Name: グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学ぶ、細胞接着初期における局在翻訳イベントを可視化・定量化する方法。プルロマイシン標識と標準的な共焦点顕微鏡システムを用い、MRC-5細胞で迅速かつ低コストに翻訳応答を解析できます。

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原稿の批判的読解ありがとう博士ラシッド Mazroui (ラヴァル大学、ケベック、カナダ)。その技術支援研究センター細胞イメージング ユニットに感謝いたします。M. é Huot はフォン ・ デ ・ ジュニア 1 研究学者 Recherche du ケベック州健康 (周波数 S)。この作品は、(許可番号機構、M. É とモップ 286437 健康研究のカナダの協会によって支えられました。Huot)。

1 です。 Puromycilation 条件の定量 注: この手法 MRC 5 セル接着プロセス 5 中にローカライズされた翻訳を評価する方法について説明します。Puromycilation は、任意のセルで行うことができます、処理条件が各セルライン ピューロマイシン濃度と目的の面で同一ではないので、使用する特定のセル行の puromycilation 条件を最適化することが重要です。インキュベーション時間。ピューロマイシン濃度の異なるインキュベーション時間の増加で処理した 3 例のセル行 (すなわち、 hela 細胞、MRC-5、およびホ-7)、これらの条件を定義する方法を表示する ( 図 1).
<ol><li>成長の適切な 0.5 mL で 24 ウェル プレート内のセルの同じ数字を培 16 h テストの前に完了します。種 30,000 MRC 5 セル、50,000 の HeLa 細胞あるいはウェルあたり 50,000 の許 7 セル。60-70% 合流点 (図 1 a) を超えないようにすることを確認します</li>。
	<li>準備 6 ピューロマイシン (0、5、10、15、20、および 30 μ g/mL) の濃度の増加との完全な細胞培養液 1.5 ml チューブします。37 ° C であらかじめ暖かい</li>
	<li>は、ピューロマイシン媒体 (の準備ステップ 1.2) の各濃度転送から 0.5 mL のそれぞれは 6 の新しいチューブにチューブ、最終 50 μ G/ml の濃度ですべて 6 新しいチューブ シクロヘキシミドを追加します。37 ° C であらかじめ暖かい</li>
	<li>は、0.5 ml の完全培地 (行 1 および 2) の媒体を変更します。3 行目、シクロヘキシミド ( 図 1 b) の 50 μ g/mL を添加した完全な培養液 0.5 mL を追加します 。
	注: シクロヘキシミド治療法は、翻訳伸長をブロックする機能のための蛋白質の puromycilation の最高のネガティブ コントロールとして確立されています。シクロヘキシミド処理が puromycilated 蛋白質信号 5 , 18 の損失につながるピューロマイシン定款翻訳伸長する必要があるためです</li>。
	<li>37 ° c (5% CO 2) 15 分間インキュベートします</li>。
	<li>は、それぞれ列 A、B、C、D、E、および F の最終濃度 0、2.5、5、7.5、10、15 μ G/ml を取得する 2 番目の行に手順 1.2 で調製したピューロマイシン培地の 0.5 mL を追加します。同時にシクロヘキシミド添加培地に (手順 1.3) ( 図 1) の 3 番目の行の後 0.5 mL を追加します</li>。
	<li>37 ° C (5% CO 2) で 5 分間インキュベートします</li>。
	<li>0.0、2.5、5、7.5、10、15 μ G/ml ( 図 1) の最終濃度を取得する最初の行にステップ 1.2 で調製したピューロマイシン培地の 0.5 mL 追加します</li>。
	<li>37 ° C (5% CO 2) で 5 分間インキュベートします</li>。
	<li>は、それぞれ洗ってリン酸緩衝の冷たい 1 X ml の 1 行 1 に 3 生理食塩水 (PBS) 添加後 5 分 (二度洗い) の最初の行の井戸を後からも。1 X Laemmli バッファーを 75 μ l 添加 (4% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、4 %2-メルカプトエタノール、0.120 M トリス塩酸 pH 6.8, 0.004% ブロモフェノールの青、および 10% グリセロール) 条件ごとに全体セル lysates を取得する</li>。
	<li>実行 10 %sds ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) ピューロマイシン定款を評価するために作製した試料の 1/3 を使用しています。
	<ol><li>1:25,000、一次抗体の孵化のバッファー (2% ウシ血清アルブミン (BSA))、430 mM の NaCl、10 mM Tris pH 7.4 では、0.01% の比率で希釈した反ピューロマイシン抗体 (12 D 10) を用いたウェスタンブロッティング ピューロマイシン定款のレベルを決定します。アジ化ナトリウム). 
