Name: リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールとしてSECM逮捕シーケンスを使用して、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学ぶSECM停止配列を用いたリボソーム結合新生ポリペプチドの単離法。大腸菌in vitro翻訳系で70Sリボソームに安定結合した新生鎖複合体を蔗糖密度勾配遠心で精製し、翻訳伸長の動態を解析する。

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この作品は、ヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラム助成RGP0024によって資金を供給された。

1。 DNAテンプレートの調製とin vitro転写 <ol><li>目的の遺伝子は、任意のT7および/または、例えばプラスミドに基づくSP6プロモーターに複製されます。興味のあるRNCを得るためには、標的ポリペプチドのC末端は、SECM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7の逮捕誘導シーケンスを追加することによって拡張されています。目的のポリペプチドフラグメントは、リボソームトンネルの外に押し出すことを保証するためには、標的タンパク質のC末端部分は、少なくとも30のアミノ酸12から14によって拡張する必要があります。柔軟性のグリシン - セリン豊富なリンカーは、すべての可能なコンフォメーションの制約を回避するために、タンパク質とSECM逮捕·シーケンスの間に導入することができます。 </li><li> in vitro転写では、テンプレートDNAは、ORFの下流を切断する制限酵素で直線化されるべきである。一つは、アガロースゲル電気泳動で制限酵素消化製品を実行することにより、プラスミドDNAの完全な線形化を確認する必要があります。 </li><li>線形化されたプラズマidは、さらにin vitro転写反応のために使用されます。テンプレートDNAの異なる濃度は 、in vitro転写のために必要な最適なDNA濃度を識別するためにテストすることができます。一般的にAmbionのMEGAscript高利回り転写キット（Ambion社/ライフテクノロジーズ、Grand Island、NY）を、1μgの直鎖状DNAの収率40から60μgのmRNAと。in vitro転写メーカーの指示（Ambion社/ライフテクノロジーズ、ニューヨーク州グランドアイランド）に続いて行われます。 </li><li> in vitro転写に続いて 、mRNAは、製造元の指示（AmbionのMEGAscript高利回り転写キット、Ambion社/ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、NY）によると塩化リチウム沈殿により精製されています。 </li><li> mRNAの整合性は、さらに、アクリルアミドまたはアガロースゲルを用いて電気泳動によって確認されています。 </li></ol> （2）in vitro翻訳 RTS 100 E.大腸菌HYキット（5首相、ゲイザーを使用してin vitro翻訳のためにsburg、MD）は次の手順に従います。 <ol><li>メーカーの指示に続くin vitro翻訳反応で 100μlの準備をします。簡単に言えば、ヌクレアーゼフリーの水で24μlのアミノ酸混合物を引いたメチオニン（1mM）を、リボヌクレアーゼインヒビターの10単位（Invitrogen社/ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、NY）、放射性の20μCiの[35 S]（-メチオニンのMPバイオメディカルを追加ソロン、オハイオ州）、20μlの反応ミックスは、24μlの再構成バッファとE.の24μlを大腸菌ライセート。 </li><li>暖かい翻訳反応を事前に5分間30℃で反応をインキュベートします。 10〜15分間30℃での翻訳反応とインキュベートするmRNAの1〜2μgのを追加します。 </li><li>氷の上で翻訳反応を置くことによって反応を停止します。 </li></ol> 3。 in vitro翻訳反応でから新生ポリペプチドの単離<ol><li> RNCを分離するには、翻訳反応は、20mM HEPES-KOH pHが7の5〜30％のショ糖勾配の4.5ミリリットルの上に積層されている0.5、15 mMのMgCl 2、100mMの酢酸カリウム、1mMのDTT及び41000 rpmでベックマン·コールター社のSW55-Tiローター、4℃で2時間Cを使用して遠心分離した。 </li><li>遠心分離後、ショ糖密度勾配は異なるリボソーム集団とそれに関連する新生鎖を分離する分画する。分離は、ISCO UA-6吸光度検出器を用いて254nmで連続記録とISCOプログラマブル密度勾配システムを使用して監視されます。 </li><li> 70Sリボソームを含む画分（s）を収集し、さらに実験の目的に応じて分析されます。 </li></ol> 4。トリス - トリシンSDS PAGEでのリボソームに結合したタンパク質の観察 SECM拡張タンパク質はリボソーム70Sに接続されたままであるかどうかを確認するには、勾配分画を回収し、次のように扱われました。 <ol><li>各画分中のタンパク質は10％の最終濃度になるようにトリクロロ酢酸（TCA）を添加することにより沈殿させ、4℃overniでインキュベートしたGHT。 </li><li>一晩インキュベートした後、試料をペレットに15分タンパク質を14,000×gで遠心分離した。以下の遠心上清を除去し、ペレットをアセトンを含有する溶液で2回洗浄した。1 mMのトリス-HCl pHは7.6（4:1）。ペレットは、さらに空気が乾燥した後、SDS-PAGEローディング緩衝液に溶解した。 </li><li>処理された試料が解決され、トリス - トリシンSDS-PAGEにより分析した。 </li><li>電気泳動後、ゲルを固定し、真空ゲル染色を使用して、オートラジオグラフィーにかけ乾燥させた。新生ポリペプチドの分布はphosphoimagingを用いて観察した。 </li></ol> 5。代表的な結果ここでは、安定した70Sリボソームに結合したフルレングスウシγ-Bクリスタリンの分離を説明する実験を提示します。 図1は、ウシγ-BクリスタリンのRNCの分離に必要な手順を示しています。 γ-BクリスタリンのC末端が32アミノ酸tで全体的な拡張されましたoは、リボソームトンネルからその全長タンパク質の押し出​​しを確保する、これはまた、融合ポリペプチドのC末端は非常に配置されたSECM失速シーケンスが含まれています。 in vitro翻訳に続いて 、70Sリボソームは、ショ糖密度勾配遠心法（図2.1）により単離した。蛋白質が安定してリボソームに結合したままであることを確認するためには、分数を含む70Sをプールした、脱塩、バッファーが交換され、ショ糖密度勾配遠心の追加ラウンド（図2.2）に供した。 図2に示す結果が明確にSECMを効率的にγ-BクリスタリンのRNCの翻訳停止を誘導することを示唆している。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig1.jpg" /> 図1。 RNCの分離に必要な手順の概略説明。ウシγ-BクリスタリンのC末端が32アミノ酸配列によって拡張されました。この拡張C-末端領域にもSECM逮捕配列を含む。 SECM配列を有するγ-BクリスタリンはpIVEX 2.3（T7ベース）プラスミドにクローニングした。 in vitro転写用テンプレートDNAをXbaIで直線化されました。線形化されたテンプレートは、さらにin vitro転写のために使用されていました。 DNAテンプレートのT7は、T7プロモーターの下流に位置する、γ-Bクリスタリン遺伝子を転写するT7 RNAポリメラーゼによって認識されている。 mRNAは、塩化リチウム沈澱法を用いて精製した。精製したmRNAはその後in vitro翻訳のために使用されていました。以下のインキュベーションは、翻訳反応は、5〜30％のショ糖勾配の上に重層し、2時間41000回転、4℃でベックマン·コールター社のSW55-Tiローターで遠心分離した。 <spクラス= &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig2.jpg" /> 図2。ウシγ-Bクリスタリンの分離が安定して70Sリボソームに結合したRNCは1μgのmRNAを100μlの反応E.で混合した大腸菌 S30抽出システム20μCiの[35 S]でプロトコルの項で述べたように-メチオニン、15分間30℃でインキュベートした。以下のインキュベーションは、翻訳反応は、20mMのHEPES-KOH pHは7.5、15 mMのMgCl 2、100mMの酢酸カリウム、1mMのDTTに5〜30％のショ糖勾配の上に重層し、41000で、ベックマン·コールター社のSW55-Tiローターで遠心分離した。 rpmで2時間、4℃。速度沈降に続いて、勾配がアンロードされ、リボソームプロルが得られた。データはPeakTrakプログラム（ISCO勾配密度勾配分画システム）によって記録された。画分を回収し、タンパク質は、CのTris-T 6％、16.5％のTにTCA沈殿させ、解決されましたricine PAGEゲル15。ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィー用に公開されました。次の暴露は、ゲルは台風9410イメージングスキャナを使用してスキャンした。 図2.1は、フルレングス、γ-Bクリスタリンは、70Sリボソームの分画に存在することを示している。したがって、SECM失速シーケンスは、安定したウシγ-BクリスタリンのRNCの分離を可能にします。 図2.2のデータは、明確に分離されたRNCのは確かに安定していることを示しています。現在の実験では、ショ糖密度勾配遠心分離の最初のラウンド後の70S画分をプールし、スクロース、20 mMのHEPES-KOH pH7.5で、15mMのを含む溶液中に緩衝液交換に続いてアミコンウルトラ-4遠心式フィルターユニット（ミリポア）を使用して、削除されましたのMgCl 2、100mMの酢酸カリウム、1mMのDTT。このサンプルは、さらに5〜30％のショ糖密度勾配遠心分離によって分画し、追加のラウンドを行った。各画分は処理され、 図2.1のように分析した。

