Name: 支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: 学ぶ 膜結合型アクチンミオシンネットワークの再構成法。蛍光顕微鏡を用いて細胞骨格ダイナミクスを観察し、膜タンパク質複合体と動的アクチン皮質の相互作用を解明する手法です。

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この研究は、AXA研究基金と、DVKのWarwick-Wellcome Quantitative BioMedicine Programme(Wellcome ISSF、RMRCB0058)、ABおよびSTのNCBS-TIFR、SMのWellcome-DBTマルグダルシフェローシップ(IA/M/15/1/502018)の支援を受けました。 DVKはまた、仮想ネットワーキングイベント「分子からメソスケールまでの多成分細胞骨格ネットワークを理解する上での課題」を可能にしてくれた生物物理学会に感謝したいと思います。 これは、このプロトコルコレクションの作成に貢献しました。

<ol><li>Köster, D. V., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+and+the+plasma+membrane%3A+Inextricably+intertwined%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined.</a> Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).</li>
<li>Rao, M., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+organization+of+membrane+constituents+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Active organization of membrane constituents in living cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid+bound+actin+meshwork+organizes+liquid+phase+separation+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes.</a> eLife. 3, 01671(2014).</li>
<li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratification+relieves+constraints+from+steric+hindrance+in+the+generation+of+compact+actomyosin+asters+at+the+membrane+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex.</a> Science Advances. 6 (11), (2020).</li>
<li>Köster, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+dynamics+drive+local+membrane+component+organization+in+an+in+vitro+active+composite+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+MACs+%28minimal+actin+cortices%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The design of MACs (minimal actin cortices).</a> Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).</li>
<li>Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+actomyosin+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile actomyosin arrays.</a> Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).</li>
<li>Mosby, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+filament+dynamics+in+actin+networks+revealed+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).</li>
<li>Seara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy+production+rate+is+maximized+in+non-contractile+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin.</a> Nature Communications. 9 (1), 4948(2018).</li>
<li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7, 12615(2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> eLife. 2, 00116(2013).</li>
<li>Ditlev, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+composition-dependent+molecular+clutch+between+T+cell+signaling+condensates+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin.</a> eLife. 8, 42695(2019).</li>
<li>Banjade, S., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transitions+of+multivalent+proteins+can+promote+clustering+of+membrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors.</a> eLife. 3, 04123(2014).</li>
