Name: 血漿および固体組織からのトレーサブルおよび機能化された細胞外小胞の単離と分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶ 血漿および固体組織からの細胞外小胞（EV）の単離法。表面抗原プロファイリングとタンパク質定量により、がんや炎症性疾患の診断に有用な高品質なEVを取得できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、中国国家自然科学財団(32000974、81870796、82170988、および81930025)および中国ポスドク科学財団(2019M663986およびBX20190380)からの助成金によってサポートされました。国立基礎医学実験教育実証センター(AMFU)の支援に感謝しています。

動物実験は、第4軍事医科大学の施設動物管理および使用委員会のガイドラインおよびARRIVEガイドラインに従って実施されました。本研究では、8週齢のC57Bl/6マウス(雌または雄のいずれも選好しない)を使用した。血漿および組織EVの分離に関連するステップを 図1に示します。血漿は、体液からのEV分離手順を説明するための代表として採用されています。上顎骨を代表として、固形組織からのEV隔離手順を説明します。
1.血漿および上顎骨サンプルの調製
<ol><li>以下の手順に従って血漿サンプルを準備します。<ol><li>標準的な実験室天秤を使用してマウスの体重を決定します。</li>
		<li>20 μL、2 mg / mLのヘパリンを1.5 mLの遠沈管に加え、ミキサー装置( 材料の表を参照)を使用してヘパリンをチューブの壁に付着させます。 注:抗凝固チューブを使用して血液を直接採取することもできます。</li>
		<li>50 mg / kgのペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射によってマウスを麻酔します( 材料の表を参照)。.親指と人差し指でマウスの首をつかみ、尾と左後ろ足を小指で固定し、腹を露出させた後、1mLの注射注射器でペントバルビタールナトリウムを注射します。</li>
		<li>足蹠を挟んだときの角膜反射や四肢反応がないことから、マウスが適切に麻酔をかけられていることを確認します。</li>
		<li>湾曲したハサミで顔の毛と目のまつげを剃ります。</li>
		<li>マウスの首の皮膚をつかみ、眼球が突き出るように目の周りの皮膚を首の後ろに押し付けます。眼科用ピンセットを使用して眼球をすばやくクランプし、手順1.1.2で準備した1.5mLの遠沈管で血液の流出を収集します。頸椎を脱臼させてマウスを犠牲にします。 注意: 毛やまつげは溶血を引き起こす可能性があるため、注意してください。</li>
		<li>血液凝固を防ぐために、チューブを数回静かに逆さまにします。 注意: できるだけ早くチューブを逆さまにしてください。</li>
		<li>血液サンプルを4°Cで1,200 x g で15分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を新しく清潔な1.5 mL遠心チューブに慎重に移し、血漿サンプルをすぐに使用するか、4°Cで数時間保存します。</li>
		<li>上清を等量の1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、よく混合します。 注意: プラズマを収集するための上記のプロトコルは致命的です。血液は、マウスを犠牲にすることなく鎖骨下静脈穿刺11 を通して採取することもできる。</li>
	</ol></li>
	<li>以下の手順で上顎骨サンプルを準備します。<ol><li>眼科用ピンセットとはさみで上顎骨を隔離し、PBSで洗ってピンセットで軟組織を取り除きます。</li>
		<li>上顎骨を1.5mL遠沈管に入れ、ハサミで骨を小片(直径1mm未満)に切断します。組織を覆うために一定量のリベラーゼ(5 μg/mL、 材料表を参照)を加え(通常、8週齢のマウスの骨サンプルの場合は1 mL)、37°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>サンプルを800 x g で4°Cで10分間遠心分離します。</li>
		<li>上清をピペットで新しい清潔な1.5 mL遠心チューブに慎重に移します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. EVの抽出
<ol><li>サンプル(ステップ1.1.10およびステップ1.2.4で調製)を2,500 x g(4°C)で15分間遠心分離して、大きな細胞破片と残りの血小板を除去します。</li>
	<li>上清を新しく清潔な1.5 mL遠心チューブに慎重に移し、16,800 x g (4°C)で30分間遠心分離します。 注:遠心分離速度は、EVを抽出するために10,000 x g 以上に設定できます12.遠心分離機の速度が速いほど、より多くの量のEVを得ることができます。使用した遠心分離機の制限速度は16,800 x g であるため( 材料の表を参照)、このプロトコルではこの速度を選択しました。</li>
	<li>上清を廃棄し、1 mLのPBSで各チューブにペレットを再懸濁します。16,800 x g (4°C)で30分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を廃棄し、50 μLのPBSで各チューブにペレットを再懸濁します。これらのサンプルを4°Cで24時間未満保存するか、できればすぐに次の分析に使用してください(ステップ3〜5)。 注意:-80°Cでの保管は、EVの濃度が低下し、EVの粒子サイズが大きくなり13、EVの次の分析に影響を与えるため、許容できません。</li>
</ol>3. EVの形態同定
<ol><li>NTA 分析を実行します。<ol><li>EVの量に応じて(ペレットのサイズで大まかに判断すると、50 μLの血漿の粒子が最小です)、5〜50 μLの再懸濁を移し(ステップ2.4)、10 mLの緩衝液で希釈し(PBSを0.22 μmフィルターでろ過)、1 mLのマイクロピペッターチップで十分に混合します。この最終懸濁液は粒子測定に使用します。</li>