		注: 手順 1 で説明した別のセル行の抽出に対応する代表的なイメージは、 図 2 の例として表示されます</li>。
	</ol></li></ol> 2。Cellulo でローカライズ翻訳可視化 注: ここで説明する手法は、接着プロセス 5 中に Sic MRC 5 細胞内のローカライズされた翻訳を評価するために使用されました。手順 2.1 で説明したのと同じ方法で他のセルの行を使用できます MRC 5 細胞はここで使われますが、.
<ol><li>セル準備。
	ハンクの 0.25% トリプシン/2.21 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を使用して <ol><li>デタッチ MRC 5 セル &#39; s バランスの取れた塩ソリューション (HBSS)。15 mL コニカル遠心管中 (200 x g で 5 分) 遠心分離によって細胞をペレットし、ダルベッコのそれらを停止 &#39; s 修正イーグル培 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) 40,000 セル/ml でカウントを納めたカウント後</li>。
		<li>孵化緩やかな回転の懸濁液でそれらを維持するために 20 分間チューブ回転子を使用して下の 37 ° C で浮遊細胞 。
		注: この手順は焦点接着複合体の完全な分離を可能にするために重要です</li>。
		<li>中断された MRC 5 細胞 (40,000 セル/mL) 2 つの 35 mm ガラス底料理のプレート 2 mL。Puromycilation 試金のための最初の 35 mm ガラス底皿を使用 (手順 2.1.5 参照)、陰性対照として 2 番目を使用 (手順 2.1.6 参照).</li>
		<li>の細胞接着と SIC の形成を許可する 55 分の 37 ° c (5% CO 2) 細胞を維持します</li>。
		<li>以前セクション 1 で定義された濃度を使用して 35 mm ガラス底培養皿 (法) におけるメディア追加ピューロマイシン。MRC 5 細胞を治療するために 37 ° C (5% CO 2) で 5 分間 10 μ G/ml ピューロマイシンを使用します</li>。
		<li>ネガティブ コントロールとしてシクロヘキシミドを 2 番目の 35 mm ガラス底皿 40 分に 50 μ G/ml シクロヘキシミド ( 図 2 b) とそれらを扱う前に細胞を播種後追加。シクロヘキシミド添加後 15 分でピューロマイシンをステップ 2.1.5 (例えば、 使用 10 μ G/ml MRC 5 の 37 ° c (5% CO 2) 5 分後) のように同じ濃度と潜伏期間を使用してメディアに追加します</li>。
		<li>洗って冷たい 2 mL 2 回、各プレート 1 X の PBS と 1 ml 室温 (RT) で 15 分の 4% のホルムアルデヒド (1 × PBS で希釈) のセルを修復する 。
		注意: パラホルムアルデヒドされる必要があります厳密に化学フード</li>。
	</ol></li> <li>染色。
	<ol><li>パラホルムアルデヒドの固定、次 3 回 2 mL の 1x PBS で洗浄し、500 μ L の PBS-TritonX-100 (0.5%) でセルを permeabilize RT で 20 分間インキュベートします</li>。
		<li>非特異的な抗体の結合を防ぐためには、500 μ L の PBS でサンプルをブロック &#8211; 室温に 20 分間 BSA (1%)</li>
		<li>2 ml の PBS Tween20 (0.1%) の 3 倍を洗って室温 1 時間 1x PBS で希釈反ピューロマイシン抗体 (12 D 10) 1:12,500 の 300 μ L でインキュベート</li>
		<li>2 ml の PBS Tween20 (0.1%) の 3 倍を洗浄し、抗マウス IgG、fluorophore に共役の 300 μ L と孵化 (ここ、488 nm) 電子共役系と puromycilated ポリペプチドを視覚化する PBS で希釈別 fluorophore に (ここ、555 nm)F-アクチンを視覚化します。室温 1 時間孵化させなさい</li>
