アフリカツメガエルは、翻訳減損を識別するためのモデルとして、 アフリカツメガエル

この手順の全体的な目標は、新たに転写されたmRNAの干渉なしに翻訳開始因子の突然変異の最初の結果を評価すること、または真核細胞研究でしばしば発生するトランスフェクション効率の問題を評価することです。これは、まず、対応するプラスミドから変異型野生型およびコントロール、またはGFP mRNAを合成することによって達成されます。次に合成したRNAをステージ6でXUS Lavis細胞にマイクロインし、プロゲステロンで成熟を促進します。

次に、胚小胞分解の可視化によって細胞の成熟を評価し、コケタンパク質の発現に依存する活性化に依存するMAキナーゼカスケードの一部の成分をウェスタンブロットで解析します。最後に、コケのmRNAポリアデニル化およびXPO細胞筋症の回復に必要な他のmRNAについて研究します。最終的には、運動性細胞の成熟。

ウェスタンブロットおよびポリアデニル化解析は、翻訳開始因子が変異した場合のタンパク質発現の潜在的な影響を示すために使用されます。この技術の主な利点は、既存の方法や、胚芽またはウサギの網状赤血球と同等に抽出された再構成された細胞系と比較して、MRに導入された突然変異の影響です。NAは、いくつかのxopレビュイで迅速に観測でき、簡単に研究できます。サイト:より一般的には。

このモデルは、単一の巨大細胞による単純さという利点があり、その使用は生化学実験のためのかなりの量の材料につながります。このプロセスは、安定した細胞株作製と比較して時間効率も良いです。この味噌は、イオン因子の特定のドメインの役割をよりよく理解したり、この因子のスプライシングを研究したりするなど、翻訳研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手法のアイデアは、転写の干渉なしに変異した翻訳開始因子がタンパク質合成に与える影響を研究したいと思ったときに最初に追加しました。これにより、これら2つのomeメカニズム間の潜在的なフィードバックループを回避します。実際、資料の転写物は保存され、置かれます。

翻訳はプロゲステロンで引き起こすことができます 排便後、xus lavos細胞を細胞化し、テキストプロトコルに従ってCRNを準備し、10 x MOPSと6.6%ホルムアルデヒドを使用して1.5%AROSゲルをキャストします。8.8%ホルムアルデヒド、60%AMIDE 0.1容量の10 x mopsと1マイクロリットルのCRNAを含む0.2ミリリットルのチューブにサンプルを調製し、摂氏70度で3分間インキュベートし、チューブを氷上に10分間置きます。サンプルを5, 000倍Gで数秒間遠心分離してから、2マイクロリットルのゲルローディングバッファーを追加します。

サンプルを90ボルトで20分間分析して、ゲルを軽視します。ヌクレアーゼフリーの水に一晩浸します。次に、それを分析してCNAの品質を確認します。

分光光度計を使用してCNA濃度を決定し、サンプルを摂氏マイナス80度で保存して、RNAのマイクロインジェクションを実行します。ND 96ミディアムを使用して、落葉後1〜2時間で削ったペトリ皿に充填します。皿の削られたレーンに沿ってサイトを配置します。

次に、先端が折れたものを45度の角度で配置したキャピラリーマイクロピペットを使用します。毛細血管の先端を約150〜200ミクロンの深さで、色素沈着した動物領域の下の赤道帯に挿入します。最初の卵子に60ナノリットルの30ナノグラムのCRNAを注入します。

その後、5〜10秒待ってからキャピラリーチップを取り外し、サンプルが漏れないようにします。次の細胞を注入するには 手動で皿を動かします。注入した細胞を3ミリリットルのND 96培地で満たされた24ウェル培養プレートに移し、摂氏19度で有糸分裂成熟を引き起こすように導く。