		<li>滅菌済みの1 mLシリンジを使用して、検出インターフェースに表示される粒子の数が5未満になるまで、少なくとも5 mLの蒸留水を適度かつ一定の速度で注入します。 注:チャネル全体に1 mLの蒸留水を注入した後、粒子の数は検出インターフェースに直接表示されます。それでも5を超える場合は、基準が満たされるまで1mLの蒸留水を注入し続けます。</li>
		<li>1 μLの校正溶液を1 mLの蒸留水に再構成して一次溶液を生成し、次に100 μLの一次溶液を25 mLの蒸留水に取り、標準ストック溶液(1:250,000)を調製します。この作業試薬を4°Cで1週間保存します。</li>
		<li>NTA機器を標準原液で校正します(ステップ3.1.3)。1〜5 mLの作業校正液を1 mLの滅菌シリンジで注入し、検出インターフェースに表示される粒子の数が50〜400(できれば約300)になるまでマシンチャネルをフラッシュします。キャリブレーションプログラムを実行します。</li>
		<li>各サンプル測定の前に、手順3.1.2を繰り返してマシンチャネルをフラッシュします。</li>
		<li>滅菌済みの1 mLシリンジを使用して少なくとも2 mLの緩衝液を注入し、検出インターフェースに表示される粒子の数が10未満になるまで、マシンチャネルを一定速度でフラッシュします。</li>
		<li>ステップ3.1.1で調製したEVサンプル1 mLを適度で一定の速度で注入します(推奨速度は0.5〜1 mL / sです)。 注:最適な粒子濃度は、検出インターフェースに表示される粒子の数を50〜400の範囲、できれば約300にすることです。粒子の数が多すぎる場合は、手順3.1.2を繰り返してマシンチャネルをすぐにフラッシュし、チャネル壁での粒子の保持を回避し、手順3.1.1でEVサンプルの濃度を調整してから、手順3.1.5から繰り返します。</li>
		<li>粒子分析を実施し、製造元の指示に従って分析レポートを生成します(材料表を参照)。</li>
		<li>サンプルが貴重な場合は、1 mLシリンジでEVサンプルをポンプバックし、1.5 mL遠沈管に回収します。手順 2.2 を繰り返して EV を抽出します。</li>
		<li>すべてのサンプルを検出した後、少なくとも2 mLの緩衝液をマシンチャネルに注入し、次に検出インターフェイスに表示される粒子の数が5つ未満になるまで少なくとも5 mLの蒸留水を注入します。</li>
		<li>滅菌済みの5 mLシリンジを使用して、少なくとも10 mLの空気を一定速度(推奨速度は1 mL / s)で注入し、チャネル内の水を除去します。</li>
	</ol></li>
	<li>TEM 分析を実行します。 注:新しいEVの再サスペンションで次の手順を実行します。ホルバーカーボンコーティング電子顕微鏡グリッドには2つの側面があり、作業面は中央グリッドで発光しています。以下の手順でEVを抽出するための血漿の最小量は50μLです。<ol><li>EVサンプル(ステップ2.4)を等量の4%パラホルムアルデヒド(PFA)と混合します。4 μLのEVを1つのグリッドに堆積させ、室温(RT)で15分間インキュベートします。</li>
		<li>ポリエチレンフィルムのシートに4滴のPBS(1滴は50μLに相当)を入れます( 材料の表を参照)。きれいな微細なピンセットでグリッドを移し、PBSでグリッドの作業側をある滴から別の滴に洗います。</li>
		<li>ろ紙を使用して、グリッドに残っている余分なPBSを取り除きます。</li>
		<li>グリッドの作業面を1%リンタングステン酸( 材料表を参照)に2分間インキュベートしてから、手順3.2.2を繰り返します。 注意: リンタングステン酸は有毒であるため、この手順はヒュームフード内で操作する必要があり、冗長なリンタングステン酸は直接廃棄するのではなく、特別にリサイクルする必要があります。</li>
		<li>ろ紙で覆われた10 cmの皿にグリッドを上向きに置きます。グリッドはRTで数年間保管できます。</li>
		<li>製造元の指示に従って、電子顕微鏡でグリッドを観察します(材料表を参照)。 注:単一の粒子を確実に観察するには、EVの濃度を調整する必要があり、懸濁液は明らかな濁りのない透明である必要があります。滴下する前に、サンプルをよく混ぜる必要があります。代表的なTEMおよびNTA分析を 図2に示します。</li>
	</ol></li>
</ol>第4章 EVの起源分析
注:EVの細胞起源を特定するには、典型的な細胞膜マーカーの抗体を適用する必要があります。以下の手順でEVを抽出するための最小血漿量は300μLです。 EVの脂質二重層構造に基づいて、膜色素を使用してEVをマーキングできます。血漿サンプルの場合、リンパ球14 のCD18が表現のために選択されます。上顎骨試料については、破骨細胞15 に対する破骨細胞関連受容体(OSCAR)が一例として選択される。FCの前に、フローサイトメーターがEVの測定に適合していることを確認してください16、サイズ下限は異なるフローサイトメーター間で大きく異なります。
<ol><li>サンプルを500 μLのPBSで再懸濁し(ステップ2.4)、ブランクコントロール(チューブA)として50 μLを新しく清潔な1.5 mL遠心チューブに移し、さらに50 μLをFITC用の単純な染色チューブ(チューブB)として新しい清潔な1.5 mL遠心チューブに移します。膜染色のために0.5 μLの膜色素を一次チューブに加えます。RTで5分間インキュベートします。</li>
	<li>一次チューブを16,800 x g (4°C)で30分間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを200 μLのPBSで再懸濁します。</li>
	<li>各50 μLサンプルを4本の1.5 mL遠心チューブに分割し、PE用の単純な染色チューブ(チューブC)、表面マーカー染色(チューブD)、および二次抗体のみのコントロール(チューブE)に対応します。</li>
	<li>骨EVサンプル中のOSCARの一次抗体と血漿EVサンプル中のCD18抗体( 材料の表を参照)をチューブB(ステップ4.1)とチューブD(ステップ4.3)に別々に(1:100に希釈)加えます。4°Cで1時間インキュベートします。</li>
	<li>チューブを16,800 x g (4°C)で30分間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを500 μLのPBSで再懸濁した後、16,800 x g (4°C)で30分間遠心分離して、余分な一次抗体を除去します。</li>
