Name: 蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぶ FRETとFRAPを組み合わせた蛍光技術で生細胞内の力感受性タンパク質ダイナミクスを測定する方法。ビンキュリンなどの機械応答性タンパク質の挙動を分子スケールで解析し、メカノバイオロジー研究に活用できます。

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この作品は、アメリカ心臓協会 (16GRNT30930019)、国立衛生研究所 (R01GM121739-01) ブレントン ホフマン博士と国民に授与されるからの補助金だけでなく、国立科学財団のキャリア賞 (NSF-CMMI-14-54257) によって支えられました。科学財団大学院研究奨学金キャサリン ・ ローゼンバーグに授与します。内容は著者の責任と NSF や NIH の公式見解を必ずしも表さない。

著者が明らかに何もありません。

フレット FRAP メソッドを力感受性タンパク質ダイナミクス、生きた細胞の内部を直接調べることは困難されているプロパティの直接計測できます。分子の負荷をタンパク質ダイナミクスの感度力送信機またはトランスデューサーとして蛋白質の機能に不可欠です。読み込みが内部的に生成された両方の伝送に必要なして生化学的検出信号にそれらの力の変換、メカノトランスダクションと呼ばれる外部から適用力、mechanotransmission と呼ばれます。しかし、負荷の変化蛋白質バインドされたまま期間に影響することができます、したがって、短い時間でタンパク質費やしてベアリング荷重、力は、他の蛋白質に送信または生化学的検出信号に導入し、感じた少ないチャンス。フレット FRAP メソッド広範な細胞のコンテキスト内でアクセスされる敏感なダイナミクスの分子スケールの測定が可能な分子・細胞レベルの間のギャップを橋渡しします。さらに、生化学的または機械的に細胞内や細胞外の環境の摂動しながら撮影にこれらの測定が可能です。この手法は、様々 な細胞内構造や細胞外のコンテクストで機械の状態で蛋白質の調査を可能にする任意のフレット ベース張力センサーに適用されるべき。
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細胞外の環境は、細胞のふるまいを指示する生化学的および物理的な手がかりの豊富なソースです。特に、微小環境の物理的性質はキーの細胞などの細胞の増殖、移行、および分化1,2,3,4を仲介することができます。制御の仕組みの不全、癌5、アテローム性動脈硬化の6、および線維症7などの適切な治療をしていない多くの病気に重要なコンポーネントです。細胞が物理的な刺激を生化学的に検出可能な信号に変換する方法を完全に理解、プロセス メカノトランスダクションと呼ばれる、力の伝達、細胞の内外の両方に関わる分子メカニズムの解明が必要ですし、複数細胞内構造体。
細胞レベル下の構造の中タンパク質は常に裏返し;バインドとバインドのパートナー8との相互作用の強さに基づいてバインド解除。物理的な距離間で正常に送信される力の蛋白質蛋白質の相互作用、タンパク質の代謝回転が維持し、そのバインディング パートナー9に力を伝達できるほど低速である必要があることを意味の切れ目のない連鎖があります。相互作用はしばしば異なる条件10,の下で非連結状態に移行できるバインド済み状態として概念化蛋白質蛋白質の相互作用は一般のいくつか非共有結合性タンパク質のドメイン間をで構成、11します特定の蛋白質蛋白質の相互作用の力がなし「理想的な絆」として知られている相互作用の寿命に影響を及ぼす、「スリップの絆」として知られている相互作用の有効期限を短縮または相互作用の寿命を延ばすことが可能だ。、「キャッチ絆」10として知られています。したがって、蛋白質負荷と我々 は敏感なダイナミクスとして参照する蛋白質ダイナミクスの複雑な関係があります。