<li>Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+membrane+diffusion+modulated+by+a+minimal+actin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex.</a> Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).</li>
<li>Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+domain+organization+by+a+biomimetic+contractile+actomyosin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex.</a> eLife. 6, 24350(2017).</li>
<li>Block, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+at+lipid+membranes%3A+A+comparison+of+hydrodynamic+models+describing+and+experiments+quantifying+diffusion+within+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers.</a> Biomolecules. 8 (2), 30(2018).</li>
<li>JoVE, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Methods+Collection.+In+vitro+reconstitution+of+cytoskeleton+networks+for+biomaterials%2C+biophysics+and+active+matter+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+muscle+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of muscle actin.</a> Methods in Enzymology. 85, 164-181 (1982).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+purification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Myosin purification and characterization.</a> Methods in Cell Biology. 24, 331-371 (1982).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WH2+and+proline-rich+domains+of+WASP-family+proteins+collaborate+to+accelerate+actin+filament+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).</li>
<li>Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+ezrin+actin+binding+domain+to+probe+its+interaction+with+actin+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro.</a> PLoS One. 10 (4), 0123428(2015).</li>
<li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+STED-FCS+reveals+spatiotemporal+heterogeneity+of+lipid+interaction+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells.</a> Nature Communications. 5, 5412(2014).</li>
<li>Selden, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+programmed+cell+adhesion+with+membrane-anchored+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).</li>
<li>Seu, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+treatment+on+diffusion+and+domain+formation+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+equation+to+extract+diffusion+coefficients+from+confocal+FRAP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data.</a> Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+computational+framework+for+D%28t%29+from+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching+data+reveals+various+anomalous+diffusion+types+in+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes.</a> Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).</li>
<li>Lorén, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+photobleaching+in+material+and+life+sciences%3A+Putting+theory+into+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).</li>
<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).</li>