		<li>PBS Tween20 (0.1%) 2 mL で 3 回洗浄し、5 分間インキュベーション RT で 300 μ L の PBS Tween20 (0.1%) の 1 μ g/mL 4 を添加した &#39;、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
		<li>は、PBS Tween20 (0.1%) 2 mL で 3 回洗浄し、2 mL の 1x PBS で洗浄します。セルのイメージ取得中に 2 ml の 1x PBS のサンプルを維持することで乾燥を防止します</li>。
	</ol></li></ol> 3。蛍光画像の取得 注: 次の方法は、市販の共焦点イメージング システムで使用できます。
定量化のダイナミック レンジを最大化する各 fluorophore の <ol><li>を決定する適切な設定します 。
	注: 代表的な定量化は、ピクセルの彩度は避け、信号しきい値を正しく調整する場合にだけ取得することができます。これらの設定は、慎重に高電圧 (HV) のレーザー出力を調整することによって達成を得るため、オフセット。
	<ol><li>調整、ズーム ファクター (5 X) とピクセル サイズを最適化する (512 x 512) ピクセル数 。
		注: これがナイキスト定理によると、少なくとも 2.3 倍未満の光学解像度をする必要があります</li>。
		<li>スキャン スピード (12.5 20 μ s/ピクセル) が低下して上記の設定によると信号対雑音比を改善するために (2-3 回) の平均を使用します</li>。
	</ol></li> <li>手動で適切なトップを決定し、最適なステップ サイズ (0.4 μ m/スライス) の z 軸に沿って焦点面を下します 。
	注: ステップ サイズ面は、ナイキスト定理によると、2.3 で割った値軸の解像度によって決定されます。通常、20-25 層、付着性のセルのセル全体の深さをカバーするために必要な</li>。
	<li>、60 X Plan Apo 油浸対物レンズ (1.42 開口) と全体の単一細胞の共焦点画像を取得します</li>。
</ol> 4。蛍光画像の定量化 <ol><li>の濃縮定量。
	<ol><li>ImageJ ソフトウェア (フリーウェア http://fiji.sc で利用可能) を使用して取得したセル データ ファイルから興味を持つ z 平面層に対応するイメージを開きます</li>。
		<li>は、線の描画ツールを使用して線を描く (ツール バー &#8594; ストレート) 定量化が必要なセルの領域を。ダブルクリックすると線幅を変更 &#34; ストレート; &#34; ( 図 3 の 8 で設定) の行の幅を平均照度値がなります 。
		注: 薄くラインが異なる構造から信号の重なりを避けるために好ましいです</li>。
		行を正しく設定すると後の <li>プロファイル決定の軸に沿って信号密度 (メニュー バー &#8594; 分析 &#8594; プロファイルのプロット). 
		注: 新しいウィンドウが開きます選択した z 平面断面の線に沿って選択したチャネル (特定 fluorophore) の各ピクセルの輝度に対応するプロファイルを示しています。
		<ol><li>使用蛍光に対応する各チャンネル (488 568、405 の 1 つ 1 つの すなわち、 1 つ数量) の処理を繰り返します 。
			注: 信号強度の値は、常に並べ替えられます次の描画の線の向き.</li>
		</ol></li> <li>選択 z 平面レイヤーの数量に対応するプロファイルの各ピクセルの数値のグレースケール値を得るためには、プロファイル データをコピー (イメージ ウィンドウのメニュー バー &#8594; コピー) し、表計算ソフトに貼り付けます</li>。
		取得した共焦点画像各 z 平面断面と定量化が必要な各チャネルのための <li>繰り返し手順 4.1.1-4.1.4. 