結合ダイナミクスに及ぼす荷重の解明、分子レベルで非常に有益な実験の数を行った。孤立したタンパク質やタンパク質の原子間力顕微鏡光ピンセットや磁気ピンセットなど操作技術の断片を使用して、これらの研究は関連性の高いいくつかの敏感なタンパク質間相互作用を実証しています。タンパク質11,12。両方インテグリン13とカドヘリン14、膜貫通タンパク質細胞マトリックスと細胞間の相互作用をそれぞれ形成のために重要であるロードによるダイナミクスの変化を示しています。細胞内ビンキュリンが15と α-カテニン16をタリンと両方に力依存的に募集し、アクチン17, ストレスファイバー (FAs)、アドヘレンスジャンクション (AJs ビンキュリンの重要な役割を示すキャッチ結合を形成することができます。) 負荷の下で。単一分子の研究特定タンパク質-タンパク質相互作用の分離を可能にする、彼らは細胞の環境の複雑さを考慮しない、明確な結果をもたらします。
画期的な実験実証 FAs、AJs を含む、いくつかの細胞内構造を受容が内部的に生成または外部から適用荷重18,19への応答で強化されたアセンブリを展示、 20,21,22。さらに、いくつかの理論的モデルは、力感受性タンパク質ダイナミクス23,24,25機械アセンブリを運転できることを示唆しています。生きた細胞内でこれらの敏感なダイナミクスを調べるいくつかの間接的なアプローチが取られています。縛ると関連技術は、細胞26,27,28,29タンパク質の動態を測定するため比較的単純な方法論を提供します。ただし、蛋白質負荷の測定はより制限されています。典型的なアプローチは、タンパク質の動態と全体的な細胞収縮8,30,31を減らすために使用される細胞骨格阻害剤への露出なしのセルを比較することです。概念的には、これは高負荷と低負荷の状態の比較です。ただし、いずれかの状態で蛋白質間で負荷の定量化がないと阻害剤, F-アクチン フィラメントに沿ってキー結合部位のような損失の生化学的な効果を意図しない可能性があります。別のアプローチは、FAs に固有は、分子の負荷を概算し、FA32内の単一蛋白質の動態との関係を調べる牽引力顕微鏡を用いた FA による基板上の合計の力運動を測定してきました。このアプローチは、合計の力の定量化により、分子固有の情報は提供されません。FAs はロード33を耐えることができる多くの以上の 200 の異なるタンパク質から成っています。したがって、可能性のある FA の力の合計出力の測定力伝送経路の複数の可能性が不明瞭、特定のタンパク質では負荷の測定を確実に提供されません。
フレット ベース張力センサーの出現により直接、メカノバイオロジーで従来のアプローチとは異なり細胞34,35,36生活の中の特定のタンパク質によって発生する負荷の測定。タンパク質ダイナミクスの FRAP ベース メジャーとフレット ベース張力検出器を組み合わせたプロトコルを紹介します。我々 はフレット FRAP としてこの技法を参照してください。この方法は、蛋白質負荷と細胞 (図 1) の力感受性タンパク質ダイナミクスの評価をこのように蛋白質の原動力の同時測定できます。既に、フレット FRAP テクニックは機械的リンカー蛋白質ビンキュリン37の敏感なダイナミクスの研究に適用されています。張力検出器は、様々 な細胞内構造に関連している多数の蛋白質のために開発されています。たとえば、センサーはビンキュリン タリンと34 38,39 FAs、カドヘリンと AJs40,41,42, 複雑な核のバイオスで nesprin でカテニン発現で開発されています。43α-アクチニン44フィラミン36骨格と、糖衣45、他の中の MUC 146。同様に、FRAP は一般的に使用される手法は、焦点接着斑8,31、単接合47、アクチン皮質26、および核48内の機械受容蛋白質で使用されています。今後は、これらの既存のセンサーまたは新しくフレット FRAP 技術はいずれかに広く適用する必要がありますさまざまな細胞レベル下の構造およびコンテキストの敏感な現象の測定を可能にするセンサーを開発しました。この終わりに向かってフレット FRAP 手法適用これらの異なるシステムでの実装の詳細、一般化されたプロトコルを提供します。うまくいけば、これはさまざまな力の伝達を調節する、細胞の挙動を媒介に様々 な機械受容タンパク質の機能解明の実験になります。

