機能電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いた非コーディング遺伝的変異体およびDNA親和性沈殿アッセイ（DAPA）のスクリーニング

この実験戦略の全体的な目標は、疾患に関連する非コード変異の機能を調査することです。この方法は、実際にはアミノ酸配列を変化させない遺伝的変異が依然として疾患の表現型にどのように寄与しているかなど、ゲノミクスにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、機能活性の遺伝的分散を評価するための合理化されたプロセスを提供し、影響を受ける調節タンパク質と経路に関する洞察を提供することです。

この手法は、原因となる変異体が候補となるあらゆる疾患の調査に役立ちます。なぜなら、これらのバリアントを分析する手順は、研究対象の表現型に関係なく普遍的だからです。この方法は、ヒトの疾患に関する洞察を提供することができますが、あらゆる生物の突然変異にも適用できます。

この実験では、Bリンパ芽球様細胞から核溶解物を調製しますが、この手順はほとんどの細胞株に適用できます。血球計算盤で細胞をカウントした後、溶解する細胞の数をスピンダウンします。培地を吸引し、氷冷PBSを10ミリリットル加え、細胞を再度スピンダウンします。

細胞をPBSで再度洗浄し、スピン後にPBSを除去します。細胞口蓋を氷冷PBSに再懸濁し、10個あたり1ミリリットルのPBSを7番目の細胞に使用します。細胞懸濁液の1ミリリットルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに分注し、各チューブがPBS中の10〜7番目の細胞を含むようにします。

2分間遠心分離し、PBSから吸引します。CEバッファー、1ミリモルのジチオスレイトール(DTT)、1Xホスファターゼ阻害剤、および0.5ミリモルのフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)のワーキングストックに加えます。各セルパレットを400マイクロリットルのこの緩衝液で再懸濁し、氷上で15分間インキュベートします。

各微量遠心チューブに25マイクロリットルの10%ノニデットP-40を加え、ピペッティングで混合します。摂氏4度、最高速度で3分間遠心分離します。上清をデカントして捨てます。

次に、NEバッファー、1ミリモルDTT、1Xホスホアーゼ阻害剤、および1ミリモルPMSFのワーキングストックに加えます。各細胞口蓋を30マイクロリットルのこの緩衝液で再懸濁し、ボルテックスにより混合します。4°Cでチューブローテーター内で10分間インキュベートします。

2分間遠心分離します。核溶解物である透明な上清を収集します。マイナス80°Cで保存する前に核溶解物を分注して、タンパク質を分解する可能性のある複数回の凍結融解サイクルを回避してください。

この手順は、プロトコールのテキストに記載されているように、オリゴヌクレオチドの50ナノモルのワーキングストックを調製することから始めます。オリゴを摂氏90度のヒートブロックに5分間置きます。5分後、ヒートブロックをオフにし、オリゴを少なくとも1時間室温までゆっくりと冷ましてから使用してください。

次に、電気泳動移動度シフトアッセイまたはEMSAゲルを調製します。プレキャストの6%トリス-ホウ酸-EDTAまたはTBEゲルからスライドを取り出し、脱イオン水で数回すすぎ、ウェルからバッファーを取り除きます。ゲル電気泳動装置を組み立て、内部チャンバーに0.5X TBEバッファーを充填して漏れがないか確認します。

外側のチャンバーにバッファーが漏れない場合は、外側のチャンバーを約3分の2まで満たします。ゲルを100ボルトで60分間予備分析します。プレランが完了したら、各ウェルを200マイクロリットルの0.5X TBEバッファーでフラッシュします。

結合バッファーマスターミックスを調製します。微量遠心チューブ内で、すべての反応に共通するこれらの試薬を混合します。10X結合バッファー、DTTポリソルベート、ポリ(dI-dC)およびサケ精子DNA。

EMSA反応を設定するには、各微量遠心チューブにヌクレアーゼフリーの水を追加し、すべての試薬を添加した後の最終容量が20マイクロリットルになるようにします。各微量遠心チューブに適切な量のマスターミックスを加えます。8マイクログラムの核溶解物を適切な微量遠心チューブに加えます。

核抽出物を含まないオリゴを含むチューブをネガティブコントロールとして含めます。50フェムトモルのオリゴを適切な微量遠心チューブに加え、フリックして混合します。内容物をチューブの底まで短く回転させます。

すべてのチューブを室温で20分間インキュベートします。次に、2マイクロリットルの10X Orangeローディング色素を各マイクロ遠心チューブに加えます。ピペットを上下に動かして混ぜます。

