Name: 調整可能なモーター駆動ダイナミクスとメカニクスによるアクチン-微小管複合材料の再構成と特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぶアクチン-微小管複合材料の再構成と特性評価。キネシンとミオシンモーターによる駆動ダイナミクスを調整し、細胞環境を模倣するアクティブマタープラットフォームの設計と解析手法を解説します。

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我々は、データ分析の支援をしてくれたマヤ・ヘンディヤ博士とジョナサン・ミシェル博士、有益な議論と指導をしてくれたジャネット・シュン博士、モウミタ・ダス博士、マイケル・ラスト博士に感謝する。この研究は、RMRAとJLRに授与されたウィリアムM.ケック財団研究助成金とNSF DMREF賞(DMR 2119663)、およびRMR-AとRJMに授与された国立衛生研究所R15助成金(R15GM123420、2R15GM123420-02)によってサポートされました。

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著者は開示するものは何もありません

上記の再構成システムの主な進歩は、そのモジュール性と調整可能性であるため、ユーザーは、特定の細胞プロセスをエミュレートしたり、特定の機能や機械的特性を持つ材料を設計したりするなど、目的の結果に合わせてタンパク質、モーター、架橋剤などの濃度を変更することをお勧めします。アクチンおよびチューブリンの濃度範囲の制限は、アクチン(~0.2 μM)57,58,59およびチューブリン(~3 - 4 μM)60の重合に必要な臨界濃度によって下限に設定され、アクチンフィラメント(~90 μM)61,62または微小管(~35 μM)63のネマチックアライメントへの移行によって上限に設定されます。.アクチンモノマーとチューブリン二量体は、互いに相乗的に支持する均質に相互侵入するパーコレートネットワークを形成するために、重合後に一緒に混合するのではなく、一緒にフィラメントに重合する必要があります。複合材料が示す新しいダイナミクスは、この相互作用に依存しています。一般に、示されている結果を正常に再現するには、プロトコルで概説されているすべての手順に従うことが重要ですが、より厳密な手順もあれば、特定のニーズと利用可能なリソースに合わせて変更および調整する余地がある手順もあります。
たとえば、再現性のある結果を確保するための重要なステップの1つは、材料表に記載されているガイドラインに従って試薬を適切に調製および保管することです。細胞骨格タンパク質(アクチン、チューブリン、ミオシン、キネシン)は不安定であるため、分注し、液体窒素で瞬間凍結し、使い捨てアリコートで-80°Cで保存する必要があります。-80°Cから除去したら、アリコートを氷上に保持する必要があります。細胞骨格タンパク質は、追加の凍結融解サイクル後に機能を確実に保持しません。
微小管は、アクチンよりも解重合および変性に対してより敏感である。チューブリンを-80°Cから取り出したら、重合前に氷上に保持し、12時間以内に使用する必要があります。重合したら、微小管は室温に保つ必要があります。また、解重合を防ぐために微小管をタキソールで安定化させることも重要です。アクチンフィラメントのファロイジン安定化は、ミオシンおよびキネシン活性と競合するATP消費アクチントレッドミルを抑制するために同様に重要である。
ミオシンモーターの超遠心分離は、不活性なミオシンデッドヘッドを除去するため、別の重要なステップです。酵素的に不活性なモノマーを除去しないと、アクチンネットワークの受動架橋および活性の喪失が生じる。モーターのATPアーゼ活性を延長するために、クレアチンリン酸およびクレアチンホスホキナーゼ64 などのATP再生システムを組み込むことができる。
最後に、複合活性を維持するには、サンプルチャンバーの壁へのフィラメントとモーターの吸着を抑制する必要があり、これは顕微鏡のカバーガラスとスライドの不動態化によって達成できます。モータータンパク質は特に吸着しやすく、その結果、複合材料がサンプルチャンバーの表面に引っ張られ、視野から外れ、2Dに崩壊し、活性がなくなります。カバーガラスとスライドをシラン化することは、表面を不動態化し、吸着を防ぐ効果的な方法です(手順1を参照)。 インビトロ 細胞骨格実験において効果的に使用される代替のパッシベーション方法は、細胞膜18と同様に、脂質二重層で表面をコーティングすることである。この方法は、タンパク質を表面につなぎ留めたり、他の特定のタンパク質-表面相互作用を導入したりする場合に、二重層を機能化できるため有利です。光ピンセット実験では、ミクロスフェアの不動態化も重要であり、カルボジイミド架橋剤化学 を介して カルボキシル化ミクロスフェアをBSAまたはPEGでコーティングすることによって達成することができる48。