<li>Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+and+control+of+Supported+lipid+bilayer+formation+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy.</a> ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).</li>
<li>Lin, W. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membrane+formation%2C+characterization%2C+functionalization%2C+and+patterning+for+application+in+biological+science+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).</li>
<li>Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+solid-supported+lipid+bilayers%3A+An+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view.</a> Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).</li>
<li>Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+supported+membranes+on+topographically+patterned+polymeric+elastomers+and+their+applications+to+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing.</a> Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).</li>
<li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236(2022).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e63332(2021).</li>
<li>Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurrell%2C+M+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2022).</li>
</ol>

著者は宣言する利益相反はありません。

このプロトコルは、細胞の膜-皮質界面を研究するための実験を設計するための汎用性の高いプラットフォームと出発点を提供します。重要なステップは、清潔なスライドガラスの調製、効率的なSUV形成のための新鮮な脂質の使用(どちらもSLBの品質に影響を与える)、および動的アクチンフィラメントの再編成のための新たにリサイクルされたミオシンIIタンパク質の使用です。長時間にわたって動態をイメージングする場合、脱酸素システム(例えば、プロトカテク酸およびプロトカテク酸3 4-ジオキシゲナーゼ5,31)を組み込むことが非常に重要である。
オープンチャンバー設計により、脂質の流れを誘発することなく、既存のシステムに成分を順次追加することができます。これは、リポソーム36内に封入されたタンパク質を使用する、一般的に使用される閉鎖チャンバーアプローチまたは作業よりも重要な利点となり得る。タンパク質誘発膜変形などの逆効果は、ガラス吸着脂質二重層では研究できません。
脂質二重層は、広範囲の脂質組成物で形成することができる。それは、親水性ガラス表面への脂質小胞の吸着から始まり、その後、表面-小胞および直接小胞-小胞相互作用による自発的な小胞破裂、または吸着された小胞が臨界被覆に達し、その後、小胞のごく一部が破裂し、活性エッジを形成し、最終的に二重層形成につながる32.ガラス以外にも、様々な基板を使用して、担持脂質二重層を形成することができ、例えば、マイカ(例えば、原子間力顕微鏡用)、軟質基板(例えば、ポリ−ジメチル−シロキサン)、ポリマークッション33、34、35、電子顕微鏡グリッド14の孔間にまたがる。液滴界面二重層は、安定で自立した脂質二重層36を作成するための別の興味深い方法である。小胞またはエマルジョンへのアクトミオシンネットワークの包含は、細胞様幾何学的形状37,38においてこの最小系を研究するための非常に強力な方法であり、これは他の箇所で詳細に説明されている39。

生きている動物細胞の原形質膜は、隣接するアクチン細胞骨格と絶えず相互作用し、そしてそれらが一緒になって多数の細胞機能を果たす活性複合材料を形成する1,2。この脂質膜-アクチン界面のプロセスを研究するには、支持された脂質二重層(SLB)上の細胞骨格ネットワークの再構成が非常に有用であることが証明されています。この最小限のシステムアプローチにより、細胞骨格ネットワーク成分と脂質組成を正確に制御できます。巨大な単層小胞の自立型脂質膜と比較して、SLBの平面形状により、超解像3,4、全反射蛍光(TIRF)5,6,7、干渉散乱8などの最先端の顕微鏡技術を効率的に使用できます。 細胞骨格ネットワークの空間構成とダイナミクスを研究する。TIRFは、バックグラウンドシグナルに寄与する溶液中の未結合標識分子のシグナルが最小限であるため、蛍光標識成分に対して最高のコントラストを提供します。
ここでは、活性な準2Dネットワークの物理と膜組織への影響を研究するために現場で広く使用されている、支持された脂質二重層につながれたアクトミオシンネットワークの形成のための基本的なプロトコルについて説明します9,10,11および膜組織3,5,12,13,14,15,16(図1).このアプローチは、アクチンベースのネットワークに限らず、微小管、中間フィラメント、または混合された性質の複合ネットワークを探索し、表面感度顕微鏡法を使用して脂質膜タンパク質と細胞骨格成分の間のさまざまな相互作用を研究するためにも簡単に適応できます。