		注: 各 z 平面レイヤーの線に沿って各ピクセルの合計値を計算することによって信号の特別な濃縮活動の一般的な評価を取得する別の z 平面レイヤーの定量化をプールできます。描画される線の平均値に含まれる z 平面レイヤーごとに同一である場合、このタイプのプールを達成のみことができます</li>。
		<li>、層の大規模な数と異なるチャンネルの全細胞の定量化のための代替方法として StackprofileData に呼び出されるマクロを使用して、(補足ファイル を参照してください). 
		注: このマクロは https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt で自由にアクセスできる、次のように使用することができます: <ol><li>のテキスト ファイルにマクロを貼り付け、それを保存</li>
			<li>のすべてのセルの共焦点のレイヤーが含まれているイメージ ファイルを開きます</li>。
			<li>は、線を描画、4.1.2 の手順に従って、マクロをインポートする新しいウィンドウが開きます (メニュー バー &#8594; プラグイン &#8594; マクロ &#8594; を実行)、StackprofileData マクロに対応する以前に保存したテキスト ファイルを選択し、クリックして、&#34; 開く &#34; 。
			注: 次のマクロ輸入新しいウィンドウという &#34; 結果 &#34; が開き、すべて決定の軸に沿って定量化の z 平面レイヤーごとに表示され、チャネルの画像ファイル内に存在します</li>。
			<li>は、各チャンネルのデータをコピー (メニュー バー &#8594; 編集 &#8594; コピー) 信号の数量に対応するプロファイルのグラフィカルな表現を取得します。任意の表計算ソフトに貼り付けること。各 z 平面レイヤーの線に沿って各ピクセルの各チャンネルの合計値を計算します。 図 3 のようなグラフィカルな表現を作成するこれらの値を使用します</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>指定携帯電話エリアまたはボリュームで信号の定量化。
	<ol><li>ImageJ ソフトウェアで画像ファイルを開きます</li>。
		<li>は、幾何学的なフォーム機能を使用して関心のある領域を示す領域を描画 (ツール バー &#8594; &#34; 四角形、&#34; &#34; オーバル、&#34; または &#34; ポリゴン &#34;). 
		注: 定量化値がフォームに描画に対応する領域の決定されます</li>。
		<li>は、任意のバック グラウンド信号を避けるためにしきい値レベルを調整 (メニュー バー &#8594; イメージ調整 &#8594; のしきい値); ヒストグラム形式でピクセル強度を表す新しいウィンドウが表示されます。スライダーを使用して定量化のピクセルを除外する値を変更します。定量化にピクセルが赤で強調表示されますが表示されます赤いピクセルが細胞外に排除するしきい値を選択します</li>。
		<li>バック グラウンド信号なしの選択した領域内の画素信号を定量化する測定パラメーターを定義 (メニュー バー &#8594; 分析 &#8594; 設定測定)、確認してくださいと、&#34; のしきい値の制限 &#34; と &#34; 集積密度&#34; ボックス</li>。
		<li>は、選択した領域の定量的な値を測定 (メニュー バー &#8594; 分析 &#8594; メジャー). 
		注: 信号強度の定量化がの下で新しいウィンドウで表示されます、&#34; IntDen &#34; id は、製品の平均グレー値の選択した領域内のピクセルの数を表します</li>。
		<li>は、幾何学的なフォームを使用してセル全体を含む領域を描画 (ツール バー &#8594; &#34; 四角形、&#34; &#34; オーバル、&#34; または &#34; ポリゴン &#34;)、全信号に対応する値を取得する 4.2.3-4.2.5 を手順に進みます。関心のある領域内の信号の割合を取得する全体の信号の選択した領域内の信号の比を計算します</li>。
		<li>繰り返しの手順 4.2.2-4.2.6 各 z 平面の細胞容積の定量化を取得します。必要に応じて、幾何学的形態を適応します</li>。
		<li>コピー/貼り付けデータから取得、&#34; 結果 &#34; スプレッドシートをグラフィカルに表示、平均値を検索するに z 平面レイヤーごとに windows</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

最近の技術の進歩は、並進運動の発現に関与するメカニズムの理解または神経の開発、薬剤応答、転移などの生物学的プロセスの特定の Mrna の抑圧の許可しています。ここで説明したコスト効果の高い方法により、翻訳イベント RNA 結合蛋白質が細胞接着、移行、侵略などの転移プロセスを調節する方法を研究する細胞で可視化することです。
De novoタンパク質翻訳を評価するために多くの方法が開発されているはすべて検出部位が付いた変更されたアミノ酸が伸長のポリペプチドに組み込まれています、同じ戦略を共有しています。これらのメソッドの最初は、 35S, アルギニン混入新たに翻訳されたタンパク質に依存します。特定の条件下で翻訳率を比較するため効率的ですが、標識アミノ酸の使用はほとんどの研究チームに魅力のないメソッドをなります。したがって、小説の開発、夕日などの非放射性ラベルを使用してメソッドをクリックして-それは、またはトリック アプローチ評価し、生体内で翻訳イベントを観察する新たな機会を提供します。とはいえ、独創的なこれらのメソッドのほとんど...