提示されたプロトコルには、研究者がニーズに合わせて変更することを検討する可能性のあるいくつかの側面があります。第一に、研究者は、非天然のビオチン-NA架橋剤を、アクチンおよび微小管をそれぞれ架橋するα-アクチニンまたはMAP65などの生物学的架橋剤に置き換えることを選択することができる28,65,66。ここで説明する複合材料における非天然架橋剤の使用は、天然架橋剤と比較して再現性、安定性、および同調性が向上していることが動機となっています。強力なビオチン-NA結合のため、架橋剤は、広範囲の回転率で一過性に結合するほとんどの天然架橋剤ではなく、永続的であると見なすことができます。過渡架橋のダイナミクスは、架橋剤とモーターからダイナミクスへの寄与の解析を複雑にします。さらに、ビオチン-NAリンカーは、アクチンと微小管の両方を架橋するために、またアクチンを微小管に架橋するために多目的に使用できます。このようにして、他のすべての変数(例えば、架橋剤サイズ、結合親和性、化学量論など)を固定したまま、架橋モチーフ間の明確な比較を行うことができます。最後に、ビオチン-NAリンカーを組み込むために必要な試薬は、広く市販されており、十分に特徴付けられており、多くの生物物理学研究室で一般的に使用されています。ただし、ここで説明するin vitroプラットフォームの主要な強みの1つはモジュール性であるため、研究者は必要に応じてビオチン-NAリンカーをネイティブリンカーにシームレスに置き換えることができるはずです。
第二に、現在のプロトコルでは、アクチンモノマーとチューブリン二量体は、サンプルチャンバーに追加する前に、遠沈管内で一緒にフィラメントに重合されます。絡み合った糸状タンパク質の溶液をサンプルチャンバーに流すと、特に微小管の流れが整列し、複合材料の望ましい等方性と均質性が損なわれる可能性があります。実際、定常状態のアクチン-微小管複合材料に関する以前の研究における大きな進歩は、アクチンと微小管をin situ(サンプルチャンバー内)で共重合して、アクチンと微小管の等方性相互侵入ネットワークの形成を確実にする能力でした15,16,27。ただし、このアプローチを活性複合材料に拡張するには、アクチンとチューブリンの重合前にモーターをサンプルに追加し、実験前にサンプル全体を37°Cで一緒にインキュベートする必要があります。プロトコルに対するこの変動のテストでは、おそらく競合するATPase活性とモーターの長時間の37°Cインキュベーションが原因で、アクチン重合が減少し、識別可能な運動活性が見られませんでした。幸いなことに、図2、図3、および図6に示すように、現在のプロトコルに従うと、複合材料の識別可能なフローアライメントはありません。それにもかかわらず、研究者は、活性複合材料のin situ形成を可能にするプロトコルを設計することが奨励されています。
別の考慮事項は、ネットワーク内のすべてのアクチンフィラメントと微小管をまばらに標識することを伴う蛍光標識スキームです。このラベリングアプローチは、トレーサーフィラメントやミクロスフェア を介して 構造とダイナミクスを推測するのではなく、ネットワークの構造を直接視覚化するように最適化されました。ただし、トレードオフは、個々のフィラメントが明るくラベル付けされて解決できないことです。研究者が単一のフィラメントの分離とネットワーク構造の視覚化の両方に採用できるアプローチの1つは、別の蛍光色素で標識された事前に形成されたフィラメントにドープして、周囲のネットワークと個々のフィラメントの両方を同時にイメージングできるようにすることです。ただし、2つ以上の蛍光色素と励起/発光チャンネルを使用する場合、チャンネル間のブリードスルーを排除するのは難しいことが多いため、蛍光色素、フィルター、レーザー強度の選択には注意が必要です。
関連する制限は、複合材料中のミオシンまたはキネシンモーターを視覚化できないことです。使用される蛍光標識アクチンモノマーおよびチューブリン二量体は市販されているが、複合材料中のミオシンまたはキネシンの可視化には社内標識が必要である。研究者は、以前に行われたように、モーターにラベルを付けるための次のステップを踏むことが奨励されています18,67、運動活動と結合を私たちの複合材料が示すダイナミクスと構造に明確に結び付けることができるようにするためです。
最後に、現在のプロトコルでは、キネシン活性の開始および持続時間は制御されていないことに注意することが重要です。ミオシン活性はブレビスタチンの光失活を用いて制御されるので、上述のように、キネシンの同様の光活性化を組み込むために、光活性化ATPを組み込むことができる。
ここで説明する設計の複雑さを構築し、細胞条件をよりよく模倣し、動的構造関数パラメータ空間を広げるために、将来の作業では、ビメンチン68,69などの中間フィラメントや、ダイニン13,70などの他のモーターを組み込むことに焦点を当てます。ゲルソリンはまた、アクチン長14を制御するために異なる濃度で組み込まれ、微小管の剛性を制御するためにタウタンパク質も組み込まれます。
要約すると、提示されたプロトコルは、単一のシステム内の異なる基質に作用する2つの別々の活性力発生コンポーネントを含む、細胞骨格に触発された活性物質システムのダイナミクス、構造、およびメカニズムを設計、作成、および特性評価する方法を説明しています。このチューナブルでモジュール式のプラットフォームは、再構成の取り組みを細胞の細胞骨格の模倣に一歩近づけ、さまざまなコンポーネントを独立して組み込む、除去する、調整することにより、広いフェーズスペースにわたってその特性をプログラムする独自の機能を提供します。さらに、この汎用性の高いシステムの全ての成分は、前述のようにロスラボで精製され50、要求に応じて入手可能なキネシン二量体を除いて、市販されている(材料の表を参照)。最後に、すべての分析コードはGitHub49 から無料で入手でき、無料のプログラミング言語とソフトウェア(Pythonとフィジー)に基づいています。これらのシステムを設計するためのプロトコルの透過的な普及により、さまざまな専門知識、背景、所属機関、および研究目標を持つ多様なユーザーグループがこのプラットフォームにアクセスしやすくなることを願っています。

