Name: Ube3a変異体の機能評価のためのスケーラブルな細胞ベースの方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 学ぼう Ube3aミスセンス変異の機能評価法。HEK293T細胞を用いたルシフェラーゼアッセイにより、Angelman症候群とDup15q症候群関連の変異活性を迅速に解析し、神経発達障害の分子メカニズム解明に貢献します。

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この作品は、サイモンズ財団の独立への橋渡し賞(SFARI賞#387972;J.J.Y.)、脳と行動研究財団(JJY)からのNARSAD若手研究者賞、アルフレッドP.スローン財団(JJY)からの研究フェローシップ、およびアンジェルマン症候群財団(J.J.Y)、ホワイトホール財団(J.J.Y.)、およびNIMH(R01MH122786;J.J.Y.)。

1. Ube3a 変異株を作製するための変異クローニング
<ol><li>すべての Ube3a 変異体を、ニワトリβアクチンプロモーターとEGFP発現のための内部リボソームエントリーサイト(IRES)を含むバイシストロニックベクターであるpCIG2プラスミド(図1A)にクローニングします19。完全長 Ube3a コンストラクトは、N末端Mycタグ配列を含み、5'SacIサイトおよび3'XmaIサイトを使用してpCIG2にクローニングされます。さらに、 Ube3a コード配列内の天然に存在するEcoRI、EcoRV、およびPstIサイトもフラグメントのサブクローニングに使用されます。 注: Ube3a の匿名化されたバリアントは、文献およびClinVarデータベース1などの一般にアクセス可能なリポジトリで入手できます。追加の報告されていない亜種は、医療センターとの個人的なコミュニケーションを通じて入手できます。</li>
	<li>適合した2段階メガプライマー突然変異誘発法20 を使用して、 Ube3a 読み取りフレームに変異を導入する。第1のステップでは、変異に対する相同性5'および3'の少なくとも30塩基対(bp)によって挟まれた所望の変異(このプロトコルに示される例はUBE3A Q588E変異体を生成することである)を含む変異原性オリゴヌクレオチドを設計する(図1B および 表1)。</li>
	<li>変異原性オリゴヌクレオチドを最初のラウンドPCRに相補的オリゴヌクレオチドとともに使用して、変異を含む200〜400 bpのメガプライマーを生成します(図1C;表2および表3)。1%ゲルを用いたアガロースゲル電気泳動およびその後のゲル精製には、PCR反応容量50 μL全体を使用してください(材料表)。以下の第2ラウンドPCRステップで使用するために、PCR産物を30 μLの脱イオンH2O(diH2O)で溶出します。</li>
	<li>示されているように2回目のPCRを設定します(図1C;表 2 および 表3)。このステップでは、サブクローニングに適した変異部位と末端制限部位を含む、より大きなDNA断片(通常、長さが~1~1.5 kb)が生成されます(図1C)。</li>
	<li>PCR反応終了後、得られた生成物をPCR精製キットを用いて精製する(材料表)。30 μLで溶出し、すべての精製生成物およびpCIG2 Ube3a WTコンストラクトを適切な制限酵素で消化します(この例はEcoRIおよびXmaIによる消化を示しています)。</li>
	<li>37°Cで2時間消化した後、アガロースゲル電気泳動(1%ゲル)で消化生成物を分離し、適切な生成物をゲル精製します。メーカーのプロトコル(材料表)に従ってライゲーションをセットアップし、ライゲーション製品をDH10B細菌株に変換し(材料表)、アンピシリン(100 μg/mL)を選択してプレートします。</li>
	<li>翌日、2〜4つのコロニーを選び、ルリアブロス(LB)と100 μg/mLアンピシリンを含む3 mLの培養液を接種します。培養物を振とう(225rpm)しながら軌道インキュベーター内で37°Cで一晩増殖させます。</li>
	<li>翌日、1〜1.5 mLの細菌培養物を使用してプラスミドDNAをミニプレップします(材料表)。残りの培養液を4°Cに置いて保存します。 目的の変異から~200 bpに結合するオリゴヌクレオチドを使用したサンガーシーケンシングにより、ミニプレップされたプラスミドをスクリーニングします。</li>
	<li>4°Cで保存した細菌培養物を使用して、50 mL培養物を再接種し、正しいプラスミドをmidiprepに投与します(材料表)。 Ube3a コード配列を完全に配列決定して、DNAの正しい配列を検証します。</li>