<ol><li>Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational protein folding.</a> J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).</li>
<li>Hardesty, B., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+a+nascent+peptide+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucleic+Acid+Res.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding of a nascent peptide on the ribosome.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).</li>
<li>Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+as+a+platform+for+co-translational+processing%2C+folding+and+targeting+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).</li>
<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li>
<li>Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein folding on the ribosome.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).</li>
<li>Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Escherichia+coli+secA+by+cellular+protein+secretion+proficiency+requires+an+intact+gene+X+signal+sequence+and+an+active+translocon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon.</a> J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+monitor%2C+SecM%2C+undergoes+self-translation+arrest+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol.</a> Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.</li>
<li>Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+but+non+polypeptide+prolyl-tRNA+functions+in+the+A+site+for+SecM-mediated+ribosomal+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall.</a> Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).</li>
<li>Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+ribosome-nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).</li>
<li>Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+structure+acquisition+of+nascent+polypeptides+monitored+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).</li>
<li>Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+activity+of+the+ribosome-bound+nascent+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide.</a> FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).</li>
<li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289, 905-920 (2000).</li>
<li>Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometry+of+the+ribosomal+polypeptide+exit+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel.</a> J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+of+globin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding of globin.</a> J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).</li>
<li>Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+peptide+tagging+system+in+degradation+of+proteins+synthesized+from+damaged+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.</a> Science. 271, 990-993 (1996).</li>
<li>Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+stalled+ribosome+nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+or+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro.</a> Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

再現可能な結果を得るためには、in vitro転写と翻訳のために使用されるコンポーネントの品質と濃度が非常に重要です。慎重に処理した場合、我々は、in vitro転写と翻訳の抽出物で市販されている使用していると、彼らは効率的かつ再現可能な結果を与える。 mRNAの品質は翻訳に影響を与えることがないので、in vitro翻訳のためにそれを使用する前に、mRNAの整合性をテストするために最も重要である。 in vitro翻訳のためのインキュベーション時間は、タンパク質の長さによって異なります。また、遠心分離の時間/速度は場合には、70Sリボソーム画分をうまく解決されていないと50Sから分離し、それに応じて調整することができます。さらに、リボソーム結合タンパク質複合体は、RNaseのコンタミを避けるために慎重に処理する必要があります。また、バッファの状態を注意深く監視する必要がありますおよびMg 2 +をキレートするかもしれませんキレート剤は避けるべきである。 <p class="jove_content"...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/キットの名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7高収率転写キット</td><td> Ambionの</td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> RTS 100大腸菌HYキット</td><td> 5内閣総理</td><td> 2401100 </td></tr><tr><td>リボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>インビトロジェン</td><td> 15518012 </td></tr><tr><td>トランス[35 S] -ラベル</td><td> MPのバイオメディカル</td><td> 0151006 </td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-4遠心式フィルターユニット</td><td>ミリポア</td><td> UFC801008 </td></tr><tr><td>貯蔵燐光体オートラジオグラフィー</td><td> GEヘルスケア</td><td>台風9410可変モードイメージャ</td></tr><tr><td>密度勾配分画システム</td><td>ダインイスコ株式会社</td><td> ISCOプログラマブル密度勾配系</td></tr><tr><td>スクロース勾配CENtrifugation </td><td>ベックマン·コールター</td><td>オプティマL-90 K取超遠心</td></tr></tbody></table>