	<li>上清を廃棄し、ペレットを50 μLのPBSで再懸濁し、続いてFITC結合二次抗体( 材料の表を参照)をそれぞれ(1:200で希釈)加えます(チューブE)。同じ二次抗体をチューブB(ステップ4.1)とチューブD(ステップ4.3)に追加します。すべてのチューブを暗所で4°Cで1時間インキュベートします。 注:直接蛍光標識抗体を使用して、適切なアイソタイプコントロールでFC検出を処理することもできます。</li>
	<li>0.2、0.5、および1μmサイズのビーズ( 材料の表を参照)の懸濁液をそれぞれ1 mLのPBSに1滴希釈し、最初に各サイズのビーズを実行して、EV用に選択されたゲートを確認します。フローサイトメーターの閾値を設定し、適切な前方散乱(FSC)および側方散乱(SSC)を使用してビーズおよびEV集団を検索する。<ol><li>最終条件を100,000個の膜染色粒子を計算するように設定します。製造元の指示に従って、フローサイトメーター を介して サンプルを分析します( 材料表を参照)。代表的な結果を 図3に示す。 注:蛍光チャネルを備えたNTA機器も起源分析に使用でき、サンプル調製はFCと同じです。</li>
	</ol></li>
</ol>5. EVのタンパク質含量分析
注:EV内のタンパク質含有量の分析は、ウェスタンブロット を介して 行われます。例えば、血漿および骨EVは、代謝状態について6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(PGD)およびピルビン酸キナーゼM2(PKM2)を分析するために選択されました。ゴルギン84(ゴルジ体小器官)をネガティブコントロールとして使用し、フロチリン(膜タンパク質)、カベオリン(カベオラの内在性タンパク質)、およびβアクチン(細胞骨格)17 を細胞サンプルと比較してEVのポジティブコントロールとして使用しました。ミトフィリンとα-アクチニン-4は大きなEVマーカーとして選択され、CD9とCD81はEV亜集団を示すために小さなEVマーカーとして選択されました18。Apoa1を血漿リポ粒子マーカー19として選択した。それぞれの試薬の詳細については、 材料表を参照してください。
<ol><li>ペレットを50 μLのRIPA溶解バッファーに再懸濁し(ステップ2.4)、氷上で30分間インキュベートします。</li>
	<li>製造元の指示に従って、BCAタンパク質アッセイにより、96ウェルマイクロプレート内のすべてのサンプルのタンパク質濃度を定量します( 材料表を参照)。<ol><li>2 mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を0.9%の生理食塩水(NS)(0.9%(w/v)の塩化ナトリウムを含む)で0.5 mg/mLに希釈します。 表1に示すように、0.5 mg/mLのBSAと0.9%のNSを、特定の容量の3つの複製ウェルに追加します。</li>
		<li>2 μLのサンプルをドロップし(ステップ5.1)、18 μLのNSを3つの複製ウェルに別々に追加します。</li>
		<li>BCA試薬Aと試薬B(50:1試薬A:B)を混合して、作業溶液を調製します。 200 μLの作業溶液を各ウェルに加え、30秒間穏やかに振とうします。</li>
		<li>96ウェルマイクロプレートを37°Cで20〜25分間インキュベートします。</li>
		<li>分光光度計で596nmのODを測定します(材料表を参照)。</li>
		<li>データをエクスポートします。</li>
		<li>検量線を描き、サンプルのタンパク質濃度を計算します。</li>
	</ol></li>
	<li>結果によると、0.9%のNSと5x SDS-PAGEローディングバッファー(250 mM Tris·塩酸、pH 6.8、10% SDS、30% (v/v) グリセロール、10 mM DTT、0.05% (w/v) ブロモフェノールブルー、 材料表を参照)。チューブをフィルムでしっかりと密封し、100°Cで5分間加熱します。</li>
	<li>サンプルとタンパク質ラダーを4%〜20%のHepes-Trisゲルの勾配濃度にロードします( 材料の表を参照)。 注:目的のタンパク質の分子量に応じてゲルパーセンテージを選択してください。</li>
	<li>タンパク質がラインを形成するまで80 Vのランニングバッファーでゲルを実行し、次にローディング色素がゲルの底部になるまで120 Vに1時間切り替えます。 注:実行時間は、使用する機器、またはゲルの種類と濃度によって異なる場合があります。</li>
	<li>ゲルをポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜( 材料表を参照)に移し、メチルアルコール中で20秒間プレインキュベートします。湿式移送システムを使用して、200mAで1時間移送します。 注意: 移送システム内に気泡がないことを確認し、PVDFメンブレンを濡らしてください。 注:転写時間は、標的タンパク質の分子量によって異なる場合があります。1 KDには通常1分かかります。</li>
	<li>50 mLのトリス緩衝生理食塩水-トゥイーン(TBST)(2 mLのPBS溶液に2 mLのトゥイーンを加えた)に2.5 gのBSA( 材料の表を参照)を50 mLの遠沈管に加えることにより、5%BSAブロッキングバッファーを調製します。粉末が溶解するまで攪拌する。このバッファー中のメンブレンを、攪拌しながらRTで2時間ブロックします。</li>
	<li>TBSTで適切な濃度に希釈した特異的一次抗体でメンブレンをインキュベートします(ミトフィリン、1:1000; α-アクチニン-4、1:1000;CD9, 1:1000;CD81, 1:1000;アポア1, 1:1000;ゴルギン84、1:1000;フロティリン-1、1:1000;カベオリン-1、1:1000;PGD, 1:1000;PKM2, 1:1000;β-アクチン、1:3000)を4°Cで一晩放置した。</li>
	<li>メンブレンを洗浄バッファー(2 LのPBS溶液に2 mLのトゥイーンを加えた)で4回(各回15分)洗浄し、メンブレンを適切な二次抗体とともに1:4000でRTで1時間撹拌しながらインキュベートします。</li>
	<li>洗浄バッファーでメンブレンを4回(各回15分)洗浄し、化学発光キットとゲルイメージングシステムを使用してメンブレンをイメージングします(材料の表を参照)。</li>
</ol>