	<li>Ube3a変異体プラスミド、β-カテニン活性化レポーター(BAR)21、TK-レニラルシフェラーゼ、リガーゼ死Ube3a(UBE3A C820A変異)、およびpCIG2空のベクターのワーキングストックを、その後のトランスフェクションステップに滅菌H2Oを使用して100 ng/μLの濃度で作成します。</li>
</ol>2. ヒト胚性腎臓293T(HEK293T)細胞の調製とトランスフェクション
<ol><li>グルタミン、10%ウシ胎児血清(FBS)、および抗生物質抗真菌剤を予め補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で増殖させたHEK293T細胞でアッセイを実行します17。滅菌した加湿インキュベーター内で細胞を増殖させ、5%CO2を含む37°Cで増殖させる。</li>
	<li>バイオセーフティキャビネットを使用して、まず、100 μLの培地中で、1ウェルあたり2.2 ×10 4 細胞の密度で組織培養処理された96ウェル平底プレートに懸濁したHEK293T細胞をプレートし、一晩増殖させます。</li>
	<li>2日目に、バイオセーフティキャビネット内の細胞に、ホタルおよびシミウシイの木のレポータープラスミド(表4)とUbe3aプラスミドをトリプリケートでトランスフェクトします。前述のように、10:1:8の比率のプラスミド(ウェルあたりそれぞれ50 ngのBAR、5 ngのTK-Renilla、および40 ngのUbe3aプラスミド)と0.4 μLのトランスフェクション試薬を使用して、ウェルあたり10 μLの総容量でトランスフェクションを実行します(表4)。 注:各実験について、空のベクター(GFPのみ)およびリガーゼ死 Ube3a をコードするプラスミドも、ネガティブコントロールとして機能するようにトランスフェクトされます。</li>
	<li>各バリアントのトランスフェクションのマスターミックスを1.5 mLマイクロ遠心チューブ(表4)で作成し、室温(RT)で15分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを軽くたたいてトランスフェクション混合物を穏やかに攪拌し、10 μLのトランスフェクション混合物をウェル内の既存の増殖培地に直接加えます。</li>
	<li>その後、細胞をインキュベーターに戻し、プラスミドを48時間発現させます。成長培地の交換は必要ありません。</li>
	<li>蛍光顕微鏡を用いたGFP蛍光によるトランスフェクション効率をモニターします。HEK293T細胞はこの方法で効率的にトランスフェクトされ、細胞の>80%が48時間後にGFPを発現するはずです。</li>
</ol>3. ルシフェラーゼ活性の測定
注:ルシフェラーゼ活性は、製造元のプロトコルに従ってホタルと レニラル シフェラーゼの両方をアッセイする市販のシステムを使用して評価されます(材料表)。
<ol><li>トランスフェクトしたHEK293T細胞から培養液を注意深く吸引し、冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄します。PBSを吸引し、25 μLの非変性溶解バッファーを加えて細胞を溶解し、氷上で穏やかに揺り動かしながら15分間インキュベートします。</li>
	<li>その後、得られたライセート20 μL(遠心分離は不要)を、100 μLのホタルルシフェラーゼ基質試薬を含む新しい96ウェルアッセイプレートに加えます。軽くたたいてプレートをやさしく混ぜます。</li>
	<li>プレートをプレートリーダーにロードし、読み取り高さ1mm、積分時間1秒のトップ検出器を使用して発光を測定します。 注意: 検出器のゲインは、信号の強度に基づいて調整する必要がある場合があります。</li>
	<li>ホタルルシフェラーゼ発光を読んだ直後に、100 μLのレニラ・ルシフェラーゼ基質をウェルに加えます。このステップでは、ホタルルシフェラーゼ活性を同時にクエンチしながら、レニヤのルシフェラーゼ活性を評価します。プレートを穏やかに攪拌してサンプルを混合し、発光を再度測定して、 Renilla ルシフェラーゼ活性を評価します。 注:このアッセイには他のプレートも使用できますが、黒いフレームと白いウェルを備えたプレートを使用すると、ノイズを最小限に抑えながらルシフェラーゼシグナルを増幅するため、最も感度の高い結果が得られます。</li>
	<li>レポーターの反応をホタルルシフェラーゼとレ ニヤ ルシフェラーゼの比率(ホタル/レニラ)として定量化し、三重測定値の値を平均します。その後、各変異体のホタル/レニラ の値を野生型(WT) Ube3a 発現細胞の値に対して正規化して、変異体タンパク質の相対活性を比較します。</li>
</ol>