翻訳さまざまな細胞機能の調節は、新しいツールや mRNA の翻訳と規制タンパク質合成1,2 の細胞レベル下の局在を決定する方法を開発する多くの研究チームを求めています。、3,4。これらの最近の技術の進歩により翻訳アップレギュレーションや神経の開発、薬剤応答、5 転移などの生物学的プロセスの間に特定の Mrna の抑圧のメカニズムの理解の改善 ,6,7,8。ただし、これらのメソッドのほとんどは、高価なまたは危険な試薬およびほとんどの実験室にできない可能性があります特定の機器を必要。など、翻訳イベントの迅速な評価を可能にするコスト効果の高い方法は、具体的には、これらの潜在的な問題を回避するために開発されました。このメソッドは、特定の細胞プロセス中に発生する急性の並進変調を検出し、共焦点顕微鏡を用いた翻訳の局在化のためことができます。
ここで説明した方法は、拡散開始センター (SIC)5と呼ばれる細胞レベル下コンパートメント内にあるローカライズされた翻訳を監視する使用されました。Sic は、シード細胞初期接着複合体の上にローカライズされる一時的な構造です。Sic および接着複合体が異なるが、彼らの運命は密接に関連します。確かに、接着の初期段階で密着サイトへと焦点接着の複雑な成熟化に徐々 に消えてしまう Sic が知られています。分かった mRNA 翻訳 (例えばSam68、FMRP、および G3BP1) を具体的に制御する知られている RNA 結合蛋白質と Rna は、これらの濃縮した polyadenylated 構造5。ここで説明する方法を使用して、細胞接着の統合セルを SIC 関連 mRNA の翻訳ができるようにチェックポイントとして行為の規制にシードを紹介しました。翻訳の試金 (日没) の表面検出の適応バージョン ピューロマイシン定款に基づいて、このメソッドが考えられます。もともと非放射能標識アミノ酸を使用した世界のタンパク質合成速度を測定するために開発され、蛋白質 puromycilation はde novoタンパク質合成9を可視化する効率的な方法を提供しています。このメソッドは、ピューロマイシン、リボソーム10で時期尚早鎖終結経由で翻訳をブロックする抗生物質の固有の動作に依存します。確かに、ピューロマイシンはペプチド結合の形成によるペプチド鎖の伸長に混入の可能チロシル tRNA に構造的に似ています。しかし、成長しているペプチド鎖にピューロマイシン結合は、ピューロマイシン Trna の加水分解性エステル結合ではなく非加水分解性アミド結合を持っているので、次のアミノアシル tRNA が形成されてから新しいペプチド結合を防ぎます。したがって、ポリペプチド鎖の伸長にピューロマイシン定款の9,mRNA 積極的に翻訳された11,12 に対応する多数の切り捨てられた puromycilated ポリペプチドの早期リリースで結果します。.
