細胞外小胞由来免疫細胞由来の特徴と細胞環境への機能的影響の研究
2020年6月2日
本報告書は、ミクログリアまたは血液マクロファージからの細胞外小胞(EV)単離に関する時系列的要件を強調している。ミクログリア由来EVは神経突起の伸長因子として評価され、血液マクロファージ由来EVはインビトロアッセイにおけるC6グリオーマ細胞浸潤の制御で研究された。目標は、これらのEV機能を特定の微小環境における免疫メディエーターとして理解することです。
このプロトコルは、細胞外小胞の良好な分離とEBDFタンパク質の高い数の通知を保証することを可能にします。他の分離手法と比較して、この手法は、より整合性と垂直アクティビティであることを維持します。EVは、LCや病理学的状態でますます研究されています。
この方法は、我々は、EVを特徴付け、研究することを選択した任意のシステムに適用することができます。その内容や生物倫理のためには、培養結果として以下の実験を行うため、EVを反復処理する際には特別な注意が必要である。視覚的なデモンストレーションは、自家製サイズ排除クロマトグラフィーカラムなどの特定の機器をホストし、ナノ粒子カウンターと質量分析計の関与をホストするために重要です。
手順を実証するのに役立つのは、研究室のアントネッラ・ラッフォ・ロメロです。細胞外小胞(EV)を条件培地から事前に単離することから始めます。ミクログリアまたはマクロファージ培養物から培養液に条件を移し、1,200回Gで遠心分離して細胞をペレット化する。
上清を新しい円錐形の管に移し、さらに20分間遠心分離機を取り込んで、アポトーシスの体を取り除きます。その後、上清を10.4ミリリットルのポリカーボネートチューブに移します。チューブを70.1 TIローターに入れ、超遠心分離機を100,000倍のGで100,000倍に置き、摂氏4度で90分間、EVをペレットします。
遠心分離後、上清を捨て、0.2マイクロメートルの濾過PBSの200マイクロリットルでペレットを再懸濁します。EVを分離するには、ガラスクロマトグラフィーカラムを洗浄して殺菌し、底部に60マイクロリットルのフィルターを置くことによって、自家製サイズ除外クロマトグラフィーカラムを準備します。架橋されたアガロースゲルろ過ベースマトリックスを使用してカラムを積み重ね、直径0.6センチメートル、高さ20センチメートルの静止相を作成します。
その後、0.2マイクロメートルの濾過PBSの50ミリリットルで位相をすすいだ。必要に応じて、後で使用するために、4°Cでカラムを保管してください。再懸濁したEVペレットを定常相の上に置き、250マイクロリットルの連続分を20個収集し、静止期の上部にPBSを追加し続けます。
分数はマイナス20°Cで保存できます。ナノ粒子追跡解析を実行するには、0.2マイクロメートルのろ過PBSと渦を用いて各画分を希釈して凝集体を排除します。溶液を1ミリリットルのシリンジに入れ、自動シリンジポンプに入れます。
次に、適切な画面ゲインレベルとカメラレベルにカメラ設定を調整し、[実行]をクリックします。15秒間1000の注入率で分析チャンバにサンプルをロードします。次に、ビデオ録画の速度流量を15秒間25回の注入速度に減少させ、安定化させます。
パーティクル フローの連続 60 秒のビデオをキャプチャします。次に、ビデオ分析の前にカメラレベルと検出しきい値を調整します。[設定 OK] をクリックして解析を開始し、完了したら [エクスポート] をクリックします。
各画分の間に0.2マイクロメートルの濾過されたPBSの1ミリリットルでシステムを洗います。電子顕微鏡分析を行う場合は、50キロダルトン遠心フィルターを使用して、対象のサイズ排除クロマトグラフィー分を濃縮します。タンパク質抽出のために、50マイクロリットルのRIPAバッファーをEVサンプルと5分間氷上で混合します。
500ワットで3回、5秒間20キロヘルツでサンプルを超音波処理します。その後、摂氏4度で10分間Gの20,000倍の遠心分離機でベシカルデブリを取り除きます。タンパク質を単離した後、12%ポリアクリルゲルの積層ゲルでタンパク質遊離を行う。
ゲル中のタンパク質をクーマシーブルーと室温で20分間混ぜます。その後、各着色されたゲル片を物品化し、小片にカットします。原稿に記載されているように、連続した一連のワッシュを通してゲル片を入れてください。
その後、真空濃縮器でそれらを完全に乾燥させます。乾燥後、10ミリモルジチオトライトールを含む100ミリモル重炭酸アンモニウム100マイクロリットルで56°Cで1時間タンパク質還元を行います。次に、50ミリモルのヨウドアセトアミドを含む100ミリモル重炭酸アンモニウム100マイクロリットルのタンパク質アルキル化を、暗闇の中で45分間行う。
原稿の方向に従ってゲル片を洗い、真空濃縮器で完全に乾燥させます。摂氏37度で20ミリモル重炭酸アンモニウムに50マイクロリットルのトリプシンを用いてタンパク質消化を行う。翌日、100%ACNの50マイクロリットルを摂氏37度で30分間、室温で15分間連続攪拌してゲルから消化したタンパク質を抽出します。
その後、20ミリモル炭酸アンモニウムで5%TFAの50マイクロリットルでタンパク質を2回抽出し、20分間連続的に攪拌します。ACNを100マイクロリットル加え、10分間撹拌を続けます。その後、タンパク質を乾燥させ、0.1%TFAの20マイクロリットルで再懸濁します。
ペプチドを脱塩および濃縮するためのC 18逆相培地を用いて10マイクロリットルピペットチップを使用してサンプルを脱塩する。その後、ACNと0.1%のギ酸でそれらを溶かします。真空濃縮器でサンプルを完全に乾燥し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS)の場合は、ACN 20マイクロリットルと0.1%のギ酸で再懸濁します。
消化されたペプチドを器具にロードし、サンプル分析を行います。EV単離を確認するために、各SCC画分をナノ粒子追跡解析を行った。粒子数は、分数5、6、および7で有意に高かった。
これらの画分を1つのサンプル2F-EV陽性にプールし、かつ、1F-EV陰性および3F-EV陰性のEV負の分数と比較して、ウェスタンブロット分析を用いた。結果は、EV陽性試料および細胞ライセート制御におけるヒートショックタンパク質90の存在を示した。EV陽性試料の電子顕微鏡は、約100ナノメートルおよび400ナノメートルのサイズ範囲のEVを示した。