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/64228">Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics</a>. The Authors section was updated.
Mehrzad Sasanpour1 
Daisy H. Achiriloaie1,2 
Gloria Lee1 
Gregor Leech1 
Christopher Currie1 
K. Alice Lindsay3 
Jennifer L. Ross3 
Ryan J. McGorty1 
Rae M. Robertson-Anderson1 
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego 
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College 
3Department of Physics, Syracuse University
to:
Mehrzad Sasanpour1 
Daisy H. Achiriloaie1,2 
Gloria Lee1 
Gregor Leech1 
Maya Hendija1 
K. Alice Lindsay3 
Jennifer L. Ross3 
Ryan J. McGorty1 
Rae M. Robertson-Anderson1 
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego 
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College 
3Department of Physics, Syracuse University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64228">Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics

細胞骨格は、相互作用する生体高分子の動的な複合ネットワークであり、細胞に構造的および機械的サポートを提供します。関連する分子モーターと結合タンパク質は、細胞骨格を再構築および適応させて、細胞の成長、形状の変化、硬化、移動、さらには自己修復を可能にし、遊走や分裂からメカノセンシングに至るまでの無数の細胞プロセスを可能にします1,2。細胞生物物理学におけるその重要性を超えて、細胞骨格は、創傷治癒や薬物送達からろ過やソフトロボティクスに至るまでの潜在的な材料用途を備えた活性物質の典型的な例でもあります1,3,4,5,6,7,8,9。
細胞骨格にその独特の構造的および機械的多様性および多機能性を与える2つの重要な特徴は、1)半可撓性アクチンフィラメントおよび剛直微小管などの複数の相互作用タンパク質フィラメント、ならびにそれらに関連する結合および架橋タンパク質を含むその複合的性質である3,5,10;2)ミオシンやキネシンなどのエネルギーを消費するモーターを介して連続的に再構築、移動、粗大化、および作業を実行し、糸状タンパク質を押したり引いたりする能力1,7,11,12,13。この優雅な複雑さにより、細胞骨格は細胞運動性、細胞質分裂、創傷治癒などの多様なプロセスを媒介することができますが3、6、7、11、再構成されたin vitroシステムで細胞骨格の特徴的なin vivo特性を再現する研究者の能力を妨げます。
現在のフロンティア再構成の取り組みは、絡み合って架橋されたアクチンフィラメントと微小管の複合材料に焦点を当てています3,10,14,15,16,17、力を発生させるアクトミオシンネットワーク2,8,18,19,20,21、およびキネシン-微小管によって駆動される活性ネマティクス相互作用22,23,24,25,26。定常状態のアクチン-微小管複合材料は、単一成分系と比較して、フィラメントの移動度の向上や剛性の増加など、創発的な機械的特性15,16,27を示すことが示されています27。in vitroアクトミオシン系に関する研究は、アクチン、ミオシン、および架橋剤の濃度に依存する広範囲の構造的および動的特性を報告している28,29,30,31。例えば、十分な架橋があると、アクトミオシンネットワークは大規模な収縮と粗大化を起こしますが2,28,30,32,33,34,35,36、架橋剤がない場合、ネットワークは急速で不安定な流れと破裂を示します19,29.キネシンモーターのクラスターを使用して微小管束を架橋および引っ張る再構成された微小管ベースの活性ネマティクスは、長期にわたる乱流、伸展、座屈、破砕、および治癒を示すことが報告されています12、22、23、24、25、37、38、39、40、41、 42,43,44,45,46,47。
最近では、ミオシンIIミニフィラメントによって駆動されるアクチン-微小管複合材料は、架橋剤のないアクトミオシンネットワークが示す無秩序な流れおよびネットワーク破裂と比較して、より秩序ある収縮およびネットワーク完全性をもたらすことが示されている17,26,48。さらに、複合ロバスト性と力発生の組み合わせは、アクチンと微小管が同等の濃度で存在する場合に最適化されます。製剤空間のこの領域における主要な創発的特徴には、強化された機械的強度26、アクチンと微小管の協調運動26、安定した持続的収縮、およびメソスケールの再構築17が含まれる。
ここでは、アクチンフィラメントと微小管に作用するミオシンIIミニフィラメントとキネシンクラスターによって平衡から押し出される微小管とアクチンフィラメントの共絡および架橋複合材料を設計および調整するためのプロトコルについて説明します(図1)。このクラスの複合材料のダイナミクス、構造、および力学は、フィラメント、モーター、および架橋剤の相対濃度によって調整でき、移流および乱流、等方性収縮、加速、減速、デミキシング、硬化、緩和、および破裂の豊富な位相空間を示します。この研究の焦点は、このクラスの活性細胞骨格複合材料の調製および調整にある。ただし、研究者が記載されたアクティブ複合材料のベンチマークと特性評価を支援するために、マルチスペクトル共焦点顕微鏡を使用した効果的なイメージング方法も詳しく説明されています。最後に、複合材料のダイナミクス、構造、および力学を測定するために使用できる主要な計算分析方法の結果が提示されます。研究者は、複合材料の複雑なダイナミクスと構造多様性を特徴付けるために最適化されているため、示差動的顕微鏡(DDM)、空間画像自己相関(SIA)、粒子画像速度測定(PIV)を含むこれらの方法を採用することをお勧めします17,26,49。
以下に説明する手順は、複合材料の調製と共焦点顕微鏡を使用したイメージングに焦点を当てています。取得後のデータ分析および光ピンセット測定を記述するプロトコルは、以前の研究17、26、48、50に見出すことができ、要求に応じて提供される。すべての材料は、提供された材料の表に記載されています。