このメソッドを使用すると、短時間未亡人内でアクティブな翻訳を評価することが可能だった (など5 分) 5 分期間の抗生物質と補われた細胞ピューロマイシンに対して指示される抗体を用いた細胞接着中細胞接着中に異なる時点で5を処理します。本法の精度は puromycilated 部位に対する特異性の高い抗体に依存しています。Puromycilated ポリペプチドの蛍光検出では、共焦点イメージング システムを使用して非常に正確に定量化することができますも新たに翻訳された mRNA の一般的な細胞レベル下の再パーティション化を提供します。
したがって、このメソッドは、神経肉芽6,13,14,などのプロセスに関与する並進運動の調節機構を調査する実験室の多数の関連するオプションを提供しています15、モルフォゲン mRNA の局在、および開発16,17時に翻訳。それはまた急速な生命現象、細胞遊走、接着、浸潤などまたは単に並進変更5,を誘導するかもしれない薬物治療を評価するために中にローカライズ済みまたは区分の翻訳の勉強にも適しています7,18. 全体的にみて、この方法は迅速かつ正確でコスト効果の高い方法でローカライズ済みまたは制御された翻訳イベントの可視化すること。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>wisent</td><td>325-043 EL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Puroycin 抗体 12D10</td><td>EMD ミリポア</td><td>MABE343</td><td>ウェスタンブロット希釈 1:25,000 免疫蛍光希釈 1:10,000</td></tr><tr><td>抗マウス IgG, HRP 結合抗体</td><td>細胞シグナル伝達テクノロジー</td><td>7076</td><td>ウェスタンブロット希釈 1:8,000</td></tr><tr><td>ウェスタンライトニングプラス-ECL</td><td>パーキンエルマー</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス IgG (H+L)、F(ab')2 フラグメント (Alexa Fluor 488 Conjugate)</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>4408</td><td>免疫蛍光希釈 1:400</td></tr><tr><td>CF568 ファロイジン</td><td>ビオチウム</td><td>00044</td><td>免疫蛍光希釈 1:400</td></tr><tr><td>シクロヘキサミド</td><td>Σ</td><td>C1988-1G</td><td>50&micro;g/ml 最終濃度</td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>最終濃度 1&micro;g/ml</td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>バイオベーシック</td><td>PJ593</td><td>2.5&micro;g / mlから10&micro;g/ml</td></tr><tr><td>イビディ &micro;-ディッシュ 35 mm、高、ibiTreat</td><td>イビディ</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>MRC-5 細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7 マ</td><td>ズルイ博士 (Universit&eacute;Laval)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fv1000</td><td>オリンパス</td><td></td><td>共焦点イメージングシステム</td></tr><tr><td>フィジー ソフトウェア</td><td></td><td></td><td>http://fiji.sc</td></tr><tr><td>PBS (Phosphate BuffeRed Saline)</td> <td>bio-Basic</td><td>PD8117</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド 37% 溶液</td><td>bio-Basic</td><td>C5300-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>bio-Basic</td><td>TB0198</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>フィッシャーBioreagents</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>フィッシャーBioreagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

MRNA の翻訳を規定しているメカニズムは、複数の疾患だけでなく生殖細胞形成、細胞分化と器官形成などの様々 な生物学的過程に関与しています。多数の出版物は説得力のある特定のメカニズムがしっかりと mRNA の翻訳を調節する示されています。蛋白質の表現の翻訳による規制の高められた興味は調査し次のde novoタンパク質合成cellulo の新規手法の開発につながっています。ただし、これらのメソッドのほとんどは複雑で、高価なそれらを作ると、よく学ぶことができます mRNA ターゲット数の制限します。この原稿は、のみ基本的な試薬とを測定し、様々 な条件の下で任意のセルの行で発生する mRNA の翻訳の変化を可視化する共焦点蛍光イメージング システム必要とする手法を提案します。このメソッドはさまざまな生物の中に短い期間のde novo翻訳を可視化する可能性を提供しています、時間の短い期間で付着性のセルの細胞内の構造にローカライズした訳語を表示する最近使用されました。プロセスまたは特定の刺激への応答の橋渡し活動の変更を検証します。

ピューロマイシン定款を使用して翻訳イベントを正確に観察するには、それぞれは異なるピューロマイシン定款動態 (図 1)9,11 を示していますので、各セルラインの最適条件を決めることが大事です。 ,12,18。したがって、ピューロマイシン定款を検証するため、ピューロマイシン濃度の増加の標準化されたスペクトルを持つ目的のセルの行を処理すべきだ (1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、および 15.0 μ G/ml) 時間 (5 〜 10 分) 期間が異なる。ローカライズされた翻訳または薬物治療への早期の対応を評価するために短い培養時間が優先 (例えば、 5 分未満)、ことができます特定の治療の直後並進イベントの直接の評価のため。理想的には、ピ...