ピペッティングで上下に動かして混合し、各サンプルを別々のウェルに排出して、サンプルをプレランの6%TBEゲルにロードします。オレンジ色の染料がゲルの3分の2から4分の3に移動するまで、ゲルを80ボルトで約60〜75分間泳がせます。ランが完了したら、ジェルナイフを使用してプラスチックカセットをこじ開けます。

カセットからゲルを取り出し、0.5%TBEバッファーの入った容器に入れて乾燥を防ぎます。ゲルを赤外および化学発光イメージングシステムの表面に置きます。画像を乱す可能性のある気泡や汚染物質を排除します。

プロトコルのテキストに記載されているように、スキャンシステムソフトウェアを使用してゲルをスキャンします。この手順を開始するには、プロトコールのテキストに記載されているように、5マイクロモルのオリゴワーキングストックを調製します。オリゴを摂氏95度のヒートブロックに5分間置きます。

5分後、ヒートブロックをオフにし、オリゴをゆっくりと室温まで冷ましてから使用してください。次のバッファーを室温まで温めます:結合バッファー、低ストリンジェンシー洗浄バッファー、高ストリンジェンシー洗浄バッファー、および溶出バッファー。各バリアントの結合混合物を準備します。

1容量の核溶解物と2容量の結合バッファーを混合します。1X ホスファターゼ阻害剤、0.5 ミリモル PMSF、および 1X 結合エンハンサーを添加します。10マイクロリットルの5マイクロモルビオチン化捕捉DNAを各結合混合物に加えます。

チューブを数回フリックして混ぜます。結合混合物を室温で20分間インキュベートします。次に、各結合混合物に100マイクロリットルのストレプトアビジンMicroBeadsを追加します。

室温で10分間インキュベートします。試験する各オリゴプローブについて、磁気セパレーターに結合カラムを置きます。カラムに、結合混合物に使用されたバリアントオリゴがラベルされていることを確認してください。

各結合カラムの真下に微量遠心チューブを置き、100マイクロリットルの結合バッファーを塗布してカラムをすすぎます。各結合混合物の内容物を別々のカラムにピペットで移します。液体がカラムを通ってマイクロ遠心チューブに完全に流れるようにします。

100 マイクロリットルの低ストリンジェンシー洗浄バッファーをカラムに塗布し、カラムリザーバーが空になるまで待ちます。100 マイクロリットルの低ストリンジェンシー洗浄バッファーをカラムに再度塗布します。100マイクロリットルの高ストリンジェンシー洗浄バッファーをカラムに塗布し、カラムリザーバーが空になるまで待ちます。

100 μLの高ストリンジェンシー洗浄バッファーをカラムに再度塗布します。30 マイクロリットルの天然溶出バッファーをカラムに加え、5 分間静置します。最後に、結合した転写因子を溶出するために、さらに50マイクロリットルのネイティブ溶出バッファーを添加します。

EMSAの結果の再現性と凍結融解サイクルの結果を調べるために、遺伝的変異の参照対立遺伝子または非参照対立遺伝子を含むオリゴを使用して、凍結融解を複数回繰り返した後のBリンパ球核抽出物の同じ調製を調査しました。青い矢印は空いているプローブを示します。転写因子のオリゴへの結合は、赤い矢印で示されているように、ゲルの上半分にバンドとして見られます。

これらの結果は、この特定の核抽出物を最大5回凍結融解しても、タンパク質の完全性に影響が及ばないように見えることを示しています。また、EMSAのS/N比を最適化することも重要です。さまざまな濃度のオリゴを使用して、核溶解物の1つの調製物を調査しました。

バンドの強度の増加、最大100フェムトモルのオリゴが観察されました。狼瘡関連リスク対立遺伝子の研究からの代表的な結果をここに示します。転写因子であるSTAT 1は、DAPAによって最初に同定され、続いてプロテオミクス分析

その後、DAPAウェスタンブロットにより、STAT 1の同一性、およびSTAT 1のリン酸化型がループスリスクオリゴに高結合していることが確認されました。この手順に続いて、質量分析やウェスタンブロットなどの他の手法を実行できます。これは、対立遺伝子依存性結合を示す調節タンパク質を特定するのに役立ちます。

ルシフェラーゼのようなレポーターアッセイは、対立遺伝子の機能としての遺伝子発現の変化を調べるためにも使用できます。