<table><tbody><tr><td>(-)-ブレビスタチン &nbsp;紙で使用される略語: ブレビスタチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0560</td><td> Stock Concentration: 200 &mu;DMSO Storage:乾燥、DMSOのM、-20&ordm;C ストックおよび実験レシピ: 1 mgの粉末を200 &muに溶解します。DMSO 保管、取り扱い、トラブルシューティングのM注:保存期間が限られており、通常、3〜4か月後に確実に機能を停止します。3か月ごとに新しいソリューションを購入して準備します。&nbsp;</td></tr><tr><td>1:20 488-チューブリン:チューブリン混合物 &nbsp;紙で使用される略語: 5-488-tubulin</td><td>NA</td><td>NA</td><<td>strong> Stock Concentration: PEM Storage in PEM Single Use aliquots, -80&ordm;C、凍結融解サイクルを避けてください ストックおよび実験レシピ:チューブリンと488-チューブリンを20:1の比率で混合し、LN2 Storage、取り扱い、トラブルシューティングでフラッシュフリーズします注:各アリコートは、4&ordmで氷上に保管された最大12時間使用できます。C、光から保護する</td></tr><tr><td>1:20 R-チューブリン:チューブリン混合物 &nbsp;紙で使用される略語: 5-R-tubulin</td><td>NA</td><td>NA</td><<td>strong> Stock Concentration: PEM Storage : Single Use aliquots, -80&ordm;C、凍結融解サイクルを避けてください ストックおよび実験レシピ:チューブリンとローダミンチューブリンを20:1の比率で混合し、LN2 Storage、取り扱い、トラブルシューティングで瞬間凍結します注:各アリコートは、4&ordmの氷上に最大12時間使用できます。C、光アク</td></tr><tr><td>チン(ビオチン)から保護する:骨格筋 &nbsp;紙で使用される略語: ビオチン-アクチン</td><td>細胞骨格</td><td>AB07</td><td>ストック 濃度: Gバッファー中の1 mg/ml 保存: 使い捨てアリコート、-80&ordm;C、凍結融解サイクルを避けてください ストックおよび実験レシピ:Gバッファーで1 mg / mlに再構成し、LN2 Storage、取り扱い、トラブルシューティングでフラッシュフリーズします注:(1)使用直前にPEMで0.5 mg / mlに希釈し、(2)-80&ordmから一度取り外します。C、ストア&nbsp;4&ordmの氷の上のアリコート。C:</td></tr><tr><td>アクチン(ロダミン)を最大1週間):ウサギの骨格筋 &nbsp;紙で使用されている略語: R-actin</td><td>Cytoskeleton</td><td>AR05</td><td>Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer Storage: Single Use aliquots, -80&ordm;C、凍結融解サイクルを避けてください ストックおよび実験レシピ:Gバッファーで1.5 mg / mlに再構成し、LN2 Storage、取り扱い、トラブルシューティングでフラッシュフリーズします注:-80&ordmから一度削除されました。C、ストア&nbsp;4&ordmの氷の上のアリコート。Cは、最大1週間の</td></tr><tr><td>アデノシン三リン酸 &nbsp;紙で使用される略語: ATP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1048</td><td> Stock Concentration: 100 mM Storage:溶液(pH 7)、-20&ordm;C ストックおよび実験レシピ: DI H20で再調整し、NaOH でpHを7にします 保管、取り扱い、トラブルシューティング 注: 定期的にpHをチェックし、必要に応じて調整し、時間の経過とともに加水分解し、6~12か月ごとに交換</td></tr>します <tr><td>AlexaFluor488 Phalloidin &nbsp;紙で使用される略語: 488-ファロイジン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A12379</td><td>ストック濃度: 100 &mu;M DMSO Storage:光から保護され、乾燥、-20&ordm;C Stock and Experiment Recipes: 100 &mu; に再構成します。DMSO 保管、取り扱い、トラブルシューティングノート付きM:使用直前の20 &muに希釈します。PEM の M (1 &mu;4 の L &mu;L PEM)</td></tr><tr><td>AlexaFluor488&ndash;ラベル付き actin &nbsp;紙で使用されている略語: 488-actin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12373</td><td> Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer Storage: Single Use aliquots, -80&ordm;C、凍結融解サイクルを避けてください ストックおよび実験レシピ:Gバッファーで1.5 mg / mlに再構成、LN2 Storage、取り扱い、トラブルシューティングでフラッシュフリーズします注:このアイテムは製造中止になりました</td></tr>ベーシック<tr><td>プラズマクリーナー &nbsp;紙略語: プラズマクリーナー</td><td>ハリックプラズマ</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>ベミス&nbsp;パラフィルムMラボラッピングフィルム &nbsp;紙で使用される略語:透明フィルム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-374-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース &nbsp;紙で使用される略語:&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1682836</td><td>ストック濃度: 100x 貯蔵:ストック濃度(100x)または10x濃度で保存、乾燥、-20&ordm;C ストックおよび実験レシピ:は、粉末をDIで4.5 mg / mlに再構成します H20 保管、取り扱い、トラブルシューティング 注:溶液中の最終濃度は45 &mu;g/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>D-ビオチン &nbsp;紙で使用されている略語:ビオチン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP232-1</td><td>ストック濃度:PEM Storage:乾燥、4&ordm;C</td></tr><tr><td>脱イオンナノ純水 &nbsp;紙で使用される略語: DI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチルジクロロシラン &nbsp;紙で使用されている略語: シラン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D/3820/PB05</td><td> Stock Concentration: 2% Toulene</td></tr><tr><td>Dithiothreitol に溶解 &nbsp;紙で使用される略語: DTT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td>Stock Concentration: 1 M in DMSO Storage:乾燥、-20&ordm;C ストックおよび実験レシピ: 各実験の直前にPEMで2 mMに希釈</td></tr><tr><td>DMSO 無水DMSO &nbsp;紙で使用される略語: DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>F-Buffer &nbsp;紙で使用される略語:FバッファーNA</td><td></td><td>NA</td><<td>strong>ストック濃度:10x Storage:乾燥、-20&ordm;C ストックおよび実験レシピ: 10 mM イミダゾール (pH 7.0)、50 mM KCl、1 mM MgCl<サブ>2</サブ>、1 mM EGTA、0.2 mM ATP</td></tr><tr><td>G-Buffer ;紙で使用される略語:GバッファーNA</td><td></td><td>NA</td><<td>strong>ストック濃度:10x Storage:乾燥、-20&ordm;C ストックおよび実験レシピ: 2.0 mM Tris(pH 8)、0.2 mM ATP、0.5 mM DTT、0.1 mM CaCl2。-20°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド &nbsp;紙で使用されている略語:スライド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-310397</td><td></td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ+カタラーゼ+&β;-メルカプトエタノール &nbsp;紙で使用される略語: GOC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2133-250KU, C1345, 63689&nbsp;</td><td>ストック濃度: 100x 貯蔵:ストック濃度(100x)または10x濃度で貯蔵し、乾燥させ、-20°で保管します。