<ol><li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+extracellular+vesicles%3A+biogenesis%2C+RNA+cargo+selection%2C+content%2C+release%2C+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).</li>
<li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li>
<li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).</li>
<li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+novel+frontiers+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63(2018).</li>
<li>Thietart, S., Rautou, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+biomarkers+in+liver+diseases%3A+A+clinician%27s+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view.</a> Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).</li>
<li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damaged+brain+accelerates+bone+healing+by+releasing+small+extracellular+vesicles+that+target+osteoprogenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors.</a> Nature Communications. 12 (1), 6043(2021).</li>
<li>In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-educated+pletelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tumor-educated pletelets.</a> Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).</li>
<li>Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+microvesicle+release%2C+uptake%2C+and+microvesicle-mediated+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation.</a> Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).</li>
<li>Brahmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((endothelial+cells+and+leukocytes+contribute+to+the+exercise-triggered+release+of+extracellular+vesicles+into+the+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820(2019).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+collection+through+subclavian+vein+puncture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Blood collection through subclavian vein puncture in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59556(2019).</li>
<li>Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+the+tumor+microenvironment%3A+old+stories%2C+but+new+tales%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 59(2019).</li>
<li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles%3A+A+systematic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).</li>
<li>Forsyth, C. B., Mathews, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+utilize+CD11b%2FCD18+for+adhesion+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans.</a> Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).</li>
<li>Kodama, J., Kaito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+multinucleation%3A+review+of+current+literature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Osteoclast multinucleation: review of current literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685(2020).</li>
<li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIFlowCyt-EV%3A+a+framework+for+standardized+reporting+of+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526(2020).</li>
<li>Durcin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+adipocyte-derived+extracellular+vesicle+subtypes+identifies+distinct+protein+and+lipid+signatures+for+large+and+small+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677(2017).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li>
<li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+extracellular+vesicle+protein+cargo+with+race+and+clinical+markers+of+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17582(2019).</li>
<li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+exosomal+isolation+methods%3A+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466(2020).</li>
<li>Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS-based+proteomic+analysis+of+serum+and+plasma%3A+problem+of+high+abundant+components+and+lights+and+shadows+of+albumin+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).</li>
<li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).</li>
<li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li>
<li>Görgens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+storage+conditions+stabilizing+extracellular+vesicles+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238(2020).</li>
<li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+storage+temperature+on+airway+exosome+integrity+for+diagnostic+and+functional+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478(2017).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109(2021).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+apoptotic+bodies+maintain+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+and+ameliorate+osteopenia+via+transferring+multiple+cellular+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors.</a> Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).</li>
<li>Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).</li>
<li>Dawson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lipid+rafts+%28detergent-resistant+microdomains%29+and+comparison+to+extracellular+vesicles+%28exosomes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes).</a> Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Natural+liver-accumulating+drug+delivery+vehicles+for+the+treatment+of+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030(2020).</li>
<li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