このプロトコルに焦点を当て続けるために、アクチンおよびミオシンタンパク質の精製および標識の詳細な説明、またはアクトミオシンネットワークの収縮性と構成を調整および制御する方法に関する詳細は除外しました。JoVEメソッドコレクション、生体材料、生物物理学、活性物質研究のための細胞骨格ネットワークのIn vitro再構成17でこれと一緒に公開されている他のプロトコルを参照する必要があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig01.jpg"> 図1: in vitro アクチン膜活性複合システムの概略図。 バイオレンダーで作成されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>1,2 ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N- (リサミンローダミン B スルホニル)</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>810158</td><td>16:0 RhoPE</td></tr><tr><td>1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3- [(N-(5-アミノ-1 カルボキシペンチル) イミノジ酢酸) サクシニル] (ニッケル塩)</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>790404</td><td>DGS-NTA-Ni2+</td></tr><tr><td>1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン</td> ア<td>バンティ極性脂質</td><td>850375</td><td>DOPC</td></tr><tr><td>1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン</td><td>Avanti 極性脂質</td><td></td><td>850355 DPPC</td></tr><tr><td>琥珀色のガラスバイアル</td><td>サーモフィッシャー</td><td>B7990-2A</td><td></td></tr><tr><td>ATP 二ナトリウム塩</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor セルチャンバー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>バスソニケーター</td><td>GT ソニック</td><td>1860QTS</td><td></td></tr><tr><td>β-カゼイン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>12135</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>650471 Electron Microscopy Sciencesから、50980296</td></tr><tr><td>カバー スリップ、#1、直径 25 mm、ゴールド シール</td><td>ハーバード デバイス</td><td>64-0705B</td><td></td></tr><tr><td>カバー スリップ、#1、40x22 mm、ゴールド シール</td><td>サーモフィッシャー</td><td>48404-031</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>サーモフィッシャー</td><td>G12635</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Himedia</td><td>MB130</td><td></td></tr><tr><td>ガスタイトガラスシリンジ、リムーバブル針付き、鈍い、ボリューム 10 & マイクロ;L、100 &micro;L、500 &micro;L</td><td>ハミルトン</td><td>1700 シリーズ</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma Analytics</td><td>Z805939</td><td>洗浄液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Himedia</td><td>RM380</td><td></td></tr><tr><td>KaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G13405</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ThermoFisher</td><td>G13305</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G26708</td><td></td></tr><tr><td>脂質押出機</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>61000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>G15535</td><td></td></tr><tr><td>Microtip</td><td>sonicator Sonics</td><td>VC750</td><td>3 mm 先端径</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>ThermoFisher</td><td>G15955</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Himedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G15825</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G27815</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti Eclipse TIRF顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td> 偏<td>光保存光ファイバーを介してAgilentモノリシックレーザーコンバイナーMLC400に接続されたTIRFユニット付き 100X、1.45 NAニコンオイル対物レンズ、2台の512 x 512ピクセルEMCCDカメラ(Photometrics Evolve 512) 100X、1.45 NA Nikon Oil Objective with two 512 x 512-pixel EMCCD cameras (Photometrics Evolve 512)</td></tr> <tr><td>NOA88</td><td>Norland Products</td><td>8801</td><td></td></tr><tr><td>PTFE コーティングピンセット スタイル #2A</td><td>構造プローブ</td><td>0S2AT-XD</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵微量遠心機</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>ThermoFisher</td><td>G15925</td><td></td></tr><tr><td>UVイルミネ</td><td>ーターNovascan</td><td>PSD PRO-UV</td><td>には真空とO2の供給が必要です</td></tr></tbody></table>