C ストックおよび実験レシピ: 100xの場合:4.3 mg / mlグルコースオキシダーゼ、0.7 mg / mlカタラーゼ、0.5%v / v&nbsp;DI H20 保管、取り扱い、トラブルシューティング中の&beta;-メルカプトエタノール 注:溶液中の最終濃度は、0.005% &beta;-メルカプトエタノール、43 &mu;g/mL グルコースオキシダーゼ、7 &mu;g/mL カタラーゼ</td></tr><tr><td>glu-GOC 酸素捕捉システム &nbsp;紙で使用される略語: glu-GOC</td><td>NA</td><td>NA</td><<td>strong>ストック濃度: 100x Storage:毎回新鮮に準備 ストックおよび実験レシピ:GluとGOCを等量混合し、イメージングの直前に最終サンプル量を1/100で追加します Storage、 取り扱い、トラブルシューティングに関する注意事項: グアノシン三リン酸をイメージングする直前にGluおよびGOCから調製</td></tr><tr><td> &nbsp;紙で使用される略語: GTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0461</td><td>Stock Concentration: 100 mM Storage: 100 &mu;L aliquots at -20&ordm;C</td></tr><tr><td>インスタント ミックス 1 分間エポキシ &nbsp;紙で使用される略語:エポキシ</td><td>ロックタイト</td><td>1366072&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>キネシン-1 401 BIO 6x HIS &nbsp;紙で使用されている略語:キネシン</td><td>シラキュース大学のJLロス研究室で調製</td><td>NA</td><<td>strong>ストック濃度: 8.87 &mu;PEM Storage:使い捨てアリコート、-80&ordmのMC、凍結融解サイクルを避けてください 保管、取り扱い、トラブルシューティング 注:ビオチン化二量体はキネシンクラスターを形成し、各アリコートは4&ordmの氷上に保存された最大12時間使用できます。C</td></tr><tr><td>ニュートラアビジン &nbsp;紙で使用される略語:NA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31000</td><td>ストック濃度:PEM Storage:乾燥、-20&ordm;C ストックおよび実験レシピ:は、粉末をPEM No 1で5 mg / mlに再構成します</td></tr><tr><td>。 ガラスカバースリップ(24 mm x 24 mm) &nbsp;紙で使用される略語: カバーガラス</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-548-CP</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel&nbsp; &nbsp;紙で使用されている略語: Taxol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3456</td><td>Stock Concentration: DMSO Storage : 光から保護され、乾燥、-20&ordm;C ストックおよび実験レシピ:DMSO 保管、取り扱い、トラブルシューティングで2 mMに再構成 注:使用直前に200 &muに希釈します。DMSO の M (0.4 &mu;3.6 の L &mu;L DMSO)</td></tr><tr><td>PEM-100 &nbsp;紙で使用される略語: PEM</td><td>NA</td><td>NA</td><<td>strong> Stock濃度: 1x Storage:室温(RT) ストックおよび実験レシピ: 100 mM K-Pipes(pH 6.8)、2 mM EGTA、 2 mM MgCl2 保管、取り扱い、トラブルシューティング 注: KOHを使用してpHを6.8に調整し、pHを頻繁に再チェックし、それに応じて調整</td></tr>します <tr><td>phalloidin 紙で使用されている略語: phalloidin</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P3457</td><td>ストック濃度:</ストロング> 100 &mu;DMSO Storage:のM、光から保護、乾燥、-20&ordm;C、保管/取り扱い条件に密接に準拠 ストックおよび実験レシピ:100&muに再構成します。DMSO 保管、取り扱い、トラブルシューティング 注: 調製および変性中の不純物の影響を受けやすく、サンプル中のアクチンの大きな非晶質凝集体として識別</td></tr>可能 <tr><td>ブタ脳チューブリン &nbsp;紙で使用される略語:チューブリン</td><td>細胞骨格</td><td>T240</td><td>ストック濃度:PEM Storage:シングルユースアリコート、-80&ordm;C、凍結融解サイクルを避けてください ストックおよび実験レシピ:は、粉末をPEMで5 mg / mlに再構成し、LN2 Storage、取り扱い、トラブルシューティングでフラッシュフリーズします注:各アリコートは、4&ordmで氷上に保管された最大12時間使用できます。塩化</td></tr><tr><td>カリウム &nbsp;紙で使用される略語: KCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9640G</td><td> Stock Concentration: 4 M Storage: RT</td></tr><tr><td>Rabbit skeletal actin &nbsp;紙で使用される略語: actin</td><td>Cytoskeleton</td><td>AKL99</td><td>Stock Concentration: 2 mg/ml in G-buffer Storage: Single Use aliquots, -80&ordm;C、凍結融解サイクルを避けてください ストックおよび実験レシピ:Gバッファーで2 mg / mlに再構成し、LN2 でフラッシュフリーズします保管、取り扱い、トラブルシューティング 注:-80&ordmから一度削除した後;C、ストア&nbsp;4&ordmの氷の上のアリコート。C、最大1週間使用できます</td></tr><tr><td>ウサギ骨格ミオシンII &nbsp;紙で使用される略語: ミオシン</td><td>細胞骨格</td><td>MY02</td><td>ストック濃度: PEM Storage:シングルユースアリコート、-80&ordm;C、凍結融解サイクルを避けてください ストックおよび実験レシピ:は粉末をPEMで10 mg / mlに再構成し、LN2 Storage、取り扱い、トラブルシューティングで急速凍結します注:モノマーは低KClでミニフィラメントを形成し、各アリコートは4&ordmで氷上に保管された最大12時間使用できます。C</td></tr><tr><td>チューブリン (ビオチン): ブタの脳 &nbsp;紙で使用される略語: ビオチンチューブリン</td><td>細胞骨格</td><td>T333P</td><td>ストック濃度: PEM Storage:シングルユースアリコート、-80&ordm;C、凍結融解サイクルを避けてください ストックおよび実験レシピ:は粉末をPEMで5 mg / mlに再構成し、LN2 Storage、取り扱い、トラブルシューティングで急速凍結します注:使用直前にPEM</td></tr><tr><td>チューブリン(蛍光HiLyte 488)で0.5 mg / mlに希釈します。 ブタの脳 &nbsp;紙で使用される略語: 488-tubulin</td><td>Cytoskeleton</td><td>TL488M</td><td>Stock Concentration: PEM Storage in PEMml Single Use aliquots, -80&ordm;C、凍結融解サイクルを避けてください ストックおよび実験レシピ:は、粉末をPEMで5 mg / mlに再構成し、LN2 Storage、取り扱い、トラブルシューティングでフラッシュフリーズします注:各アリコートは、4&ordmで氷上に保管された最大12時間使用できます。C、軽い</td></tr><tr><td>チューブリン(ローダミン)から保護する:ブタの脳 &nbsp;紙で使用される略語:R-tubulin</td><td>Cytoskeleton</td><td>TL590M</td><td>Stock Concentration: PEM Storage in PEM 5 mg/ml Storage: Single Use aliquots, -80&ordm;C、凍結融解サイクルを避けてください ストックおよび実験レシピ:は、粉末をPEMで5 mg / mlに再構成し、LN2 Storage、取り扱い、トラブルシューティングでフラッシュフリーズします注:各アリコートは、4&ordmで氷上に保管された最大12時間使用できます。C、光から保護する</td></tr><tr><td>Tween 20 &nbsp;紙で使用される略語:Tween20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J20605。AP</td><td>Stock Concentration: DI H20 Storage: RT</td></tr><tr><td>超遠心グレードのマイクロチューブ &nbsp;紙で使用される略語: Beckman-Coulter Optima Max XP&nbsp;</td><td>ベックマン・コールティア</td><td>343776</td><td><ストロング>保管、取り扱い、トラブルシューティング ノート:</ストロング> 8x34 mm PC</td></tr><tr><td>UV光硬化接着剤 &nbsp;紙で使用される略語:UV接着剤</td><td>Pharda</td><td>SKG-2869</td><td></td></tr></tbody></table>