EVの特徴、運命、機能を研究する際には、歩留まりが高く汚染の少ないEVを分離することが重要です。EVを抽出するには、密度勾配遠心分離(DGC)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、イムノキャプチャアッセイなど、さまざまな方法があります4,20。ここでは、最も一般的に使用される方法の1つである示差遠心分離が使用されました。これの利点は、時間がかからないこと、限られたサンプルから簡単に分離できるEVの高収率、および使用するサンプルソースに基づいて方法を変更できることです。循環するEVの機能を分析するには、血清よりも生体内のEVの実態をよりよく反映できる血漿を選択することをお勧めします。これは、血清21を採取するための血餅形成の過程で多くの血小板由来EVが放出される一方で、血漿22からEVを単離する前に遠心分離によって血小板が除去されるためである。血漿EV単離のための抗凝固の選択はまだ議論の余...

細胞外小胞(EV)は、さまざまな生理学的および病理学的イベント2において重要な役割を果たす細胞放出脂質二重層封入細胞外構造1を定義するために提案されています。健康な細胞から放出されるEVは、細胞内エンドサイトーシス輸送経路3を介して形成されるエクソソーム(または小型EV)と、細胞4の原形質膜の外出芽によって発生するマイクロベシクル(または大型EV)の2つの主要なカテゴリーに大きく分類できます。多くの研究は、in vitro5で培養細胞から収集されたEVの機能に焦点を当てていますが、循環または組織に由来するEVはより複雑で不均一であり、生体内の生物の真の状態を反映するという利点があります6。さらに、ほぼすべての種類の組織が生体内でEVを産生することができ、これらのEVは組織内でメッセンジャーとして機能したり、さまざまな体液、特に末梢血によって移動したりして、全身コミュニケーションを促進することができます7。循環および組織内のEVも疾患の診断および治療の対象である8.
近年、エクソソームの研究が盛んに行われているのに対し、マイクロベシクルは重要な生物学的機能も備えており、超遠心なしで容易に抽出できるため、基礎研究や臨床研究が進められています9。特に、循環および組織から分離されたEVに関する重要な問題は、それらが異なる細胞型に由来することです10。マイクロベシクルは原形質膜から剥がれており、豊富な細胞表面分子が特徴であるため9、親細胞膜マーカーを使用してこれらのEVの細胞起源を特定することが可能です。具体的には、フローサイトメトリー(FC)技術を適用してメンブレンマーカーを検出することができます。さらに、研究者はEVを隔離し、機能的な貨物に基づいてさらに分析を行うことができます。
本プロトコルは、in vivoサンプルからEVを抽出して特性評価するための徹底的な手順を提供します。EVは示差遠心分離によって単離され、EVの特性評価には、ナノ粒子追跡分析(NTA)および透過型電子顕微鏡(TEM)による形態同定、FCによる起源分析、およびウェスタンブロットによるタンパク質貨物分析が含まれます。マウスの血漿および上顎骨が代表として使用される。研究者は、他のソースからのEVについてこのプロトコルを参照し、対応する変更を加えることができます。

<table><tbody><tr><td>4%パラホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>バイオシャープ</td><td>143174</td><td>透過型電子顕微鏡</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 抗ヤギ二次抗体</td><td>Yeason</td><td>34306ES60</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 抗ウサギ二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>抗CD18抗体</td><td>Abcam</td><td>ab131044</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>抗CD81抗体</td><td>Abcam</td><td>ab109201</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>抗CD9抗体</td><td>Huabio</td><td>ET1601-9</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>抗ミトフィリン抗体</td><td>Abcam</td><td>ab110329</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>APOA1 Rabbit pAb</td><td>Abclone</td><td>A14211</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>BCAタンパク質アッセイキット</td><td>TIANGEN</td><td>PA115</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>BLUeye Prestained Protein Ladder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94964-500UL</td><td>ウエスタンブロット</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>MP バイオメディカル</td><td>218072801</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>カベオリン-1抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53564</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>CellMask オレンジ 原形質膜染色</td><td>Invitrogen</td><td>C10045</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>化学発光</td><td>アマシャムバイオサイエンス</td><td>N/A</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>湾曲手術ハサミ</td><td>JZ 手術器具</td><td>J21040</td><td>EV アイソレーション</td></tr><tr><td>電子バランス</td><td>Zhi Ke</td><td>ZK-DST</td><td>EV アイソレーション</td></tr><tr><td>エポック分光光度計</td><td>BioTek</td><td>N/A</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>3810X</td><td>EV アイソレーション</td></tr><tr><td>フロティリン-1抗体</td><td>PTM BIO</td><td>PTM-5369</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>ゲルイメージングシステム</td><td>Tanon</td><td>4600</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>Golgin84</td><td>Novus</td><td>nbp1-83352</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>グリッド - Formvar/Carbon Coated - 銅 200メッシュ</td><td>Polysciences</td><td>24915</td><td>透過型電子顕微鏡</td></tr><tr><td>ヘパリン溶液</td><td>StemCell&nbsp;</td><td>7980</td><td>EV アイソレーション</td></tr><tr><td>リベラーゼ 研究グレード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td>EV アイソレーション</td></tr><tr><td>マイクロピンセット</td><td>JZ 手術器具</td><td>JD1020</td><td>EV アイソレーション</td></tr><tr><td>NovoCyte フローサイトメーター</td><td>ACEA</td><td>N/A</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells</td><td>Epizyme</td><td>LK206</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>OSCAR(D-19) 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-34235</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>PBS (2x)</td><td>ZHHC</td><td>PW013</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>ペントバルビタール ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-33-0</td><td>麻酔</td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ AffiniPure ヤギ抗マウス IgG (H+L)</td><td>Jacson</td><td>115-035-003</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ AffiniPure ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>Jacson</td><td>111-035-003</td>ウェ<td>スタンブロット</td></tr><tr><td>リンタングステン酸</td><td>RHAWN</td><td>12501-23-4</td><td>透過型電子顕微鏡</td></tr><tr><td>PKM2(d78a4)xp rabbit&nbsp; mab&nbsp;</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>4053t</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>ポリエチレン(PE)フィルム</td><td>Xiang yi</td><td>200150055</td><td>透過型電子顕微鏡</td></tr><tr><td>ポリフッ化ビニリデン膜&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>3010040001</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td><td>ロシュ</td><td>4693132001</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>組換え抗 PGD 抗体</td><td>アブカム</td><td>ab129199</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>RIPA 溶解バッファー</td><td>Beyotime</td><td>P0013</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>SDS-PAGE ローディングバッファー (5x)</td><td>Cwbio</td><td>CW0027S</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>サイズビーズ</td><td>Invitrogen</td><td>F13839</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>卓上型高速マイクロ遠心分離機</td><td>日立</td><td>CT15E</td><td>EV アイソレーション</td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>日立</td><td>H-7650</td><td>透過型電子顕微鏡</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MP Biomedicals</td><td>19472</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー ジーニー</td><td>・サイエンティフィック・インダストリーズ</td><td>SI0425</td><td>EVアイソレーション</td></tr><tr><td>ZetaView BASIC NTA - ナノ粒子追跡ビデオ顕微鏡 PMX-120</td><td>Particle Metrix</td><td>N/A</td><td>ナノ粒子追跡分析</td></tr><tr><td>&α;-アクチニン-4 ウサギ</td><td>mAb Abclone</td><td>A3379</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>&beta;-アクチン</td><td>Cwbio</td><td>CW0096M</td><td>ウェスタンブロット</td></tr></tbody></table>