本稿では、可視化し、細胞内コンパートメントのローカライズされた翻訳イベントを定量化する方法について説明します。本稿で提案する手法は基本的な共焦点イメージング システムと試薬が必要です、迅速かつ費用対効果。

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

本実験の総合的な目的は、細胞接着の初期段階で起こる区画化された翻訳イベントを可視化し、定量化することです。この手法は幅広い応用が可能です。細胞遊走、接着、または初期の薬剤応答の解析など、迅速かつ特異的な翻訳応答を測定する必要がある場合に活用してください。この手法の主な利点は、簡便で迅速であり、コスト効率が高いことです。必要となるのは、ピューロマイシン、ピューロマイシンに対する抗体、および標準的な共焦点スキャンイメージングシステムのみです。まず、MRC-5細胞の懸濁液を調製します。トリプシン処理を行い、続いて遠心分離、上澄みの除去を行い、その後、10% FBSを含むDMEMを用いて40 thousand cells/mLの濃度で再懸濁します。焦点接着複合体を完全に解離させるため、懸濁液を緩やかに回転させながら20分間インキュベートします。この工程は極めて重要です。次に、2枚の35 mmガラスボトムディッシュに、懸濁液を2 mLずつ分注し、細胞の接着とSiC形成が行われるようインキュベートします。40分後、一方のプレートをシクロヘキシミドで処理し、再びインキュベーターに戻します。このプレートを陰性対照として使用します。55分後、あらかじめ決定した濃度のピューロマイシンを両方のプレートに添加し、さらに5分間インキュベートします。播種から1時間、およびピューロマイシン処理の5分が経過した後、各プレートを氷冷したPBS 2 mLで2回洗浄します。次に、PBSで調製した4%ホルムアルデヒド1 mLを用いて、室温で15分間細胞を固定します。固定後、細胞をPBSで3回洗浄し、次にPBSで調製した0.5% Triton X-100溶液500 µLを用いて、室温で20分間細胞を透過処理します。続いて、プレートをPBSで3回洗浄し、PBSで調製した1% BSA溶液500 µLを添加します。そのまま室温でさらに20分間インキュベートします。過剰なBSAを除去するために、0.1% Tween-20含有PBSで細胞を3回洗浄します。次に、300 µLの抗ピューロマイシン抗体を加え、細胞をインキュベートします。0.1% Tween-20で3回洗浄し、未結合の抗体を除去します。次に、ピューロマイシン化されたポリペプチドおよびde factemを可視化するために、2種類の蛍光色素標識二次抗体の混合液300 µLを添加します。細胞を室温・暗所にて1時間インキュベートします。1時間後、プレートを3回洗浄して未結合の抗体を除去し、その後、DAPIを添加した0.1% Tween-20溶液300 µLを添加します。DAPIを室温で5分間細胞に作用させます。最後に、細胞をさらに4回洗浄し、最後は純粋なPBSで洗浄して仕上げます。その後、イメージングのために細胞を2 mLのPBS中で保存します。市販の共焦点イメージングシステムを使用し、まず定量化のためのダイナミックレンジを最大化する適切な設定を決定します。ピークサイズの飽和を避け、濃度を適切に調整した場合にのみ、定量化に重点を置いた解析が可能になります。これらの設定は、レーザー出力の強度とオフセットを慎重に調整することで得られます。まず、ナイキストの定理に従って、ピクセルサイズを最適化するためにズーム倍率とピクセル数を調整します。次に、走査速度を下げ、平均化処理を行うことで、信号対雑音比（S/N比）を向上させます。次に、Z軸に沿って適切な上端および下端の焦点面を手動で決定し、軸方向分解能を算出した後、この距離を2.3で除してステップサイズ（StepSize）を設定します。通常、結果として20〜25層の画像レイヤーが得られます。設定を調整した後、開口数1.42の60倍Plan Apo油浸対物レンズを使用して、単一細胞全体の共焦点画像を取得します。