調整可能なモーター駆動ダイナミクスとメカニクスによるアクチン-微小管複合材料の再構成と特性評価

Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics

半柔軟なアクチンフィラメントと硬い微小管の相互作用ネットワークで構成される複合細胞骨格は、ミオシンIIやキネシンなどのモータータンパク質を使用して再構築および力を生成し、遊走、細胞質分裂、接着、メカノセンスなどの重要なプロセスを推進します。アクチン-微小管相互作用は細胞骨格の多様性と適応性の鍵ですが、ミオシンおよびキネシン活性との相互作用の理解はまだ初期段階です。この研究では、ミオシンIIおよびキネシンモーターによって駆動され、アクチン、微小管、モータータンパク質、およびパッシブ架橋剤の相対濃度によって調整される、能動的再構築と弾道運動を受ける共絡アクチンフィラメントと微小管の調整可能な3次元複合ネットワークを設計する方法について説明します。マルチスペクトル共焦点イメージングを使用して複合材料の再構築と動きを最も効果的に視覚化するための微小管とアクチンフィラメントの蛍光標識のプロトコルも詳しく説明されています。最後に、非平衡構造、ダイナミクス、および力学を定量的に特徴付けるために使用できるデータ解析手法の結果が提示されます。この調整可能な生体模倣プラットフォームを再現して調査することで、運動活動、複合力学、フィラメントダイナミクスの結合が、有糸分裂から分極、メカノ感覚までの無数の細胞プロセスにどのようにつながるかについての貴重な洞察が得られます。

この論文では、共絡アクチンフィラメントと微小管の調整可能な3次元複合ネットワークをエンジニアリングおよび特性評価するためのプロトコルを紹介します。複合材料は、ミオシンIIおよびキネシンモーターによって駆動される能動的再構成および弾道運動を受け、アクチン、微小管、モータータンパク質、および受動架橋剤の相対濃度によって調整される。

The composite cytoskeleton, comprising interacting networks of semiflexible actin filaments and rigid microtubules, restructures and generates forces ...