EV陰性サンプル中の汚染物質タンパク質を同定し、EVのタンパク質内容物を特徴付けるためにプロテオミクス分析を行った。同定されたタンパク質を、1F-EV陰性サンプルと2F-EV陽性サンプルの間、ならびに2F-EV陽性サンプルと3F-EV陰性サンプルとの間で比較した。この非標的法を用いて、536個のタンパク質のプールをExoCartaデータベースに提出し、86個のEV関連タンパク質の同定につながった。
さらに、このプールは、タンパク質相互作用およびそれらの関連する生物学的機能の同定も可能にした。EV陽性サンプルからのタンパク質が免疫および神経保護経路において役割を果たしていることが分かった。ミクログリア由来のEVの効果を、PC12細胞およびラット一次ニューロンを用いた神経突起伸長に対する評価を行った。
制御と比較してEVの下で有意な成長増加が観察された。マクロファージ由来のEVは、グリオーマ細胞浸潤について評価した。EVは、神経膠腫の成長と侵入を損なうことがわかった。
覚えておくべきことは、この手順でEVの損失を防ぐために、超遠心化ステップの上清を実際に慎重に捨ててください。私たちは、タンパク質含有量全体とEVの垂直効果に焦点を当てるために、大規模で非標的化されたアプローチを好みます。したがって、核酸中の内容物は分析を使用して関連付けることができます。
この一次培養によるアプローチにより、多様でないEVタンパク質と遊離タンパク質を区別することができます。だから、この凝固が実際のものなのか、それともむしろ他の現実なのかという疑問が残る
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概要
この研究は、ミクログリアと血液マクロファージからの細胞外小胞（EV）の分離プロトコルを詳述し、神経突起伸長の調節とグリオーマ細胞浸潤制御におけるそれらの役割を強調しています。この知見は、特定の微小環境内でのEV機能に対する理解を深めることを目的としています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 免疫学
背景
- 細胞外小胞（EV）は細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たします。
- ミクログリアとマクロファージは中枢神経系における重要な免疫細胞です。
- EVが神経機能にどのように影響するかを理解することで、神経免疫相互作用への洞察が得られます。
- 現在のEV分離技術は、小胞の完全性と活性に影響を与える可能性があります。
研究目的
- 異なる生物学的文脈におけるミクログリアと血液マクロファージ由来のEVを評価すること。
- これらのEVが神経突起伸長とグリオーマ細胞の挙動に与える影響を評価すること。
- 生物学的完全性を確保するEV分離のための信頼性の高いプロトコルを確立すること。
使用した方法
- 主要な方法は、細胞培養に続く条件付き培養液からのEV分離のための段階的遠心分離を含みます。
- ナノ粒子追跡分析とウェスタンブロット技術がEVの特徴づけに利用されます。
- 詳細には、超遠心分離、サイズ除外クロマトグラフィー、タンパク質抽出法が含まれます。
- EV取り扱い時の生物学的倫理の維持に注意が払われます。
主要な結果
- EVに富む特定の画分で、著しく高い粒子数が観察されました。
- ウェスタンブロット分析により、EV陽性サンプルにおける心臓ストレス関連タンパク質の存在が確認されました。
- 電子顕微鏡により、分離されたEVのサイズ範囲が特定され、成功した分離方法が示されました。
結論
- ミクログリアとマクロファージからのEV分離の開発されたプロトコルは、免疫介在型神経発達プロセスの研究を強化する可能性があります。
- この研究は、様々な生物学的文脈におけるEVの役割に関する将来の研究のための枠組みを提供します。
- これらのEVの機能的意味を理解することで、神経学的疾患における治療戦略に情報を提供できる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolation and functional characterization of immune cell-derived extracellular vesicles (EVs) enable mechanistic de-risking in neuroimmunology and oncology target validation. This approach supports predictive confidence in therapeutic vesicle design by linking EV protein signatures to neurite outgrowth and glioma invasion phenotypes. The protocol provides a scalable, reproducible workflow for evaluating EV-mediated immune functions in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial and macrophage EV protein signatures as biomarkers for immune-mediated pathway modulation.
- Operational Value: Provides standardized isolation via ultracentrifugation and size-exclusion chromatography to ensure EV integrity for functional assays.
- Predictive Value: Supports target de-risking by correlating EV-enriched proteins (e.g., HSP90) with functional outcomes in neurite outgrowth and glioma spheroid invasion models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative nanoparticle tracking data from SEC fractions to standardize EV yield and purity across batches.