蛍光色素シグナルを定量・分析するには、まずImageJで目的のz平面層に対応する画像を開きます。次に、描画ツールを使用して、定量したい細胞を通過するように線を描きます。続いて、「straight」をダブルクリックして線の太さを調整します。強度の値は線の幅全体で平均化されるため、異なる構造からのシグナルの重なりを避けるために細い線を使用してください。次に、ラインに沿った信号密度のプロファイルを作成します。続いて、フルオロフォアに対応するチャンネルにおいて、同じラインに沿って信号密度を収集するプロセスを繰り返します。値は常にラインの方向に沿って順序付けられます。次に、プロファイルデータをコピーし、解析用にスプレッドシートに貼り付けます。統計解析に進む前に、目的とするすべてのZ平面画像からデータを収集するこのプロセスを繰り返してください。また、軸に沿ってシグナルを収集する代わりに、画像内の特定の領域からシグナルを収集することも可能です。まず、幾何学的形状関数を使用して関心領域を選択します。次に、背景を除去するためにしきい値レベルを調整します。ピクセル強度のヒストグラムにおいて、スライダーを動かして定量化に含めるピクセルを調整します。細胞外のすべての赤色ピクセルを除去するようにしきい値を設定します。次に、背景信号ではなく目的の信号を測定するために必要な測定パラメータを定義します。「しきい値への制限」と「統合密度」のオプションを切り替えます。次に、measureコマンドを使用します。これにより、選択領域内の平均グレー値とピクセル数が表示された新しいウィンドウが開きます。同様の手順を繰り返し、同じ閾値を適用して細胞全体の信号強度を決定します。次に、これらのデータを用いて、選択領域のシグナルと細胞全体のシグナルの比率を算出します。ピューロマイシン取り込みを用いた翻訳イベントを正確に測定するため、まず軸方向測定の最適条件を評価しました。さまざまな濃度において、5分間または10分間の処理による比較を行いました。MRC-5およびHeLa細胞における許容されるピューロマイシン濃度は、Huh-7細胞に必要な濃度よりもわずかに高かった。高濃度のピューロマイシンで10分間処理した細胞では、主にサイズの小さいピューロマイシン付加ポリペプチドが生成された。これらの小さいポリペプチドはより急速に拡散するため、望ましくない。したがって、より短いインキュベーション時間がより望ましいと考えられました。シクロヘキシミド処理は、効果的かつ重要なネガティブコントロールとなります。MRC-5細胞では、シクロヘキシミド処理後、弱いピューロマイシン信号のみが検出されました。軸方向のシグナル定量を用いることで、新規合成タンパク質に対応するピューロマイシン標識ポリペプチドの細胞内における一般的な局在を、異なるレベルで評価することができました。また、細胞全体におけるシグナルの定量的な分布を求めることも可能でした。どちらの手法においても、細胞全体の翻訳イベントを正確に評価するためには、画像スタック内のすべてのZ平面においてシグナルを定量することが重要でした。このビデオを視聴することで、細胞内コンパートメントにおける翻訳イベントの評価方法について十分に理解できるはずです。この手法を習得すれば、適切に実施することで1日以内に完了させることができます。この手順を行う際は、ピューロマイシンの濃度とそのインキュベーション時間が重要であることを覚えておく必要があります。拡散を抑えるためには、インキュベーション時間を制限することが望ましいです。また、良好な結果を得るためには、画像取得方法の質が極めて重要である点に留意してください。ホルムアルデヒドによる作業は非常に危険であるため、本手順を行う際は、常に化学薬品用フード内で作業するなど、十分な予防策を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

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