血漿および固体組織からのトレーサブルおよび機能化された細胞外小胞の単離と分析

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

循環および組織常在性細胞外小胞(EV)は、新しいセラノスティックバイオマーカーとして有望な標的であり、生物の恒常性の維持と幅広い疾患の進行において重要なプレーヤーとして浮上しています。現在の研究は、エンドソーム起源の内因性エクソソームの特性評価に焦点を当てていますが、原形質膜からブリングするマイクロベシクルは、親細胞の膜シグネチャを再現する豊富な表面分子を特徴とする健康と病気においてますます注目を集めています。ここでは、血漿および骨などの固体組織からEVを抽出して特性評価するための差動遠心分離に基づく再現可能な手順を示します。このプロトコルはさらに、EVの表面抗原とタンパク質貨物のその後のプロファイリングについて説明しており、したがって、それらの派生物を追跡可能であり、潜在的な機能に関連する成分で識別されます。この方法は、生物学的、生理学的、病理学的研究におけるEVの相関的、機能的、および機構的解析に役立ちます。

実験ワークフローによれば、末梢血および固形組織からEVを抽出することができます(図1)。8週齢のマウスの上顎骨は約0.1±0.05gであり、マウスから約300μLの血漿を採取することができる。プロトコルステップに従って、それぞれ0.3 mgおよび3 μgのEVを収集できます。TEMとNTAで分析したように、EVの典型的な形態学的特徴は、直径50〜300 nmの範囲の丸いカップ状の膜小胞です(図2)。FCは、膜色素標識されたEVを有用なコントロール下で検出することができ、FC分析は、親細胞に由来することを示唆するEVに発現する特定の膜マーカーの割合を示しています(図3)。ウェスタンブロット解析では、血漿EVおよび骨EV中のタンパク質含量の代表としてPGDおよびPKM2の発現をそれぞれ示し、代謝状態を示しています(図4)。EVにおけるGolgin84の陰性発現は、原形質膜由来の大型EV(マイクロベシクル)...