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>60x 対物レンズ NA1.35</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Automated Stage</td><td>Prior Scientific</td><td>H117EIX3</td><td></td></tr><tr><td>カスタムダイクロイックミラー</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>T450/514rpc</td></tr><tr><td>カスタムmTFP1 蛍光フィルター</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET485/20m</td></tr><tr><td>カスタムmTFP1励起フィルター</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET450/30x</td></tr><tr><td>カスタムVenus 励起フィルター</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET514/10x</td></tr><tr><td>DMEM-gfp ライブセル可視化培地</td><td>サファイア</td><td>MC102</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ モディファイド イーグルズ ミディアム&nbsp;</td><td></td><td></td><td>L-グルタミンと重曹</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン、Human</td><td>Corning</td><td>47743-654</td><td></td></tr><tr><td>FRAPPA キャリブレーション</td><td>スライド アンドール</td><td></td>、<td>FRAPPA</td></tr><tr><td>ユニット FRAPPA システム、515 nm レーザー</td><td>アンドール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス底フルオロ皿</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ</td><td>FD35</td><td></td></tr><tr><td>HEK293-T細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>臭化ヘキサジメトリン・ポリブレン</td><td>Sigma アルドリッチ</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>高グルコース・ダルベッコ修正イーグルス・ミディアム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>倒立蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>JMP Proソフトウェア</td><td>SAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda 10-3 電動フィルターホイール</td><td>サッター機器</td><td>LB10-NW</td><td></td></tr><tr><td>LambdaLS アークランプ 300W オゾンフリー キセノンバルブ</td><td>サッター機器</td><td>LS/OF30</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB ソフトウェア</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph for Olympus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Humidification System</td><td>Bioptechs 130708</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ Cell Sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>Objective Heater Medium</td><td>Bioptechs</td><td>150819-13</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G 封筒 プラスミド</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>pRRL ベクター</td><td></td><td></td><td>Dr. Kam Leong (コロンビア大学)</td></tr><tr><td>psPax2 パッケージング プラス</td><td>ミド Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 カメラ</td><td>浜松ホトニクス</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XT / XF遠心分離機</td><td>サーモフィッシャー</td><td>75004505</td><td></td></tr><tr><td>安定Zステージウォー</td><td>マーBioptechs</td><td>403-1926</td><td></td></tr>金<tr><td>星放出</td><td>フィルターSemrock</td><td>FF01-571 / 72</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

細胞感覚し、機械的刺激をメカノトランスダクションと呼ばれるプロセスで生化学的に検出可能な信号に変換することによって、環境内の物理的な手がかりに対応します。メカノトランスダクションの重要なステップは、外部と内部の環境の間の力の伝達です。強制的に送信する、一連の蛋白質蛋白質の相互作用によって作成された持続的な切れ目のない物理的なリンケージがあります。特定の蛋白質蛋白質の相互作用の機械的負荷いずれかがない場合の相互作用に及ぼす影響、相互作用の高速化解除につながる、あるいは安定の相互作用。どのように分子の負荷についての生きている細胞の蛋白質の転換は順番メカノトランスダクションにおけるその役割の解明蛋白質の力学状態に関する貴重な情報を提供できるが決まります。力感受性タンパク質ダイナミクスを測定するための既存の技術か蛋白質負荷の直接測定を欠いている、携帯電話のコンテキストの外部で実行する測定に依存します。ここでは、生きた細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定を可能にする (フレット FRAP) フォトブリーチング法後蛍光共鳴エネルギー伝達蛍光回復のためのプロトコルについて述べる。この手法は、潜在的力感受性タンパク質ダイナミクス細胞レベル下の構造の様々 な異なる種類の細胞の研究を促進する任意のフレット ベース張力センサーに適用されます。

フレット FRAP は、2 つの蛍光技術の組み合わせから成っている、フレットと縛る。我々 は蛋白質負荷の影響に焦点を当てて、フレット ベース張力センサー34,46を使用しました。これらのセンサーはセンシング モジュール mTFP1 と flagelliform リンカー (図 1 a) によって接続されている VenusA206K などの 2 つの蛍光タンパク質から成る緊張にしばしば基づいています。タンパク質の頭と尾のドメイン間、モジュールを配置すると、タンパク質全体の負荷を測定することが可能です。フレットのデータを分析する受容体チャネルで撮影した画像を使用張力センサー ローカリゼーションを評価してこの信号としての濃度はフレット (図 1 b) とは無関係です。クーラーの色に向かって FRET 効率の減少を示す蛋白負荷の増加、赤の範囲で ...