- Operational Value: Enables functional readouts in neurite outgrowth (PC12/primary neurons) and glioma invasion (C6 spheroids) assays for immune mediator screening.
- Assay Readiness: Pooled EV-positive fractions (5-7) provide consistent material for downstream proteomic and functional validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant EV functions in neurite outgrowth (neuroprotection) and glioma invasion (anti-tumor immune modulation).
- Translational Continuity: Links EV protein cargo to immune and neuroprotective pathways, supporting biomarker-aligned mechanistic studies.
- Preclinical Model Utility: Uses primary neurons and glioma spheroids to evaluate EV effects in physiologically relevant culture systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of immune cell EVs as modulators of neuronal and cancer cell phenotypes, supporting lead identification through functional de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of EV-mediated immune signaling in CNS and tumor microenvironments via isolated vesicle functional assays.
- Screening: Delivers standardized, quantification-ready EV preparations for high-content phenotypic screening in neurite outgrowth and invasion models.
- Analytics: Generates nanoparticle tracking, Western blot, and proteomic data to quantify EV yield, validate markers (e.g., HSP90), and characterize functional protein cargo.
- Translational Research: Connects EV protein signatures to pathway-level effects in neurite outgrowth and glioma invasion, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation and characterization platform applicable to multiple immune cell types and disease contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of immune cell EV functions in neurite outgrowth and glioma invasion models.
- Operational Value: Standardized isolation via ultracentrifugation and SEC ensures reproducibility and scalability across labs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking EV protein signatures to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic vesicle candidates based on functional immune mediator validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, ultracentrifugation, and size-exclusion chromatography for EV isolation.
- Dependent on nanoparticle tracking analyzers, Western blot systems, and mass spectrometry for EV characterization.
- Necessitates cross-team standardization of EV fractionation and pooling (e.g., fractions 5-7) for reproducible functional assays.
- Adaptation to primary microglia, macrophages, or other immune cells requires validation of EV yield and functional activity.
- Practical limitation: EV integrity depends on careful supernatant removal post-ultracentrifugation to prevent loss of vesicle yield.