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してsecm逮捕シーケンスを使用して、

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

広範な研究は、細胞内のタンパク質のフォールディングの共同翻訳プロセス1から5であることを示唆している十分な証拠を提供しています。しかし、その機能的なフォームを実現するための共同翻訳折りたたみ時のポリペプチド鎖が続くことを正確な経路はまだ謎です。このプロセスを理解し、共同翻訳の折り畳み中間体の正確な立体構造を決定するために、それは彼らのさらなる構造解析を可能にするために所定のサイズの新生鎖を保有するRNCの分離を可能にする技術を開発することが不可欠です。 SECM（分泌モニター）は、170アミノ酸E.です。 SECM-セカオペロン6の下流セカ（分泌駆動）ATPaseの発現を調節する大腸菌の蛋白質。 Nakatogawaと伊藤は当初、SECMタンパク質のC末端領域17アミノ酸長いシーケンス（150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166）への十分かつ必要であることがわかったこれにより、安定したリボソームのP部位7-9結合したペプチジル-グリシル-tRNAを生成する、Gly165でSECM伸びの停滞が発生します。さらに重要なのは、それはこの17アミノ酸長いシーケンスは、このように所定の大きさ7の新生鎖を保有するRNCの生産を可能にする事実上すべてのフルレングスおよび/ ​​または切り捨てられたタンパク質のC末端に融合させることができることがわかった。したがって、標的タンパク質に融合または挿入したときに、SECMストールシーケンスは、ポリペプチド鎖の伸長の逮捕を生成し、E.の in vivo の両方で安定したRNCを生成する大腸菌細胞と無細胞系の in vitro インチショ糖密度勾配遠心法は、さらにRNCを分離するために利用されています。 孤立したRNCは、共同翻訳の折り畳み中間体の構造的および機能的特徴を分析するために使用することができます。最近、この手法は成功した10,11、いくつかのリボソーム結合した新生鎖の構造への洞察を得るために使用されている。ここでは、ウシγ-BクリスタリンのRNCの分離SECMに融合し 、in vitro 翻訳系で生成について説明します。

ここでは今定期的に安定的に結合したリボソーム新生鎖複合体（のRNC）を分離するために使用される手法について説明します。この手法は、17アミノ酸長いSECM &quot;逮捕シーケンスは&quot;原核生物の翻訳伸長を停止することができるという発見を利用しています（<em&gt; E.大腸菌</em&gt;実質的に任意のタンパク質（またはC末端に融合させた）に挿入された）システムでは、。

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

広範な研究により、細胞内におけるタンパク質の折りたたみは共翻訳的なプロセスであることが十分な証拠とともに示唆されています1-5。しかしながら、正確な経路は...