本プロトコルは、末梢血および固体組織から細胞外小胞を抽出し、その後表面抗原およびタンパク質カーゴのプロファイリングを行う方法を記載している。

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

このプロトコルは、ほとんどの血液および固体組織から適切な細胞外小胞を単離および収集し、特にそれらの供給源およびタンパク質含有量を分析するための実行可能な方法を提供し、さらなる機能実験に役立ちます。高収率と低汚染に加えて、このプロトコルの主な利点は、生理学的および病理学的研究に役立つEVの表面抗原とタンパク質貨物の分析です。フローサイトメーターで細胞外小胞の親細胞の表面マーカーを検出することにより、炎症性疾患や骨粗鬆症などの疾患の癌の診断を容易にします。組織細胞外小胞の量は、以下の実験にとって重要である。細胞外小胞の濃度が高くないことを確認してください。希釈を実行するのを我慢してください。まず、眼科用ピンセットとはさみで上顎骨を分離して上顎骨サンプルを準備し、PBSで洗浄してピンセットで軟組織を取り除きます。次に、上顎骨を1.5ミリリットルの遠沈管に入れ、ハサミで骨を直径1ミリメートルの小片に切ります。組織を覆うために一定量のリベラーゼを加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、サンプルを800 Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、ピペットで上清を新しく清潔な1.5ミリリットルの遠沈管に注意深く移します。調製した血漿および骨サンプルを2, 500 Gおよび摂氏4度で15分間遠心分離して大きな細胞破片および残りの血小板を除去した後、上清を新しく清潔な1.5ミリリットルの遠心分離管に慎重に移し、16, 800Gで摂氏4度で30分間遠心分離する。次に、上清を捨て、ペレットを各チューブに1ミリリットルのPBSで再懸濁します。前述のように上清を遠心分離して廃棄した後、再び、ペレットを各チューブに50マイクロリットルのPBSで再懸濁し、これらのサンプルを摂氏4度で24時間未満保存するか、できればすぐに分析に使用します。サンプルを500マイクロリットルのPBSで再懸濁し、50マイクロリットルをチューブAとラベル付けされたブランクコントロールとして新しい清潔な1.5ミリリットルの遠心分離管に移し、さらに50マイクロリットルを別のきれいな1.5ミリリットル遠心管に移しますFITC用の単純な染色チューブとして、チューブBとしてラベル付けされています室温で5分間インキュベートしながら、膜染色のために0.5マイクロリットルの膜色素を一次チューブに追加します。一次チューブを16, 800Gで30分間遠心分離し、上清を捨てた後、ペレットを200マイクロリットルのPBSで再懸濁します。各50マイクロリットルのサンプルを4つの1.5ミリリットル遠沈管に分割し、チューブCとしてラベル付けされたPE、チューブDとラベル付けされた表面マーカー染色、およびチューブEとしてラベル付けされた二次抗体のみのコントロール用の単純な染色チューブに、破骨細胞関連受容体および骨細胞外小胞サンプルの一次抗体、ならびにCD-18抗体および血漿細胞外小胞サンプルをチューブBおよびチューブDに別々に追加します。 摂氏4度で1時間インキュベートする。チューブを遠心分離し、前述のように上清を廃棄し、ペレットを500マイクロリットルのPBSで再懸濁します。再度、16, 800 Gおよび摂氏4度で30分間遠心分離し、余分な一次抗体を除去した。上清を捨てた後、ペレットを50マイクロリットルのPBSで再懸濁し、続いてチューブE.EにFITC結合二次抗体をそれぞれ加え、暗所で摂氏4度で1時間すべてのチューブをインキュベートする。0.2、0.5、および1マイクロメートルサイズのビーズ懸濁液をそれぞれ1滴ずつ1ミリリットルのPBSに希釈します。次に、ビーズの各サイズを実行して、細胞外小胞用に選択されたゲートを確認し、フローサイトメーターのしきい値を設定して、適切な前方内部散乱を使用してビーズと細胞外小胞集団を検索します。100, 000個の膜染色粒子を計算するように最終条件を設定し、原稿に記載されているようにフローサイトメーターを介してサンプルを分析します。ペレットを50マイクロリットルのRIPA溶解バッファーに再懸濁し、氷上で30分間インキュベートします。BCAタンパク質アッセイによって96ウェルマイクロプレート内のすべてのサンプルのタンパク質濃度を定量するには、BSA1ミリリットルあたり2ミリグラムを0.9%の生理食塩水で0.5ミリグラム/ミリリットルに希釈します。BSA1ミリリットル当たり0.5ミリグラムおよび0.9%の生理食塩水を、特定の容量の3つの複製ウェルに入れる。次に、2マイクロリットルのサンプルをドロップし、18マイクロリットルの生理食塩水を3つの複製ウェルに別々に追加します。BCA試薬Aと試薬Bを混合して作業溶液を調製した後、各ウェルに200マイクロリットルの作業溶液を加え、30秒間穏やかに振とうします。次に、96穴マイクロプレートを摂氏37度で20〜25分間インキュベートし、分光光度計で596ナノメートルの光学密度を測定します。次に、データをエクスポートし、検量線を描き、サンプルのタンパク質濃度を計算します。結果によると、サンプルを0.9%の生理食塩水と5倍の濃度のSDS-PAGEローディングバッファーで1マイクロリットルあたり1マイクログラムに希釈し、チューブをフィルムでしっかりと密封し、摂氏100度で5分間加熱します。タンパク質ラダー内のサンプルを、4〜20%HEPyのトリスゲルの勾配濃度にロードします。タンパク質がラインを形成するまで、ランニングバッファーでゲルを80ボルトで流します。次に、ローディング染料がゲルの底に来るまで120ボルトに1時間切り替えます。ゲルをポリフッ化ビニリデン膜に移し、湿式転写システムを用いてメチルアルコール中で20秒間プレインキュベートし、200ミリアンペアで1時間移送する。2.5グラムのBSAと50ミリリットルのTBSTを50ミリリットルの遠沈管に加えることにより、5%BSAブロッキングバッファーを調製します。このバッファー中のメンブレンを室温で2時間撹拌しながらブロックします。TBSTで希釈した特異的一次抗体でメンブレンを適切な濃度に4°Cで一晩インキュベートします。洗浄バッファーでメンブレンを4回洗浄し、メンブレンを適切な二次抗体とともに室温で1時間撹拌しながらインキュベートします。洗浄バッファーでメンブレンを4回洗浄した後、ゲルイメージングシステムで化学発光キットを使用してメンブレンをイメージングします。透過型電子顕微鏡とナノ粒子追跡分析により、細胞外小胞の典型的な形態学的特徴は、直径500〜300ナノメートルの円形でカップ状であることが明らかになりました。フローサイトメトリー分析は、細胞外小胞に発現する特定のメンブレンマーカーの割合を示し、親細胞からの起源を示唆しています。ウェスタンブロット解析は、タンパク質含量ならびに血漿細胞外小胞および骨細胞外小胞の代表としてそれぞれPGDおよびPKM2の発現を示し、代謝状態を示す。細胞外小胞におけるゴルギン-84の陰性発現は、ミトフィリン、α-アクチニン-4、フロチリン-1、カベオリン-1、およびβ-アクチンの存在、および小胞マーカーCD9の存在で検出されましたが、CD81の発現は低いか、血漿細胞外小胞にAPO-A-1が存在しない。研究者は、ステップ2.2、組織サンプルの調製および消化が十分に行われるべきであることを念頭に置いている。そうでなければ、組織から抽出される細胞外小胞の数は制限される。細胞外小胞のマーカー標識蛍光染色剤を口に注入して、潜在的な機能に関連する相を治療することができます。