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

生細胞の表面は、原形質膜とその下にあるアクチン皮質との相互作用から生じる多数の細胞プロセスのための多用途の活性プラットフォームを提供します。過去数十年の間に、アクチンフィラメントネットワークと組み合わせた支持脂質二重層に基づく再構成された最小システムは、膜テザーアクチンネットワークの基本的なメカニズムと結果を解明し、個々の膜関連タンパク質の機能を研究するのに非常に役立つことが証明されています。ここでは、膜結合性アクチン結合タンパク質を介して結合した流体支持脂質二重層から、全反射蛍光顕微鏡で容易に観察できる動的アクチンフィラメントおよびミオシンモーターからなるこのような活性複合システムを in vitro で再構成する方法について説明します。オープンチャンバー設計により、システムを段階的に組み立て、リンカータンパク質濃度、アクチン濃度、アクチンフィラメント長、アクチン/ミオシン比、ATPレベルなどの多くのパラメータを体系的に制御できます。最後に、システムの品質を制御する方法、一般的に発生する問題を検出してトラブルシューティングする方法、および生細胞表面と比較したこのシステムのいくつかの制限について説明します。

表現のために、ここでは、光退色後の第1の画像( 図3Aのt = 0sでの画像)からの典型的なポストブリーチプロファイルと、次の関数28 ( 図6Aを参照)への適合を示します。
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq04.jpg" style="margin: auto;">
この曲線に当てはめることによって計算されたre(23.94μm)の値は、ステップ2.8.4で計算されたreと非常によく似ています。 (23.24 μm)。ここで、Kは、F0から直接推定できる漂白深さパラメータである(ステップ2.8.4で説明)。同様に、図 6B は、リカバリー・プロファイルと、以下の機能28 への適合を示しています。
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq05.jpg" style="margin: auto;">
拡散係数の適合値は1.34 μm 2/sであり、ステップ2.8.4の式で計算される1.39 μm2/sの値とほぼ一致する値であることがわかります。ここで、MFは、回復する漂白集団の割合を表す脂質二重層の可動画分を表す。脂質アンカー分子の移動度は、もちろん、脂質組成およびその物理的状態(液相またはゲル相)に依存する。DOPCベースの脂質膜を用いた実験では、移動度は&gt;1 μm2/sでなければならず、可動画分は良好な脂質二重層を示すために0.9以上でなければなりません。二重層の品質と移動性をすばやくテストするために、手動のフィッティングフリー方法を使用することをお勧めします。フィット方法は、多くのFRAPカーブの解析を自動化する場合に役立ちます。さらに、システム内の拡散を体系的に特徴付けるために、より洗練されたFRAP実験を実行したい場合は、モデルのフィッティングと実験計画の潜在的な落とし穴について、Lorénら30のこのレビューを読者にお勧めします。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig06.jpg"> 図6:脂質二重層の拡散係数の定量化。 (a)フォトブリーチング後の第1画像のラインプロファイル( 図3Aのt=0s)とその式4への適合により、有効ブリーチ半径を算出した。(b)漂白領域の回復プロファイルとその適合を式5に適合させ、拡散係数と移動分率を算出する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
TIRF顕微鏡によって画像化された支持された脂質二重層上に連結されたアクトミオシンネットワークの動的アセンブリおよび組織を示す上述の実験の典型的な結果を、図7および補足ビデオS1に描く。
図7 は、リンカータンパク質、F-アクチン、およびミオシン-IIの画像モンタージュを示す。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig07.jpg"> 図7:収縮性アクトミオシンの流れは、膜-アクチンリンカータンパク質HYEの局所クラスタリングを促進します。 HYEおよびF-アクチンを含むSLBにミオシンIIを添加した場合のHYE(YFPタグ付き)、アクチンフィラメント(Atto-635マレイミドで標識)、およびミオシンIIフィラメント(Atto-565マレイミドで標識)のTIRFスナップショット。時間は上部に示されています:0分は蛍光筋フィラメントがTIRFフィールドに現れ始める直前です。HYEおよびF-アクチンは、ミオシン添加前(0分)に脂質二重層上に均一に分布している。ミオシン活性は収縮性アクトミオシン流を誘導し、定常状態(15分)でアスター様構造に出現し、結合膜成分(HYE)の局所的なクラスタリングを促進します。一番下の行は、異なる時点でのアクチンとミオシンの組織を示すアクチン(黄色)とミオシンII(マゼンタ)の画像のマージです。これらのモンタージュの作成に使用された画像は、バックグラウンド信号、不均一な強度パターン、および並進運動についてフィジーで補正されました。スケールバー= 10μm。詳細については、「 補足ビデオ S1」を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>バッファ名</td>
			<td colspan="2">組成</td>
		</tr><tr><td>脂質再水和バッファー</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5% スクロース, pH 7.5</td>
		</tr><tr><td>SLB フォーメーション バッファ</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5-6</td>
		</tr><tr><td>SLB ストレージ バッファ</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>タンパク質希釈バッファー</td>