私たちの研究は、キネシンとミオシンモーターによって駆動され、積極的に調整、再構築、および移動するためにアクチンと微小管の複合材料を設計することにより、細胞骨格再構成の取り組みを細胞の状態を模倣することに重要な一歩を踏み出します。当社の複合材料のダイナミクスと構造は、さまざまなコンポーネントを個別に追加、除去、調整して、収縮、感染、脱落、粗大化、破裂の豊富な相ベースを示すことで正確にプログラムできます。私たちのアプローチは、単一のシステムに異なる基質に作用する複数の力発生コンポーネントを組み込んだ活性物質プラットフォームの設計、作成、および特性評価に広く適用できます。手順を実演するのは、デイジー・アチリロアイエとマヤ・ヘンディヤです。当研究室の学部生研究員。まず、マイクロピペットと滅菌ピペットチップを使用して、滅菌黒色の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに試薬を追加し、微小管のペア間で結合して力を加えるキネシンモータークラスターを形成します。溶液を上下にピペッティングして穏やかに混合します。次に、溶液を摂氏4度で30分間インキュベートし、光から保護します。アクトンフィラメントと微小管の共絡複合ネットワークを準備するには、ヒートブロックを摂氏37度に設定します。試薬を滅菌済みの0.6ミリリットルのマイクロ遠心チューブに追加します。総容量が25マイクロリットルであることを確認してください。溶液をゆっくりと上下にピペットで動かして混合し、光から保護された摂氏37度のヒートブロックに1時間置きます。その後、チューブをヒートブロックから取り外し、マイクロピペットを使用して0.84マイクロリットルの100マイクロモルのファロイジンを穏やかに混合します。光から保護された室温で5〜10分間インキュベートします。焦点イメージング用の活性複合材料を調製するには、試薬を溶液に加え、上下にピペッティングして穏やかに混合します。溶液を3つの10マイクロリットルアリコートに分割し、それらをK、KプラスM、およびネガティブコントロールとしてラベル付けします。2.54マイクロリットルのミオシンをKとMアリコートに加え、2.54マイクロリットルのPEMをKと陰性対照アリコートに加えます。次に、2.5マイクロリットルのキネシンクラスターをKとKに加えてMアリコートに加え、ピペットで上下に混ぜます。次に、同じ手法を使用して2.5マイクロリットルのPEMをネガティブコントロールに追加します。マイクロピペットを使用して、毛細管現象を介して各溶液をサンプルチャンバーの対応するチャネルにゆっくりと流します。ピペットを非常にゆっくりと穏やかに押し下げて、気泡がチャネルに導入されないようにします。各チャンネルの2つの開放端を速乾性エポキシまたはUV硬化型接着剤でシールします。接着剤が完全に乾いたら、チャンネルを顕微鏡上に置き、コンポジットをできるだけ初期の不活性状態に近づけて画像化します。最初にKチャンネルとKプラスMチャンネルをイメージし、次にコントロールチャンネルをイメージします。KおよびKプラスMアリコートにキネシンクラスターを追加してからデータ取得を開始するまでの経過時間に注意してください。アクチンからアクチンまたはAA架橋剤を調製するには、ビオチン-アクチン、ニュートラアビジン、ビオチン、およびPEMをマイクロ遠心チューブに加え、上下にピペッティングして穏やかに混合します。同様に、微小管から微小管またはMM架橋剤の場合は、ビオチンチューブリン、ニュートラアビジン、ビオチン、およびPEMをマイクロ遠心チューブに加え、上下にピペッティングして穏やかに混合します。チューブを熱可塑性天井フィルムで包み、防水シールを作成し、摂氏4度に設定した温度制御されたソニケーターバスの浮遊いかだに90分間入れます。A-A架橋剤複合体をイメージング用のサンプルに組み込むには、試薬をマイクロ遠心チューブに追加します。総容量が25マイクロリットルであることを確認してください。同様に、M-M架橋剤複合体の場合は、スクリーンに示されている試薬をマイクロ遠心チューブに追加します。溶液を上下にピペッティングして混合し、光から保護された摂氏37度のヒートブロックに1時間置きます。その後、チューブをヒートブロックから取り外し、マイクロピペットを使用して0.84マイクロリットルの100マイクロモルのファロイジンを混合します。光から保護された室温で5〜10分間インキュベートし、前に示した手順を繰り返して、共焦点イメージング用のアクティブコンポジットを準備します。アクチンモノファイバーとチューブリン二量体は共重合して、アクチンフィラメントと微小管の共絡絡ネットワークを形成します。ミオシン2本のミニフィラメントとキネシンクラスターがフィラメントを押したり引いたりして、複合材料を定常状態から追い出します。受動架橋は、ビオチン化アクチンフィラメントまたは微小管を結合するためにNeutrAvidinを使用して達成されます。ミオシン2本のミニフィラメント、キネシンクラスター、または両方のモーターは、パッシブ架橋、アクチン-アクチン架橋および微小管-微小管架橋のない複合材料に組み込まれます。ここでは、ミオシン濃度とモルアクチン画分を変化させたミオシン駆動細胞骨格複合材料の2つのカラー共焦点イメージングを示します。粒子画像速度測定は、アクチンミオシン活性が、共絡絡複合材料中のアクチンと微小管の協調収縮ダイナミクスを引き起こすことを示しています。ここでは、異なる矢印の色は、ベクトルフィールドの右側のカラースケールに示されているように、異なる速度に対応します。時間分解微分動的顕微鏡は、アクチンと微小管の両方の崩壊時間と波数の特性を決定するために、時系列の微小管チャネルとアクチンチャネルに対して実行されます。収縮速度は、減衰時間曲線への適合によって決定され、各45分の時系列の全期間にわたってすべてのラグタイムにわたって平均化されます。時間分解微分動的顕微鏡は、アクチンと微小管の45分の活性化時間中の連続した6分間隔の減衰時間を評価することにより、ダイナミクスが時間とともにどのように変化するかを定量化します。アクチンフィラメントおよび微小管の時間分解収縮速度は、対応する減衰時間曲線への適合から決定されます。空間画像自己相関分析は、実験開始時の異なるネットワークの自己相関曲線を実験終了時と比較することにより、活性細胞骨格成分の運動駆動型再構築を定量化します。自己相関曲線の指数適合によって決定された時間分解相関長は、実質的に再構築されるコンポジットと比較して再構築されないコンポジットを示します。キネシン駆動アクチン微小管複合材料の2つのカラー共焦点画像は、架橋剤複合材料が緩く接続された微小管リッチクラスターに再構築することなく、時間の経過とともに製剤依存的な再構築を示しています。アクチン-アクチン架橋はアクチン微小管共局在をサポートし、微小管-微小管架橋はD混合を促進します。示差動的顕微鏡と空間画像自己相関分析は、複合材料の時間変化するダイナミクスと構造に対する架橋および競合するマイシンモーターとキネシンモーターの影響を示しています。細胞の状態をより厳密に模倣するために、研究者は中間フィラメント、他のモーター、およびフィラメントの長さと剛性を制御する結合タンパク質を組み込むことができます。光ピンセット計測測定は、複合力学を特徴付けるために実行することもできます。私たちのアプローチを使用すると、研究者は、細胞骨格に触発された複合材料のダイナミクスと構造を前例のない位相空間全体で正確に調整して、多様な細胞プロセスをエミュレートし、再構成可能なプログラム可能な材料を設計できます。

