リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

この手順の全体的な目標は、in vitro 無細胞システムでの翻訳中に産生される SEC TED 70 s リボソーム結合新生鎖複合体または RNC を単離することです。これは、まず、目的の遺伝子のC末端に17アミノ酸長のSEC Mストール配列を導入し、それをT-7転写プロモーターの下流にクローニングすることによって達成されます。次に、in vitro転写反応を用いてmRNAを転写し、精製します。

次に、精製されたmRNAを放射性アミノ酸を含むS30大腸菌抽出システムで翻訳し、合成されたタンパク質または新生ポリペプチドを標識します。最後に、2番目のMr.Edリボソーム結合新生鎖複合体を、スクロース、グラジエント、遠心分離、および分画によって単離します。最終的に、グラジエント画分から単離された標識ポリペプチドのゲル電気泳動分析により、新生鎖が70 sリボソームに安定して結合していることを示す結果を得ることができます。

ストックコドンを欠くmRNAの使用のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、翻訳およびその後の遠心分離ステップ中に、新生ポリペプチド鎖の70 sリボソームへの結合を高効率で保証することです。さらに、ノーストップコードン技術とは対照的に、この方法はin vitroおよびin vivoシステムの両方でほぼ同等の効率で使用できます。この方法は、翻訳のどの段階でさまざまなトランスレーションフォールディング中間体が形成されるかなど、トランスレーションタンパク質フォールディングの分野における重要な質問に答えるのに役立ち、さらに直接構造または間接構造を使用してそれらの構造を解析するのに役立ちます。

プロービングと決定アプローチ この技術は、リボソーム上のタンパク質フォールディングの経路を解読するのに役立ちます。このプロトコルでは、70 sリボソーム結合全長バインγB結晶性新生鎖の単離について説明しました。しかし、この手法は、関心のあるほぼすべてのタンパク質の様々な疾患の単離に使用できます。

この戦略はまた、この方法に新しくなったderm Es.Generalの個々の切断されたnatinポリペプチド鎖を分離するために採用することができるスクロース勾配の遠心分離ステップの間に苦労するかもしれない。ただし、エクスペリエンス 1 では、これは問題にならないはずです。私たちは、ストップコードンを欠いたmRNAの使用を含む最初の、あまり成功しなかった試みの後、リボソームとして70に結合したγB結晶性新生ポリペプチドを単離するために、2番目のストール配列を利用することにしました。

後者の技術では、SECMアレストシーケンスの使用を含む技術と同じ効率で、その後の遠心分離ステップ中のRNCの安定性を確保することはできませんでした。この方法の視覚的なデモンストレーションは、グラジエントの準備とRNCの分離を含むステップを学ぶのが難しい場合があり、再現性のある結果を確保するためにはある程度の専門知識が必要です。目的の遺伝子を任意のT-7および/またはSP 6ベースのプラスミドにクローニングして、リボソーム新生鎖複合体またはRNCを作製することから始めます。

ポリペプチドフラグメントがリボソームトンネルから押し出されるように、Mからのアレスト誘導配列を付加することにより、標的ポリペプチドのC末端を延長します。タンパク質とSEC M停止配列との間に柔軟なグリシンシリアンリッチリンカーを添加してin vitro転写の準備をし、オープンリーディングフレームの下流を切断するユーザー制限酵素を使用してテンプレートDNAを直鎖化し、AROSゲル電気泳動を実行してサンプルの完全な消化を確認します。最適なDNA濃度を確認した後、製造元の指示に従って高収量転写キットを使用してメッセンジャーRNAを合成します。

塩化リチウム沈殿物を使用してmRNAを精製します。次に、アクリルアミドまたはアロスゲルでサンプルを泳ぎ、その純度を確認します。in vitro翻訳用。

核離脱水中の大腸菌システムを使用して、メチオニンを差し引いた1ミリモルアミノ酸混合物、10単位のリボヌクレアーゼ阻害剤20、35秒のメチオニンのマイクロキュリー、20マイクロリットルの反応混合物、24マイクロリットルの再構成緩衝液および24マイクロリットルの大腸菌を添加する。ライセート。反応を摂氏30度で5分間インキュベートすることにより、予温します。次に、1〜2マイクログラムのmRNAを加え、摂氏30度でさらに10〜15分間インキュベートします。

氷上に置いて反応を停止し、70 sリボソーム結合した新生鎖複合体またはncsを単離します。20ミリモルのヒープに5〜30%のショ糖勾配の4.5ミリリットルの上に翻訳反応を重ねます。水酸化カリウムpH 7.5 15ミリモルマグネシウム、100ミリモル酢酸カリウム、および1ミリモルDTT遠心分離機、41、000 RPMで4°Cで2時間遠心分離後、遠心分離後、プログラム可能な密度勾配システムと254ナノメートルに設定された吸光度検出器を使用してショ糖勾配を分画します。

SEC M 拡張タンパク質が 70 s リボソームに結合したままであるかどうかを決定するためのさらなる分析のために、70 s リボソームを含む画分を収集します。トリクロロ酢酸を添加することにより、各グラジエント画分にタンパク質を沈殿させます。翌日、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートし、サンプルを14, 000倍Gで15分間遠心分離してタンパク質をペレット化し、アセトンと1ミリモルトリス、HCL pH 7.6の4対1の比率でペレットを洗浄します。

ペレットを風乾し、SDSページローディングバッファーに再懸濁します。tris Trice SDSページでサンプルを分離し、ゲルを固定して乾燥させ、ここに示すように自動X線撮影とリン酸化イメージングにかけます。in vitro翻訳後、70 Sリボソームをショ糖、グラジエント、遠心分離、および分画により単離し、γ B結晶性タンパク質がリボソームに安定して結合し続けることを確認しました。

70 sを含む画分をプールし、脱塩バッファーを交換し、追加のショ糖勾配遠心分離を行いました。ここで提示された結果は、SEC Mがγ B結晶性RNCの翻訳停止を効率的に誘導できることを示唆しています。一度習得すると、この手法は、通常、一晩のTCA沈殿ステップを伴う新生鎖のゲル電気泳動分析を除いて、1営業日で行うことができます。

この手順を試みる際には、どのステップでもRNAの汚染を回避することが明らかに重要です。RNS汚染は、抽出物の翻訳効率に影響を及ぼし、70番目のリボソームから新生ポリペプチドの放出につながる可能性があります。この手順に従えば、最終目標に応じて70番目のリボソームに安定に結合した所定のランクセスのNASTおよびポリペプチドを得ることができる。

この複合体は、NMRやfreのような直接的および間接的なアプローチを使用してリボソーム結合した新生鎖の確認を決定したり、その開発後に因子とリガンドの結合をテストしたりするなど、さまざまな目的に使用できます。この技術は、構造生物学とタンパク質フォールディングの分野の研究者が、リボソームに結合した全長タンパク質やcot翻訳フォールディング中間体の確認を探求する道を開きました。このビデオを見た後、70 sリボソームに安定して結合した新生ポリペプチドを調製および単離する方法をよく理解しているはずです。

放射性同位元素や標識アミン酸(例えば、A 35メチオニンなど)の取り扱いには特別な注意が必要であり、この手順を実行する際には常に考慮する必要があることを忘れないでください。