			<td colspan="2">20 mM HEPES、100 mM KCl、1 mM TCEP または DTT、pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>1X MEまたはアクチンイオン交換バッファー</td>
			<td colspan="2">50 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.2 (4°Cで保存)</td>
		</tr><tr><td>1X KMEHまたはアクチン重合バッファー</td>
			<td colspan="2">50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>100 mM ATP ストック</td>
			<td colspan="2">100 mM ATP 二ナトリウム塩、50 mM トリス、50 mM NaCl、5 mM MgCl2、2 mM EGTA、pH 7.5 (-20°Cで保存)</td>
		</tr><tr><td>2x ターゲットバッファ</td>
			<td colspan="2">2x KMEH、2 mg/ml BSA、2mM ATP、5mM TCEP (4°Cで保存)</td>
		</tr><tr><td>Gバッファ</td>
			<td colspan="2">2 mM トリス、0.1 mM CaCl2、0.2 mM ATP、0.5 mM TCEP、0.04 % NaN3、pH 8 (4°Cで保存)</td>
		</tr><tr><td>ミオシンIIバッファー</td>
			<td colspan="2">500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM ヘペス, pH 7.0</td>
		</tr><tr><td>ゲル濾過クロマトグラフィーバッファー</td>
			<td colspan="2">50 mM トリス塩酸塩, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0.1% トゥイーン-20, pH 7.5</td>
		</tr><tr><td>キャッピングタンパク質保存バッファー</td>
			<td colspan="2">10 mM トリス·Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7.5, 20% グリセロール</td>
		</tr></tbody></table>表1:このプロトコルで使用されるバッファー組成のリスト。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>一般的な問題とそのトラブルシューティング</td>
			<td>問題</td>
			<td colspan="4">原因</td>
			<td colspan="4">可能な解決策</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>脂質二重層は拡散を示さない</td>
			<td colspan="4">この問題の最も可能性の高い原因は、洗浄液が老化した場合、または浴超音波処理中に加熱が行われなかった場合に発生する可能性のあるカバーガラスの汚れです。これらの二重層は、破裂した小胞がカバーガラスに付着するが互いに融合しないため、「小胞」の外観を有する。6週間以上経過したMLVまたは6日以上経過したSUVを使用したり、少量のSUVを追加したりすると、小胞二重層が形成される可能性があります。</td>
			<td colspan="4">新鮮な洗浄液を使用してください。ヒーターがオンになっていて、温度が45〜65°Cであることを確認してください。 新鮮な脂質ミックスを使用してください。(蛍光脂質プローブと蛍光タンパク質プローブを使用すると、異なる症状が現れることがあります。 例えば、二重層に副回折欠陥があり、表面パッシベーションステップがスキップされる(または機能しない)場合、脂質プローブは均一な強度分布を示しますが、蛍光タンパク質プローブは明るい蛍光スポットを表示する場合があります。</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>脂質二重層には明るい斑点があります</td>
			<td colspan="4">二重層形成のためのSUVの長期インキュベーションは、全体的に拡散しているが時折明るいパッチを伴う脂質二重層を作成する可能性がある。これらのパッチは、大量の蛍光プローブを引き付けることができる多層二重層であり得る。</td>
			<td colspan="4">SUVとの15〜20分のインキュベーションで十分です。プローブが凝集していないことを確認してください:リンカータンパク質の迅速なハードスピン(300 x gで4°Cで15分間)で凝集体を除去できます</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>脂質二重層には暗い穴があります</td>
			<td colspan="4">これは、二重層が古いSUVから作られ、長時間(形成後&gt;4時間)画像化された場合、または長時間の画像化(例えば、高ATP状態および特定の脱酸素剤の存在下で)により溶液のpHが劇的に変化する場合、または表面がベータカゼインで過剰に不動態化されている場合(ベータカゼインを10〜15分以上添加しすぎて洗い流さない)。</td>
			<td colspan="4">新鮮な脂質を使用してください。イメージングフレームレートまたは有効なレーザー照明時間を短縮します。バッファリング容量の高いバッファを使用してください。</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>脂質二重層はゆっくりとした拡散を示す</td>
			<td colspan="4">コレステロールの割合が高い脂質二重層、長い飽和脂質、または荷電脂質は拡散が遅くなります。</td>
			<td colspan="4">このような場合は、高温でサンプルを調製してください。また、単純で試験済みの脂質組成を、複雑で試験されていない脂質組成物とともに対照として使用することもできる。ガラスがきれいであることを確認してください。</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>アクチンは重合しない</td>
			<td colspan="4">ターゲットバッファーが古く、Gアクチンストックが古すぎ、古いGアクチンと新しいGアクチンが共重合されました。</td>