isolation-analysis-traceable-functionalized-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

血液中に存在する細胞外小胞は、さまざまな疾患の新規バイオマーカーとして提案されています。ここでは、末梢血サンプルから大きな原形質膜由来の微小胞を単離し、その後の従来のフローサイトメトリーとウェスタンブロッティングによる分析のためのプロトコルを紹介します。...

末梢血からの微小胞の単離とキャラクタリゼーション

これは、肝臓から組織外細胞小胞(EV)を分離するためのプロトコルです。このプロトコルは、コラゲナーゼ灌流を含む2段階のプロセスを記述し、その後、肝臓組織EVを分離するための差動超遠心分離を行う。...

肝臓からの組織外細胞小胞の分離

このプロトコルでは蛍光を用いたナノ粒子追跡によるひと全血から細胞小胞の迅速な分離と特定のマーカーの特性の完全なワークフローを説明します。結果が発表される高レベルの再現性を示し細胞培養上清に調整することができます。...

ナノ粒子追跡によるひと血中の細胞小胞単一の急速な蛍光特性評価

ここでは、我々 は脳、腫瘍標本を含む全体の組織から小さな細胞小胞 (Ev) を分離するための詳しいプロトコルを提供します。このメソッドでは、さらに下流解析の固体ティッシュから EVs...

全体組織からの細胞の小胞の抽出

本報告書は、ミクログリアまたは血液マクロファージからの細胞外小胞(EV)単離に関する時系列的要件を強調している。ミクログリア由来EVは神経突起の伸長因子として評価され、血液マクロファージ由来EVはインビトロアッセイにおけるC6グリオーマ細胞浸潤の制御で研究された。目標は、これらのEV機能を特定の微小環境における免疫メディエーターとして理解することです。...

細胞外小胞由来免疫細胞由来の特徴と細胞環境への機能的影響の研究

ここでのプロトコルは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、細胞外小胞を馴化細胞培養培地から適切に分離できることを示しています。...

馴化細胞培養培地から細胞外小胞を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー(英語)

最新世代のEV特性評価ツールは、複数のパラメータにわたる単一のEV解析を同時に行うことができます。ナノフローサイトメトリーは、標識なしで45...

ナノフローサイトメトリーによる単一細胞外小胞膜貫通タンパク質の特性評価

本プロトコルは、機能化された磁気ビーズを利用して尿中細胞外小胞を効率的に隔離するための詳細な説明を提供します。さらに、ウェスタンブロッティング、プロテオミクス、リン酸化プロテオミクスなどのその後の分析も網羅しています。...

プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析のための生体液からの細胞外小胞の化学的親和性に基づく単離(英語)

この記事では、ヒト血漿由来の細胞外小胞(EV)の単離、特性評価、定量の方法論について説明し、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)を使用した EV...

心血管バイオマーカー探索のための血漿由来細胞外小胞の単離、特性評価、およびプロテオミクス解析

ここでは、ヒト被験者の涙や唾液などの生体液から採取された細胞外小胞(EV)の特性評価法を示します。この方法で使用されるスキャナーは、サンプルの1μLからEVの表現型、サイズ、および総粒子数を検出することができます。...

体液からの細胞外小胞の特性評価

このプロトコルは、酵素的消化およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、マウスの骨格筋および骨髄から小さな細胞外小胞を分離し、構造的に複雑で収量の少ない組織から小胞富集部分を再現可能にして下流の分子解析を可能にします。...

サイズ排除クロマトグラフィーによるマウス骨格筋および骨髄からの小さな細胞外小胞の単離

学ぶ 血漿および固体組織からの細胞外小胞（EV）の単離法。表面抗原プロファイリングとタンパク質定量により、がんや炎症性疾患の診断に有用な高品質なEVを取得できます。

血漿および固体組織からのトレーサブルおよび機能化された細胞外小胞の単離と分析

さらに動画を探す