ここでは、プロトコルを提案フェルスター共鳴の同時使用のため力感受性の測定を有効にするタンパク質ダイナミクスを測定するため退色後蛋白質負荷と蛍光の回復を測定するエネルギー転送ベースのテンション センサー細胞内蛋白質の原動力。

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

この方法は、細胞内だけでなく、細胞とその環境の間で力がどのように伝達され、感知されるのかなど、メカノバイオロジーの分野における重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、タンパク質が生きている細胞のネイティブコンテキスト内の機械的な力にどのように反応するかに関する分子スケール情報へのアクセスを可能にすることです。この方法は、特に、ビンクリンの焦点接着タンパク質の研究に適用されているが、それはまた、タリン、カドヘリンやヌレスミンなどの他の機械的に敏感なタンパク質に適用することができます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、適切なイメージング設定は困難であるが、解析の成功のために必要であるため、重要です。テキストプロトコルで詳述されているように、目的のセルタイプにおけるテンションセンサ構成体の安定した発現からこの手順を開始します。細胞の播種のための基質を準備するために、4つの35ミリメートルガラス底の皿を取得する。細胞培養フードで働く、15ミリリットルの円錐形の管で、滅菌リン酸緩衝生理食塩水、またはPBSで1ミリリットルフィブロネクチンあたり10マイクログラムの4ミリリットルを作る。チューブを1回軽く反転させて混合し、溶液を細胞培養フードに5分間置きます。その後、各ガラス底皿にフィブロネクチン溶液の1ミリリットルをピペット。フィブロネクチン溶液を室温で1時間、摂氏4度で一晩皿に置いておきます。次にフィブロネクチン溶液を吸引し、PBSで一度リンスする。細胞が播種の準備ができるまで皿にPBSの1ミリリットルを残します。細胞を数えた後、種子30,000細胞を各フィブロネクチンコーティングガラス皿に、最終体積1.5ミリリットルの適切な完全な培地を有する。播種後4時間細胞を広げます。2時間の広がりで、成長培地を吸引し、イメージングメディアで一度リンスする。1.5ミリリットルのイメージングメディアを残します。キャリブレーションを開始する前に、テキストプロトコルに記載されているように、顕微鏡を温めておいてください。FRAP レーザーを調整するには、まずレーザー構成ウィンドウを開きます。サンプルへのレーザー露出に適した FRAP イルミネーション設定に照度設定を設定します。次に、レソクザルフルオロフォアのみをイメージングする場合に適した照明設定に「照明」設定を設定します。[座標系設定]で、キャリブレーションする目的を選択します。[手動でキャリブレーション ポイントをクリックする] をオフにし、[キャリブレーション時に画像を表示する] をオンにします。ドウェル時間を10,000マイクロ秒に、パルス数を100に設定します。次に、ガラススライドとカバースリップの間に密封されたエチジウム臭化物で作られたキャリブレーションスライドを、カバースリップ側を下にしてステージアダプタに配置します。アクセクサ照明の設定を使用して、最も明るい信号を持つ焦点面として識別可能なスライドの表面に焦点を合わせます。コーティングの小さな欠陥は集中を助けるために目に見える。画像撮影平面を横切って、蛍光が均一な領域にスライドを移動します。最初のキャリブレーションの設定を作成するか、以降のキャリブレーションの場合は[設定を更新]をクリックします。ソフトウェアは、自動的に漂白し、漂白点の位置を検出し、キャリブレーションプロセスを初期化します。均一に分布し、焦点を合わせる必要がある漂白ポイントの3つによって3つ星のグリッドとなる最終的な画像を評価することによって、キャリブレーションを成功させます。今後の参照用にキャリブレーションイメージを保存します。キャリブレーションスライドを取り外し、安全に保管します。