<ol><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClinVar%3A+Public+archive+of+relationships+among+sequence+variation+and+human+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype.</a> Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).</li>
<li>Lek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein-coding+genetic+variation+in+60%2C706+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans.</a> Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).</li>
<li>Starita, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+interpretation%3A+Functional+assays+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Variant interpretation: Functional assays to the rescue.</a> American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).</li>
<li>Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HPV-16+E6+and+E6-AP+complex+functions+as+a+ubiquitin-protein+ligase+in+the+ubiquitination+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53.</a> Cell. 75 (3), 495-505 (1993).</li>
<li>Albrecht, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinted+expression+of+the+murine+Angelman+syndrome+gene%2C+Ube3a%2C+in+hippocampal+and+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons.</a> Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).</li>
<li>Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Angelman+syndrome+candidate+gene%2C+UBE3A%2FE6-AP%2C+is+imprinted+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).</li>
<li>Vu, T. H., Hoffman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+Angelman+syndrome+gene%2C+UBE3A%2C+is+restricted+to+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).</li>
<li>Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UBE3A%2FE6-AP+mutations+cause+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome.</a> Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).</li>
<li>Jiang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+Angelman+ubiquitin+ligase+in+mice+causes+increased+cytoplasmic+p53+and+deficits+of+contextual+learning+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation.</a> Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).</li>
<li>Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angelman+syndrome%3A+Insights+into+genomic+imprinting+and+neurodevelopmental+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes.</a> Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).</li>
<li>Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comorbidity+of+autism+with+the+genomic+disorders+of+chromosome+15q11.2-q13%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13.</a> Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).</li>
<li>Urraca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interstitial+duplication+15q11.2-q13+syndrome+includes+autism%2C+mild+facial+anomalies+and+a+characteristic+EEG+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Autism+Research%22%5BJournal%5D)">The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature.</a> Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).</li>
<li>de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+the+understanding+of+autism+disease+mechanisms+through+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics.</a> Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).</li>
<li>Scheffner, M., Staub, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HECT+E3s+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">HECT E3s and human disease.</a> BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).</li>
<li>Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+Angelman+syndrome-associated+mutations+in+the+E3+ubiquitin+ligase+E6-associated+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).</li>
<li>Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+specifies+axons+during+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling specifies axons during brain development.</a> Cell. 142 (1), 144-157 (2010).</li>
<li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autism-linked+UBE3A+T485A+mutant+E3+ubiquitin+ligase+activates+the+Wnt%2Fbeta-catenin+pathway+by+inhibiting+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).</li>
<li>Weston, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+disease-linked+hyperactivating+mutations+in+UBE3A+through+large-scale+functional+variant+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6809(2021).</li>
<li>Hand, R., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin2+regulates+the+initial+axon+guidance+of+cortical+pyramidal+neurons+projecting+medially+to+the+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum.</a> Neural Development. 6, 30(2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).</li>
<li>Biechele, T. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+beta-catenin%2FTCF+transcription+with+beta-catenin%2FTCF+transcription-based+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs.</a> Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).</li>
<li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Autism-linked+mutation+disables+phosphorylation+control+of+UBE3A%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A.</a> Cell. 162 (4), 795-807 (2015).</li>
<li>Kuhnle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angelman+syndrome-associated+point+mutations+in+the+Zn%282%2B%29-binding+N-terminal+%28AZUL%29+domain+of+UBE3A+ubiquitin+ligase+inhibit+binding+to+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).</li>
<li>Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+E6-AP+gene+%28UBE3A%29+encodes+three+potential+protein+isoforms+generated+by+differential+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing.</a> Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).</li>
<li>Avagliano Trezza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+nuclear+UBE3A+causes+electrophysiological+and+behavioral+deficits+in+mice+and+is+associated+with+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).</li>
<li>Bossuyt, S. N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+nuclear+UBE3A+activity+is+the+predominant+cause+of+Angelman+syndrome+in+individuals+carrying+UBE3A+missense+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations.</a> Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

ここで説明するプロトコルは、Ube3a変異体の酵素活性を評価するための効率的でスケーラブルな方法を提供します。このアッセイを使用する際には、慎重な検討を必要とするいくつかの技術的な詳細があります。1つの考慮事項は、このアッセイで使用されるWntレポータープラスミドの選択です。ここで説明するプロトコルは、組換えとTCF結合部位の喪失を最小限に抑えるために特別に設計されたリンカー配列によって分離された12個のT細胞因子(TCF)応答要素の連結体を含むレポーターであるβ-カテニン活性化レポーター(BAR)21を特に使用します。文献23に記載されている追加のルシフェラーゼベースのWntレポータープラスミドがあり、以前の研究はUBE3A活性を評価するために使用できるものがあることを示していますが、BARプラスミドはこの目的のために最も徹底的に特徴付けられています17,18。第二に、レニラ・ルシフェラー...

