、初期段階の創薬プログラムにおけるメカニズム的なリスク低減を可能にします。このアプローチには標準的な共焦点イメージングとピューロマイシンを用いた標識のみが必要であり、フェノタイプスクリーニングキャンペーンにおけるハイスループットな仮説検証への適用が可能です。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： 細胞接着時における特定の細胞内構造でのde novoタンパク質合成を可視化することにより、治療仮説を検証できる。
- 運用的価値： 刺激に応じた翻訳ダイナミクスを直接測定することで、機能的なターゲットバリデーションを可能にする。
- 予測的価値： 疾患に関連する系において翻訳活性を調節する化合物を特定することで、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備： 基線となる翻訳指標を確立することで、後続の化合物スクリーニングに向けたバリデート済み生物学的システムを準備する。
- 定量的出力： 空間的に分解された信号強度データを生成し、異なる条件下で標準化された再現性のある読み取りを可能にする。
- スケーラビリティ： 共焦点イメージングプラットフォームと互換性があり、付着細胞モデルにおける翻訳イベントのマルチプレックス解析が可能である。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患との関連性：局在化翻訳を、線維化および創傷治癒の適応に関連する器官形成および分化プロセスへと結びつけます。
- トランスレーショナルな連続性：刺激によるタンパク質合成の変化を定量化することで、基礎研究での観察結果と前臨床検証を橋渡しします。
- リスク調整後の意思決定：翻訳パターンを接着および遊走アッセイにおける表現型の結果と相関させることで、Go/No-go判定基準に情報を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲット仮説の検証からリード化合物の特定に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、初期の化合物評価およびメカニズムの追究に資する定量的なトランスレーションデータを提供します。
- 探索生物学： 細胞活性化時に新しいタンパク質がいつ、どこで合成されるかを明らかにすることで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 化合物ライブラリと相関させることが可能な、アッセイにそのまま利用できる翻訳効率の定量的リードアウトを提供します。
- 分析： Z平面および細胞内領域における翻訳活性の比較を可能にし、パスウェイの関与を評価します。
- トランスレーショナルリサーチ： 測定可能なタンパク質合成ダイナミクスを通じて、初期の接着イベントと下流の表現型変化を関連付けます。
- エンタープライズ再利用： 複数の疾患モデルやスクリーニングキャンペーンにわたる翻訳応答をモニタリングするための、再利用可能なプラットフォームとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 部位特異的なタンパク質合成イベントを直接可視化することで、メカニズム上の不確実性を低減します。
- 運用的価値： 規定のピューロマイシンインキュベーション時間および共焦点顕微鏡による取得パラメータを通じて、標準化を保証します。
- 戦略的価値： 特殊な装置なしでターゲットエンゲージメントを迅速に評価できるため、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： サブセルラーコンパートメントにおける翻訳プログラムを変化させる化合物を特定することで、リスク調整後の優先順位付けを促進します。
実施上の検討事項
- 免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡の最適化に関する専門知識が必要です。
- ピューロマイシン、抗ピューロマイシン抗体、および標準的な共焦点イメージングシステムへのアクセスが前提となります。
- チーム間での固定、透過処理、および抗体インキュベーションプロトコルの標準化が必要です。
- 異なる細胞株に適応させる場合、ポリペプチドの拡散を制限するために、ピューロマイシンの濃度とインキュベーション時間の最適化が必要になることがあります。
- 実用上の制限として、ピューロマイシンへの曝露時間が長くなると、新生ポリペプチドの急速な拡散により信号が減衰することが挙げられます。