reconstituting-characterizing-actin-microtubule-composites-with

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

表面付着キネシン モーター蛋白質が色素標識微小管を推進分子シャトルを構築するためのプロトコルを提案します。表面とキネシンの弱い相互作用は、それへのリバーシブルの愛着をできます。これは、動的アセンブリとそのコンポーネントの機能を維持しながら分解を表わすナノスケール...

キネシンを添付可逆的アトス分子シャトルの組み立て

光ピンセットを用いたアクチンフィラメント束中のミオシンアンサンブル機構の探索

ここでは、微小管束を in vitroで...

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

我々は、蛍光顕微鏡法と組み合わせて、個々のアクチンフィラメントをリアルタイムで正確に監視しながら、異なるタンパク質溶液に順次曝露することを可能にする、単純なアクチンフィラメントマイクロ流体アッセイのプロトコルを提示する。...

マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する

この記事では、植物ベースの微小管架橋剤であるMAP65およびPEGをクラウディング剤として使用して、タクトイドの形状の微小管アセンブリを形成するためのプロトコルを提示する。...

微小管タクトイドの自己組織化

このプロトコルでは、蛍光顕微鏡を使用して再構成された膜テザー細胞骨格ネットワークのダイナミクスを研究するための、支持された脂質二重層の形成、および細胞骨格フィラメントとモータータンパク質の添加について説明します。...

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

本稿では、F-アクチン細胞骨格を巨大な単層脂質小胞(リポソームとも呼ばれる)に封入する実験技術と、リポソーム膜の内小葉に皮質生物模倣型F-アクチン層を形成する方法を示す。...

インビトロ 巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

このプロトコルは、 in vitro 全内部蛍光(TIRF)顕微鏡アッセイを使用して動的アクチンおよび微小管を視覚化するためのガイドです。...

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのイン ビトロでの 可視化

このプロトコルは、市販のタンパク質成分を使用してビーズの表面にアクチン彗星を生成する方法を説明しています。このようなシステムは、細胞に見られる突起構造を模倣しており、力生成の生理学的メカニズムを簡単な方法で調べるために使用できます。...

市販タンパク質によるアクチンベースの運動性の再構成

ここでは、精製されたタンパク質から準2次元(2D)エンタングル、架橋、および液晶アクチンアセンブリを調製する方法を紹介します。...

活性アクチンベースアセンブリの収縮性および変形モードのin vitroでのチューニング:2次元活性ネットワークから液晶滴まで

このプロトコルでは、微小管ポリマーの力学を調査するのに適したマイクロ流体デバイスの設計と製造について詳しく説明します。マイクロファブリケーション、自動フロー制御、および計算モデリング技術の合成により、 in...

微小管ポリマーメカニクス研究のためのマイクロ流体工学に基づくアプローチの開発

学ぶアクチン-微小管複合材料の再構成と特性評価。キネシンとミオシンモーターによる駆動ダイナミクスを調整し、細胞環境を模倣するアクティブマタープラットフォームの設計と解析手法を解説します。

調整可能なモーター駆動ダイナミクスとメカニクスによるアクチン-微小管複合材料の再構成と特性評価

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