			<td colspan="4">重合前にCa2+ がMg2+ に置換されていることを確認してください(MEバッファーを使用)。新鮮なATP-Mg2+ ストックを使用してください。新たにリサイクルされたG-アクチンを使用してください。二重層に添加されるF-アクチン(G-アクチン換算)の濃度が0.2μMより高いことを確認してください。低濃度の場合は、ファロイジン安定化F-アクチンを使用してください。</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>アクチンは二重層に結合しない</td>
			<td colspan="4">膜アクチンリンカーは、非常に低濃度で添加または添加されていない—これは、リンカータンパク質の蛍光を形成すると推測することができる。蛍光がまともであれば、膜-アクチンリンカーはアクチン結合能を失っています。また、リンカータンパク質がガラス表面に非特異的に結合している場合(二重層が悪い場合)、アクチンフィラメントを動員しない可能性があります。</td>
			<td colspan="4">二重層が拡散していることを確認してください。新鮮なリンカータンパク質を使用する</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>蛍光F-アクチンシグナルが弱い</td>
			<td colspan="4">標識された対暗アクチンの比率が低すぎる。標識アクチンまたは標識されていないアクチンのいずれかが古すぎて、互いに共重合していません。</td>
			<td colspan="4">アクチンを再度リサイクルし、新たにリサイクルしたアクチンでプロイマー化を再試行します。光損傷はF-アクチンを破壊または解重合する可能性があります。可能であれば、アクチン(およびミオシン)に赤または遠赤色の染料を使用してください。</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td>ミオシンは収縮性を示さない</td>
			<td colspan="4">ミオシン注入系にATPを添加した後、アクトミオシンの収縮性がないことが観察され得る。</td>
			<td colspan="4">ミオシン濃度または純度レベルが良好かどうかを確認してください。リサイクルしたてのミオシンを使用してください(リサイクル後6週間以内に使用してください)。ミオシンミックスに新鮮なATPを加えると効果的です。脱ガスバッファー、脱酸素剤の使用などモーターの光損傷を減らすことができます。 さらなる情報は、同じメソッドコレクションのPlastinoらまたはStamらによるプロトコルで見つかるかもしれません</td>
		</tr><tr><td>9</td>
			<td>カバーガラスは親水性ではありません</td>
			<td colspan="4">カバーガラスが適切に洗浄されていません。</td>
			<td colspan="4">クリーンな親水性カバーガラスは、脂質二重層の形成に不可欠です。洗浄プロトコル後のカバーガラスの親水性の有用な視覚的読み出しは、水によるガラスの濡れを観察することです。平らなカバーガラスに少量の水を追加します。カバーガラスが適切に洗浄されていない場合、水は丸い液滴の形のままになります。ただし、同じ量の水が広がり、処理された親水性カバーガラス上に薄い層を形成します。カバーガラス表面の水のこの濡れ挙動は、洗浄液/ NaOHによる洗浄ステップが機能したかどうかを確認するために使用できます。</td>
		</tr></tbody></table>表2:一般的な問題と対応する解決策をまとめたトラブルシューティングガイド。 
補足ビデオS1:収縮性アクトミオシンフローは、膜-アクチンリンカータンパク質HYEの局所クラスタリングを促進します。 HYEおよびF-アクチンを含むSLBにミオシンIIを添加した場合のHYE(YFPタグ付き)、アクチンフィラメント(Atto-635マレイミドで標識)、およびミオシンIIフィラメント(Atto-565マレイミドで標識)のTIRFタイムラプス。時間は上部に示されています:0分は蛍光筋フィラメントがTIRFフィールドに現れ始める直前です。スケールバー = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/S1Movie_Act_myo_Hye_merge_timestamp_15fps.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルでは、蛍光顕微鏡を使用して再構成された膜テザー細胞骨格ネットワークのダイナミクスを研究するための、支持された脂質二重層の形成、および細胞骨格フィラメントとモータータンパク質の添加について説明します。

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

ここでは、膜テザーアクトミオシンネットワークを組み立て、高度な光学顕微鏡技術を使用してダイナミクスを研究するための比較的簡単で簡単な手順を示します。主な利点は、当社のアッセイにより、膜テザーネットワークを乱すことなくタンパク質や低分子を順次添加できることです。この方法は、他の細胞骨格タンパク質または複合ネットワークの研究に容易に適合させることができる。プロトコルの最も重要な部分は、サポートされている脂質二重層が正しく形成されることを確認することであるため、まず、細胞骨格タンパク質の追加を開始する前に、このステップを習得する必要がありました。まず、3〜5枚の長方形のガラスカバースリップを取り、コプリンジャーの中に置きます。バス超音波処理器の電源を入れ、温度を摂氏65度に設定します。カバーガラスを完全に沈めるために2%洗浄液でcoplinジャーを満たし、フルパルスモードで30分間超音波処理器に入れます。鈍いPTFEコーティングされた鉗子を使用して、カバーガラスを1つずつ取り除きます。蒸留水でそれらを完全にすすぎ、2つの通常の水酸化ナトリウムで満たされた別のコプリンジャーに入れます。フルパルスモードで20分間カバーガラスを超音波処理します。カバーガラスを取り外し、蒸留水で十分にすすぎ、蒸留水で満たされた別のコプリンジャーに入れます。実験を開始する前に、窒素ガス供給を備えた化学フードに瓶を入れてください。手袋と鉗子を使用してカバーガラスを取り外し、窒素気流下で乾燥させます。両面を乾かし、カバー付きのきれいなプラスチックグリッドの上に置きます。カバーガラスの入った箱をデシケーターに入れてほこりの粒子との接触を避け、オートクレーブ滅菌したPCRチューブを取り、鋭い手術用ブレードで蓋と下部の円錐形の半分を切り取ります。円筒形のハーフカットチューブを取り、各カットチューブの滑らかなリムにUV硬化型接着剤を塗布し、リムがカバーガラスに平らになるように、新しく掃除したカバースリップの上に逆さまに置きます。接着剤がチャンバーの中央スペースにこぼれないように、カバーガラスに配置したらシリンダーを横方向に動かさないでください。カバーガラスをベアリングするチャンバーを、酸素供給と真空を備えたUVオゾンクリーナーの中に置きます。