卵子をND 96でプロゲステロンまたはPGの1ミリリットルあたり2マイクログラムと摂氏19度で15時間インキュベートします。テキストプロトコルに従って、野生型EIF 4G one CRNAsの変異表現型に対する翻訳効果をテストします。実体顕微鏡下で胚小胞の破壊の程度を決定すること。

PG刺激後の成熟細胞の数を、黒い動物の極に白い斑点が存在するかどうかで数えます。24時間目まで1時間ごとにカウントを繰り返して、西洋の血液分析を行います。4°Cのマイクロピペットチップの前後の動きを使用して、ここに示されているバッファーの200マイクロリットルで10個の細胞を均質化します。

サンプルを 10, 000 倍 G で 15 分間遠心分離し、中央の細胞質画分を抽出します。上の画分を対応する脂質に、下側の画分を細胞の破片に位相化します。細胞質画分を採取し、アリコートを保存してタンパク質濃度を決定します。

残りの部分をラメリーまたはBissサンプルバッファーと1対1の比率で組み合わせてから、SDSページおよびウェスタンブロッティングを実行します。テキストプロトコルによると。ポリベンチレーションアッセイを実施するには、1つの条件につき5つの細胞を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに入れ、1ミリリットルのヌクレアーゼフリー1つのXPBSで細胞を洗浄します。

次に、ドラフトの下で、製造元の指示に従ってRNA抽出キットを使用してRNAを分離します。RNAの完全性を確認し、濃度を決定した後、CRNA条件ごとに2つのライゲーション混合物を調製し、最初の混合物に次の試薬を使用します。pgで刺激されていない細胞からのRNAを第2の混合物に加える。

PG刺激卵子からRNAを添加します。摂氏37度で1時間インキュベートし、次に摂氏65度で20分間インキュベートします。CD NA逆転写キットを使用して酵素を不活性化します。

各サンプルについて、ここに記載されているRT混合物を調製します。PCRを実施した後、10マイクロリットルのライゲーション反応を追加し、4マイクロリットルのローディングバッファーで各反応に以下の反応混合物と条件を使用して、製造元の指示に従ってRTを行い、110ボルトで3%agrosゲルに各サンプルの10マイクロリットルを泳動します。最後に、10分後と20分後にゲルを分析して、polyAテールの長さを反映したサイズの変化を観察し、したがって、翻訳の前提条件であるRNAの成熟

ここに示すように、制御条件下で注入された卵子マイクロの動態成熟は野生型と同程度であり、PG刺激の12時間後と24時間後、PG刺激の24時間後にGVBDを受ける数は同程度です。成熟に達する卵子の割合は、野生型、水およびGFP注入コントロールで類似しており、水またはコントロールまたはEIF 4G one CRNAのマイクロインジェクションは、ドミナントネガティブEIF 4Gのものによる卵子筋症マイクロインジェクションにほとんど影響を与えませんでしたが、PG刺激後でもGVBDの劇的な減少をもたらしました。この図は、野生型と優性負のEIF 4G one CRNAの比率が増加するにつれて、野生型CRNAの成熟欠陥を回復できることを示しています。

予想通りに成熟する細胞の割合も同様です。PG刺激がない場合、内因性コケの発現は検出されず、EIF 4Gの過剰発現は、以前の結果と一致して、1つのドミナントネガティブが内因性コケにほとんど影響を与えません。さらに、コケ誘導の上流で作用するAurora AEEG 2は、タンパク質の調節不全やPG刺激後に誘導されたリン酸化形態の証拠を示していません。

逆に、コケによって誘発されるirk 2リン酸化は、支配的な負のEIF 4G 1の存在下で阻害されます。一度マスターすると、このテクニックは適切に実行されれば5日で行うことができます。この手順を試行する際は、この手順に続いて、特定のナノグラム未満の濃度でCNAの120ナノリットルを超えないように注意することが重要です。

ポリソームプロファイリングのような方法は、どのRNAが翻訳が不十分または高度に翻訳されているかを定義するなどの追加の質問に答えるために実行できます。