キャリブレーションは各実験を開始する前に実行する必要がありますが、サンプル間で実行する必要はありません。ライブ細胞イメージング用の顕微鏡設定を準備し、好ましくは加熱された段階と目的、ならびに二酸化炭素制御を行う。20分間平衡化します。次に、細胞の生成サンプルの1つを、張力センサーを発現させるものを顕微鏡ホルダーに入れイメージングします。セルを 10 分間平衡させます。画像化された細胞の健康を確保するために、画像の部屋の37°Cで温度を維持する。蠕動ポンプを使用して、pHを維持するために1分間に15ミリリットルでサンプル上に加湿された5%の二酸化炭素を通過させます。多次元集録(MDA)ツールを開き、異なるフィルタセットを含むFRETイメージングパラメータで設定します。この MDA を、MDA_FRET_dateという名前で実験フォルダーに保存します。異なるフィルタセット、タイムラプス設定、および漂白前取得後にレーザーをパルスするジャーナルを含むFRAPイメージングパラメータを備えた別のMDAを設定します。この MDA を、MDA_FRAP_dateという名前で実験フォルダーに保存します。画面上部のツールバーで、[ジャーナル]、[記録の開始] の順に選択します。MDA ウィンドウを開き、MDA_FRET_date状態をロードして[取得]を押します。次に、MDA_FRAP_date状態をロードし、取得を押します。取得の最後に、画面上部のツールバーで[ジャーナル]、[記録の停止]を選択します。このジャーナルをFRETFRAP_dateの名前で実験フォルダに保存し、ツールバーに追加して簡単にアクセスできます。MDA ウィンドウを閉じます。[取得、最小露出時間と中立密度フィルターで取得]の下の画像取得を使用してサンプルをナビゲートし、対象セルを識別します。デバイス、フォーカスに移動して、連続オートフォーカスを設定します。正しいイメージング平面に到達するまで、サンプルに手動で焦点を合わせます。[継続的なフォーカスの設定] をクリックし、システムが調整されるまで待ちます。システムが調整されたら、[連続的な焦点を開始]をクリックします。次に、関心のある構造に明確な局在化を有する張力センサを発現するセルを見つけ、画像をスナップします。対象の長方形の領域(ROI)を描画して、漂白する場所をハイライトします。この ROI の場所を保存します。次に、FRET イメージの取得を開始し、続いて FRAP タイムラプスの初期化を開始する FRETFRAP_date ジャーナルを初期化します。10~15個の画像セットが取得されるまで、これらの手順を繰り返します。次に、テキストプロトコルで詳述されているように、FRET-FRAPデータを分析します。ここに示されているビンクリン張力センサのFRETイメージングの代表的な結果は、焦点接着を分離するためのセグメンテーションおよびマスキングに続く。ビンクリン負荷の容量変化は、細胞全体に見ることができる。FRAPイメージングおよび分析は、焦点接着安定性の影響を受ける可能性があります。撮像期間中に急激に転位する焦点接着は、正確に追跡することが困難な場合があります。多くの場合、これは不連続性を含む FRAP カーブによって示され、解釈不能です。野生型のビンクリンの場合、タンパク質負荷と回転率の間には逆相関があり、ビンクリンが力によって安定化されることを示す。タリンへの結合を起させるビンクリンに変異を導入すると、その相関の逆転をもたらし、タリンに結合できないビンキュリンが力によって不安定化することを示す。この手順を試みる間、サンプルを適切に準備し、細胞が内因性レベルでセンサーを発現していることを確認し、イメージングパラメータを慎重に選択することを忘れないでください。この手順に従って、免疫蛍光、細胞スケールダイナミクスの測定、または様々な阻害剤を有する困難な細胞などの他の方法は、目的のタンパク質が他の細胞内成分とどのように相互作用するかなどの追加の質問に答えて力に対する応答を調整するために行うことができる。

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