最近の技術の進歩により、臨床現場ではエクソームとゲノムの配列決定が日常的になっています1,2。これにより、タンパク質中の1つのアミノ酸を通常変化させる数百万のミスセンス変異を含む、多数の遺伝的変異が発見されました。これらの変異体の機能的意義を理解することは依然として課題であり、既知のミスセンス変異体のごく一部(~2%)のみが臨床的解釈を持っています1,3。
この問題の顕著な例は、分解のために基質タンパク質を標的とするE3ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子であるUbe3aです4。Ube3aは染色体15q11-13内に存在し、母性遺伝対立遺伝子5,6,7からのみ発現します。疾患遺伝学からの観察は、UBE3A酵素の不十分または過剰な活性が明確な神経発達障害を引き起こすことを強く示唆しています。母体の染色体15q11-13の欠失は、重度の知的障害、運動障害、発作、頻繁な笑顔を伴う幸せな態度、および異形性顔の特徴を特徴とする障害であるアンジェルマン症候群(AS)8を引き起こします8,9,10。対照的に、母体の染色体15q11-13の重複または三重化は、自閉症の最も一般的な症候群形態の1つとして認識されている不均一な状態であるDup15q症候群を引き起こします11,12,13。さらに、Ube3aでは何百ものミスセンスバリアントが特定されており、その大部分は機能的および臨床的意義が不明であるため、重要性が不確実なバリアント(VUS)と見なされます。したがって、Ube3a変異体を経験的に評価して、それらが神経発達疾患に寄与するかどうかを判断する方法の開発には大きな関心が寄せられています。
UBE3A酵素は、E3ユビキチンリガーゼのHECT(E6-AP C末端に相同)ドメインファミリーに属し、すべてがE2酵素から活性化されたユビキチンを受け入れて基質タンパク質に転移するために必要な生化学的機構を含む同名のHECTドメインを有する14。歴史的に、E3酵素の特性評価は、精製タンパク質のアンサンブルを必要とする再構成されたin vitroシステムに依存してきました4,15,16。そのような方法は遅くそして労働集約的でありそして多数の変種の活性を評価するのには適していない。以前の研究では、UBE3Aは、プロテアソームの機能を調節してβ-カテニン17の分解を遅らせることにより、HEK293T細胞のWnt経路を活性化することが特定されました。この洞察により、Ube3a18の機能喪失変異体と機能獲得変異体の両方を特定するための効率的かつ迅速な方法としてWnt経路レポーターを使用できます。以下のプロトコルは、Ube3a変異体を生成する方法、ならびにUbe3a変異体の活性の変化を評価するためのルシフェラーゼベースのレポーターについて詳細に説明している。