この手順の全体的な目的は、in vitro 無細胞翻訳系で翻訳中に産生される、SEC TED 70 S リボソーム結合新生鎖複合体（RNC）を単離することです。これはまず、目的遺伝子の C末端に 17アミノ酸長の SEC M ストール配列を導入し、T7 転写プロモーターの下流にクローニングすることで達成されます。次に、in vitro 転写反応を用いて mRNA を転写し、精製します。次に、精製したmRNAを放射性アミノ酸を含む S 30 E coli 抽出液系で翻訳し、合成されたタンパク質または新生ポリペプチドを標識します。最後に、2番目のMr.Edリボソーム結合新生鎖複合体を、ショ糖密度勾配遠心分離および分画によって単離します。最終的に、勾配分画から単離した標識ポリペプチドをゲル電気泳動で分析することで、新生鎖が 70 s リボソームに安定して結合していることを示す結果を得ることができます。この手法の既存の方法（ストップコドンを欠いたmRNAの使用など）に対する主な利点は、翻訳中およびその後の遠心分離ステップにおいて、新生ポリペプチド鎖を70 Sリボソームに高効率に結合させることができる点にあります。さらに、ストップコドン欠損技術とは対照的に、この方法はin vitroおよびin vivoの両方の系においてほぼ同等の効率で使用可能です。この手法は、翻訳に伴うタンパク質折り畳みの分野における重要な疑問、例えば、翻訳のどの段階でさまざまな翻訳折り畳み中間体が形成されるかといった問いに答えるのに役立ち、さらに直接的または間接的な構造解析を用いてそれらの構造を分析することに寄与します。プローブおよび決定アプローチ この手法を用いることで、リボソーム上でのタンパク質折り畳みの経路を解明することができます。本プロトコルでは、70 s リボソームに結合した全長 bine gamma B crystalline 新生鎖の単離について記述しました。しかし、この手法は、事実上あらゆる目的タンパク質のさまざまなバリエーションの単離に使用することが可能です。この戦略は、真核生物の切断された新生ポリペプチド鎖を単離するためにも採用できます。一般的に、この方法に不慣れな方は、ショ糖密度勾配遠心分離のステップで苦労するかもしれません。しかし、経験者にとって、これは問題にならないはずです。ストップコドンを欠いたmRNAを使用する初期の試みでは十分な成果が得られなかったため、私たちは2番目のストール配列を利用して、70Sリボソームに結合したγ-クリスタリン新生ポリペプチドを単離することにしました。後者の手法では、SECM停止配列を用いた手法と同等の効率で、その後の遠心分離ステップにおけるRNCの安定性を確保することはできませんでした。勾配の調製やRNCの分離を含むステップは習得が困難な場合があり、再現性のある結果を得るには一定レベルの専門知識が必要であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。本デモンストレーションは、in vitro転写および翻訳を行う当研究室の大学院生が行います。まず、リボソーム・新生鎖複合体（RNC）を生成するために、T7またはSP6ベースの任意のプラスミドにクローニングされた目的遺伝子を用意します。標的ポリペプチドのフラグメントがリボソームトンネルから確実に押し出されるように、M由来の停止誘導配列を加えてC末端を延長します。in vitro転写の準備として、タンパク質とSEC M停止配列の間に柔軟なグリシンリッチリンカーを挿入します。オープンリーディングフレームの下流を切断する制限酵素を使用してテンプレートDNAを直線化し、アガロースゲル電気泳動を行ってサンプルの完全な消化を確認します。最適なDNA濃度を確認した後、製造元の指示に従って高収量転写キットを使用し、メッセンジャーRNAを合成します。塩化リチウム沈殿法を用いてmRNAを精製します。その後、アクリルアミドゲルまたはアガロースゲルでサンプルを電気泳動し、純度を確認します。これはin vitro翻訳用です。ヌクレアーゼフリー水を用いたE. coliシステムにおいて、メチオニンを除く1 mMのアミノ酸混合物、10 unitのリボヌクレアーゼ阻害剤、20 µCiの³⁵S-メチオニン、20 µLの反応ミックス、24 µLの再構成バッファー、および24 µLのE. coliライセートを加えます。反応液を30 °Cで5分間インキュベートして予熱します。その後、1〜2 µgのmRNAを加え、30 °Cでさらに10〜15分間インキュベートします。反応液を氷上に置いて反応を停止させ、70 sリボソーム結合新生鎖複合体（nc）を単離します。翻訳反応液を、20 millimolar HEPES-カリウム緩衝液（pH 7.5）、15 millimolar マグネシウム、100 millimolar 酢酸カリウム、および 1 millimolar DTTを含む5〜30% ショ糖密度勾配 4.5 milliliters の上層に重ねます。4 °Cで41,000 RPMにて2時間遠心分離します。遠心分離後、プログラム可能な密度勾配分画システムと 254 nanometers に設定した吸光度検出器を用いて、ショ糖勾配を分画します。SEC M延長タンパク質が70 sリボソームに結合したままであるかを確認するため、70 sリボソームを含む画分を回収して詳細な解析に用います。各グラジエント画分にトリクロロ酢酸を加えてタンパク質を沈殿させます。サンプルを4 °Cで一晩インキュベートし、翌日、14,000 ×gで15分間遠心分離してタンパク質をペレット化します。その後、アセトンと1 mM Tris-HCl (pH 7.6) を4:1の比率で混合した溶液でペレットを洗浄します。ペレットを風乾させた後、SDSページ用ロードバッファーで再懸濁します。Tris-Tricine SDS-PAGEでサンプルを分離し、ゲルの固定および乾燥を行い、ここに示すようにオートラジオグラフィーおよびリン酸化イメージングに供します。in vitro翻訳後、γBクリスタリンタンパク質がリボソームに安定して結合していることを確認するため、ショ糖密度勾配遠心法および分画法によって70 Sリボソームを単離しました。70 sを含む画分を回収し、脱塩およびバッファー交換を行った後、再度ショ糖密度勾配遠心分離にかけた。ここに示す結果は、SEC MがγBクリスタリンRNCの翻訳停止を効率的に誘導できることを示唆している。この手法に習熟すれば、新生鎖のゲル電気泳動分析（通常、一晩のTCA沈殿ステップを伴う）を除き、1営業日で完了させることができる。この手順を行う際は、あらゆる段階でRNAの混入を避けることが極めて重要です。RNAが混入すると、抽出液の翻訳効率に影響を及ぼし、70Sリボソームから新生ポリペプチドが解離する可能性があります。最終的な目的応じ、本手順に従うことで、70Sリボソームに安定的に結合したNASTおよび所定の長さのポリペプチドを得ることができます。これらの複合体は、NMRやFRETなどの直接的または間接的なアプローチを用いたリボソーム結合新生鎖の構造決定や、作製後の因子およびリガンド結合の試験など、さまざまな目的に利用できます。この手法により、構造生物学およびタンパク質折り畳みの分野の研究者が、リボソームに結合した全長タンパク質の構造や、共翻訳的な折り畳み中間体を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、翻訳タンパク質折り畳みの分野におけるさまざまな疑問を解決するために利用可能な、70 S リボソームに安定して結合した新生ポリペプチドの調製および単離方法について、十分な理解を得ることができるはずです。放射性同位体や、例えば [35S] メチオニンのような標識アミノ酸を取り扱う際は、特別な注意が必要であることに留意し、本手順の遂行中は常にこれを考慮してください。

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