UVライトをオンにして3〜5分間点灯させ、接着剤を重合させます。カバーガラスを取り出し、チャンバーの漏れをテストし、漏れのあるチャンバーを廃棄します。各チャンバーをSLB形成バッファーで洗浄し、最後に100マイクロリットルのバッファーを残します。永久マーカーで100マイクロリットルのバッファーのレベルをマークし、次にチャンバーに2マイクロリットルの0.1モル塩化カルシウムを加え、続いて各チャンバーに8マイクロリットルのSUV溶液を加え、摂氏25度で15分間インキュベートします。サンプルチャンバーに50マイクロリットルだけを残して50マイクロリットルのSLB形成バッファーを除去し、次に100マイクロリットルのXKMEHをチャンバーに加え、穏やかに混合します。底に触れずに100マイクロリットルのバッファーを取り除きます。100マイクロリットルのXKMEHを加え、100マイクロリットルを取り出して、洗浄を8〜10回繰り返します。1ミリリットルのベータカゼイン1ミリグラムを10マイクロリットル二層に加え、穏やかに混合し、室温で5〜10分間インキュベートします。ベータカゼインを1つのXKMEHで3回洗い流し、バッファーレベルを100マイクロリットルのマークに戻します。ベータカゼインのインキュベーション中に、摂氏37度で急速に解凍したマイナス80°Cの膜アクチンリンカータンパク質のアリコートを取り出し、氷上に置きます。アリコートをタンパク質希釈バッファーで1マイクロモルの濃度に希釈します。リンカータンパク質を定義された最終濃度で溶液に加え、穏やかに混合します。室温で30〜40分間インキュベートし、1つのXKMEHバッファーで3〜5回洗浄して、結合していないHSEタンパク質を除去します。各チャンバーのバッファーレベルを100マイクロリットルのマークに戻します。これで、サンプルをイメージングする準備が整いました。顕微鏡、励起レーザー、検出カメラの電源を入れます。レーザーの位置が整い、対物レンズが洗浄され、ソフトウェアが画像を取得する準備ができていることを確認します。100倍の対物レンズにオイルを塗り、サンプルを顕微鏡ステージにマウントし、対物レンズを二重層に集中させます。レーザーの位置がサンプル上で全反射を受けるようなものであることを確認してください。488ナノメートルの励起を使用します。二重層の完全性を判断するには、二重層上の関心領域を選択し、5対1以上のS/N比を提供するイメージング条件を使用して視野のいくつかの画像を記録することにより、迅速なFRAPアッセイを実行します。記録を一時停止し、TIRF顕微鏡のフィールドダイアフラムを閉じて、集中レーザービームを二重層の小さな円形領域に集中させ、蛍光色素を局所的に漂白します。レーザーを最大出力までオンにして、小さな領域を3〜10秒間光退色してから、レーザーをオフにします。視野絞りを元の半径に再度開き、イメージング条件をプレブリーチ設定に再調整し、すぐに視野内の蛍光信号の回復の記録を再開します。二重層が流動的かどうかを確認し、画像を16ビットドットTIFファイルとして保存します。標識されていないG-アクチンと蛍光標識されたG-アクチンを10対1のモル比で混合し、G-アクチンの濃度が20マイクロモルになるようにG-バッファーを補充します。1回限りの溶液を得るために、10倍MEバッファーの10分の1をミックスに加え、室温で2分間インキュベートします。次に、キャッピングプロテインストックのバイアルを摂氏37度ですばやく解凍し、氷の上に置きます。キャッピングタンパク質の濃度が目的の最終濃度の2倍になるようにGバッファーで希釈し、等量の希釈キャッピングタンパク質溶液をアクチンミックスに加えます。最後に、等量の新鮮な2倍の標的緩衝液を反応ミックスに加える。溶液の最終容量は、アクチンミックスの体積の4倍にする必要があります。成分の最終濃度がテキスト原稿に記載されているとおりであることを確認してください。サンプルを摂氏25度の暗所で45〜60分間インキュベートして、重合を可能にします。鈍い端のピペットチップで5マイクロモルの重合アクチンを静かにピペットで取り出し、清潔なオートクレーブ滅菌PCRチューブに加えます。XKMEHをチューブに1つ加えて最終容量を20マイクロリットル以上にし、F-アクチンのせん断を避けるために穏やかに混合します。マウントされたサンプルチャンバーから、等容量のバッファーを除去します。重合アクチン溶液をチャンバーに加え、底部の二重層に触れずにゆっくりと上下に3回ピペットで留めます。サンプルをTIRF顕微鏡にマウントし、20〜30分間休ませます。F-アクチン添加が定常状態に達した後、異なる視野からいくつかの画像を記録します。アクチンインキュベーションを30分行った後、サンプルを顕微鏡に戻します。リンカータンパク質とF-アクチンチャネルのシグナルを確認します。必要に応じて撮影条件を調整してください。長時間のタイムラプス録画に適したリージョンを選択してください。ミオシン添加前に0.1〜0.2ヘルツで10〜15フレーム記録し、記録を一時停止します。鈍端のピペットチップでストックバイアルから必要量のリサイクル筋肉ミオシン2個をピペットで取り出し、清潔なオートクレーブ処理PCRチューブに加えます。すぐに1つのXKMEHをチューブに加えて容量を20マイクロリットル以上にし、穏やかに混合します。マウントされたサンプルチャンバーから等量のKMEHバッファーを邪魔することなく慎重に取り出し、ミオシン溶液をサンプルチャンバーに静かに加えます。表面結合フィラメントを乱すため、上下にピペットしないでください。すぐにタイムラプス録画を再開し、すべての画像を保存してから、バッファのみのサンプルを使用してすべてのチャンネルの背景画像を撮影します。すべての画像をTIFファイルとして保存します。拡散係数の適合値は毎秒1.34平方マイクロメートルであり、式に基づく計算値である毎秒1.39平方マイクロメートルとほぼ一致した。光退色後のラインプロファイルおよび漂白領域の回収プロファイルは、それぞれ式4および5に適合する。回復する漂白集団の割合を表す脂質二重層の可動画分は0.9より大きく、良好な脂質二重層を示す。ミオシン活性は、定常状態でアストロ様構造に出現する収縮性アクトミオシン流を誘導し、結合膜成分の局所的なクラスタリングを促進します。干渉散乱顕微鏡などのさまざまな顕微鏡技術を使用して、光損傷を誘発することなく非標識アクトミオシンネットワークのダイナミクスを研究したり、超解像蛍光顕微鏡を使用したりできます。この技術は、膜タンパク質複合体が動的アクトミオシンネットワークと相互作用してその構造と組成を調節する方法を理解することに関心のある研究者に道を開きます。

reconstitution-membrane-tethered-minimal-actin-cortices-on-supported

Research

JoVE Journal

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