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA (1x)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb DNA ラダー</td><td>Lambda Biotech</td><td>M108-S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA ラダー</td><td>Lambda Biotech</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ用バッファー 10 mM ATP</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202A</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion HF Reaction Buffer New</td><td>England BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤溶液</td><td>コーニング</td><td>30004CI</td><td></td></tr><tr><td>ブラック/ホワイト アイソプレート-96 ブラック フレーム ホワイト ウェル プレート</td><td>パーキンエルマー</td><td>6005030</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン 二ナトリウム塩</td><td>中西部科学</td><td>KCC46000-5</td><td></td></tr><tr><td>カウントス 細胞計数チャンバー&nbsp; スライド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>カウントス II自動セルカウンター&nbsp;</td><td></td><td></td>ライフサイエンス <td>セルカウンティングマシン</td></tr><tr><td>カスタムDNAオリゴ</td><td>統合DNAテクノロジーズ (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド (dNTP) 溶液ミックス</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、GlutaMAX サプリメント、ピルビン酸</td><td>Gibco</td><td>10569044</td><td>HEK293T細胞株DPBSの増殖をサポートするための基礎培地</td></tr><tr><td>(1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定、熱不活化</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>ウシ胎児血清</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド 表面処理 組織培養皿</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 トランスフェクション試薬</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディング 染料 パープル (6x)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>高効率 ig 10B 化学的にコンピテントな細胞</td><td>インタクト ゲノミクス</td><td>1011-12</td><td>大腸菌 DH10B 細胞</td></tr><tr><td>HiSpeed プラスミド ミディキット</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td>ミディプレップ</td></tr><tr><td>pCIG2 プラスミド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pGL3 BAR プラスミド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion HF DNA ポリメラーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0530L</td><td>DNAポリメラーゼ</td></tr><tr><td>ProFlex 3 x 32ウェルPCRシステム</td><td>生命技術</td><td></td>による応用バイオシステム <td>サーモサイク</td></tr><tr><td>ラーpTKレニラプラスミド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprepスピンミニプレップキット (250)</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>ミニプレップ</td></tr><tr><td>QIAquickゲル抽出キット (250)</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>ゲル精製</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 精製キット (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>PCR 精製</td></tr><tr><td>rCutSmart バッファー</td><td>New England BioLabs</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>SacI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3156S</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>Synergy HTX マルチモード リーダー</td><td>BioTek</td><td></td><td>&nbsp;プレートリーダーは Gen5 ソフトウェア v3.08 (BioTek)</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202L</td><td>Ligase</td></tr><tr><td>TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13324</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom Fisherbrand</td><td></td><td>FB012931</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide Solution</td><td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>15585011</tr><tr><td>XmaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0180S</td><td>制限酵素</td></tr></tbody></table>

ube3a変異体の機能評価のためのスケーラブルな細胞ベースの方法

A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants

医学におけるシーケンシングの使用の増加により、ヒトゲノムに何百万ものコーディングバリアントが特定されました。これらの変異体の多くは神経発達障害に関連する遺伝子に存在しますが、大多数の変異体の機能的重要性は不明のままです。本プロトコルは、自閉症およびアンジェルマン症候群の両方に関連するE3ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子である Ube3aの変異体の研究を記載している。 Ube3a の重複または三重化は自閉症と強く関連していますが、その欠失はアンジェルマン症候群を引き起こします。したがって、UBE3Aタンパク質活性の変化の価数を理解することは、臨床転帰にとって重要です。ここでは、 Ube3a 変異体とWnt経路レポーターをペアにする迅速な細胞ベースの方法について説明する。この単純なアッセイはスケーラブルであり、任意の Ube3a 変異体の活性変化の価数と大きさを決定するために使用できます。さらに、本手法の設備により、豊富な構造機能情報の生成が可能となり、UBE3Aの酵素機構を深く理解することができます。

Ube3aミスセンス変異体の大規模な機能スクリーニングにより、機能喪失および機能獲得変異の幅広い状況を特定 Ube3a変異体を用いた以前の研究は、Wnt応答が細胞UBE3Aタンパク質活性のレポーターとして役立つことを示唆した。これらの観察結果を拡張して、BARアッセイが細胞内のUBE3A活性の範囲を報告するのに適しているかどうかを調査するために、追加の検証実験を実施しました。まず、HEK293T細胞に、ヒトWT Ube3aをコードする様々な量のプラスミドDNAをトランスフェクトした。この実験は、BAR応答が細胞にトランスフェクトされたUbe3aの量に比例して変化することを実証しました(図2A)。第二に、BARアッセイを、文献22で以前に特徴付けられた疾患関連変異体をコードするプラスミドDNAを用いて試験した。これらの中には、良性変異体(R39HおよびA178T)、1つの自閉症関連機能獲得変異体(T458A)、およびさまざ...

機能の喪失と獲得がアンジェルマン症候群と自閉症スペクトラム障害の両方に関連している 遺伝子であるUbe3aのミスセンスバリアントの機能的重要性を評価するために、簡単でスケーラブルな方法が開発されました。

Ube3a変異体の機能評価のためのスケーラブルな細胞ベースの方法

The increased use of sequencing in medicine has identified millions of coding variants in the human genome. Many of these variants occur in genes ...

私たちの方法は、アンジェルマン症候群を引き起こし、Dup15q症候群として知られる自閉症の遺伝的形態と強く関連しているユビキチンリガーゼであるUbe3aの変異体の機能的影響を理解するための迅速な方法を提供します。ユビキチンリガーゼ活性の特性評価は伝統的に労働集約的で遅く、そのような方法は困難であり、Ube3aについて同定された何百もの変異体を特徴付けるのに実際には適していません。アンジェルマン症候群は母体のUbe3a遺伝子の欠失によって引き起こされますが、Dup15q症候群は母体のUbe3aの複製によって引き起こされるため、ミスセンスバリアントがUbe3a酵素の活性をどのように変化させたかを推測することが重要であり、これは各バリアントを経験的にテストせずに行うことは困難です。手順を実演するのは、私の研究室の研究技術者であるジャリン・ステルツァーです。原稿に記載されているように、ダルベッコの改変イーグル培地で摂氏37度で増殖したHEK293T細胞で、加湿容器に5%の二酸化炭素を入れてアッセイを実行することから始めます。バイオセーフティキャビネットで、吊り下げたHEK293T細胞を組織培養処理した96ウェル平底プレートにプレートし、細胞を37度で一晩インキュベートします。2日目に、バイオセーフティキャビネット内の細胞にホタルとシノイの木のルシフェラーゼレポータープラスミド、およびUbe3aプラスミドをトリプリケートでトランスフェクトします。トランスフェクションは、ウェルあたり総容量10マイクロリットルで行います。各バリアントのトランスフェクションのマスターミックスを1.5ミリリットルの微量遠心チューブで作成し、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを軽くたたいてトランスフェクション混合物を穏やかに撹拌し、10マイクロリットルのトランスフェクション混合物をウェル内の既存の増殖培地に直接加えます。その後、細胞をインキュベーターに戻し、プラスミドを48時間発現させます。蛍光顕微鏡を用いて、GFP蛍光によるトランスフェクション効率をモニターする。細胞の80%以上が48時間後にGFPを発現するはずです。トランスフェクトされたHEK293T細胞から培養液を注意深く吸引し、次に細胞を冷たいPBSで洗浄します。PBSを吸引します。細胞溶解用に25マイクロリットルの非変性溶解バッファーを加え、穏やかに揺らしながら氷上で15分間インキュベートします。次に、得られたライセート20マイクロリットルを、100マイクロリットルのホタルルシフェラーゼ基質試薬を含む新しい96ウェルアッセイプレートに加え、タップしてプレートを穏やかに混合します。プレートをプレートリーダーにロードし、読み取り高さ1ミリメートル、積分時間1秒のトップ検出器を使用して発光を測定します。ホタルルシフェラーゼ発光を読んだ直後に、100マイクロリットルのレニヤルシフェラーゼ基質をウェルに加え、ホタルルシフェラーゼ活性を消光させ、シタケルシフェラーゼ活性を評価します。穏やかなプレート攪拌によってサンプルを混合し、発光を再度測定して、Renillaルシフェラーゼ活性を評価します。レポーター応答を定量化し、野生型Ube3aに対する各変異体のホタル値とレニラ値を正規化することにより、変異体タンパク質の相対活性を比較します。野生型Ube3aをコードするプラスミドの量を増やしてトランスフェクトしたHEK293T細胞は、BAR応答の直線的な増加を示しています。BARアッセイは、プラスミドの疾患関連変異体を同定し、この方法の精度と一般性を実証します。152のUbe3a変異体のBARアッセイスクリーニングは、野生型Ube3aと比較して良性の機能喪失および機能獲得変異を示しています。Ube3aの588位での機能グルタミン酸置換の獲得、機能プロリン置換の喪失、および別の機能アルギニン置換の喪失は、劇的に異なる効果をもたらし、それによって経験的バリアント評価の重要性を強調しました。ヒートプロットは、Ube3aの位置588での包括的な突然変異分析のための正規化されたBAR結果を示しています。白い網掛けは野生型のUbe3a活性レベルを表し、青い網掛けは機能の喪失を示し、赤い網掛けは機能変異の獲得を示します。私たちの研究の臨床的意味を超えて、Ube3aはユビキチンリガーゼのHECTドメインファミリーのメンバーであり、それらはすべて保存されたHECT触媒ドメインを持っています。そして、私たちの研究の魅力的な側面の1つは、Ube3aに関する豊富な構造関数データを提供することであり、これを使用して、このクラスの酵素のより深いメカニズムの理解を得ることができます。

a-scalable-cell-based-method-for-functional-assessment-ube3a

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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ライブFRET顕微鏡法および免疫蛍光法による初期ゼブラフィッシュヌーナン症候群モデルにおけるERK活性調節を評価するための効率的なプロトコール

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Ube3a変異体の機能評価のためのスケーラブルな細胞ベースの方法

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