Name: 機能電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いた非コーディング遺伝的変異体およびDNA親和性沈殿アッセイ（DAPA）のスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: 学ぶEMSAとDAPAを用いた非コーディング遺伝的変異体の機能解析法。疾患関連変異の転写因子結合への影響を評価し、調節タンパク質と経路への洞察を提供する汎用的なプロトコルです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

プロトコル開発におけるインプットとディレクションを提供してくださったErin Zoller氏、Jessica Bene氏、Lindsey Hays氏に感謝します。MTWは、NIH R21 HG008186と、シンシナティ小児病院研究財団からの受託者賞の助成金によって部分的に支援されました。ZHPはT32 GM063483-13によって部分的に支援された。

<ol><li>Hindorff, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+etiologic+and+functional+implications+of+genome-wide+association+loci+for+human+diseases+and+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Ward, L. D., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+noncoding+genetic+variation+in+complex+traits+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Interpreting noncoding genetic variation in complex traits and human disease.</a> Nat Biotechnol. 30 (11), 1095-1106 (2012).</li>
<li>Paul, D. S., Soranzo, N., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interpretation+of+non-coding+sequence+variation%3A+concepts+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Functional interpretation of non-coding sequence variation: concepts and challenges.</a> Bioessays. 36 (2), 191-199 (2014).</li>
<li>Zhang, F., Lupski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+genetic+variants+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Non-coding genetic variants in human disease.</a> Hum Mol Genet. , (2015).</li>
<li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li>
<li>Slatkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+disequilibrium--understanding+the+evolutionary+past+and+mapping+the+medical+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Linkage disequilibrium--understanding the evolutionary past and mapping the medical future.</a> Nat Rev Genet. 9 (6), 477-485 (2008).</li>
<li>Bush, W. S., Moore, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+11%3A+Genome-wide+association+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 11: Genome-wide association studies.</a> PLoS Comput Biol. 8 (12), e1002822(2012).</li>
<li>1000 Genomes Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+map+of+genetic+variation+from+1%2C092+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes.</a> Nature. 491 (7422), 56-65 (2012).</li>
<li>Chang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+PLINK%3A+rising+to+the+challenge+of+larger+and+richer+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Gigascience%22%5BJournal%5D)">Second-generation PLINK: rising to the challenge of larger and richer datasets.</a> Gigascience. 4, 7(2015).</li>
<li>Purcell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLINK%3A+a+tool+set+for+whole-genome+association+and+population-based+linkage+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses.</a> Am J Hum Genet. 81 (3), 559-575 (2007).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Crawford, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+DNase+hypersensitive+sites+using+massively+parallel+signature+sequencing+%28MPSS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of DNase hypersensitive sites using massively parallel signature sequencing (MPSS).</a> Genome Res. 16 (1), 123-131 (2006).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAIRE+Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements%29+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">FAIRE Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).</li>
<li>Kent, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+genome+browser+at+UCSC%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The human genome browser at UCSC.</a> Genome Res. 12 (6), 996-1006 (2002).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Martens, J. H., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLUEPRINT%3A+mapping+human+blood+cell+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">BLUEPRINT: mapping human blood cell epigenomes.</a> Haematologica. 98 (10), 1487-1489 (2013).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cistrome%3A+an+integrative+platform+for+transcriptional+regulation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Cistrome: an integrative platform for transcriptional regulation studies.</a> Genome Biol. 12 (8), R83(2011).</li>
<li>Griffon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+public+ChIP-seq+experiments+reveals+a+complex+multi-cell+regulatory+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of public ChIP-seq experiments reveals a complex multi-cell regulatory landscape.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e27(2015).</li>
<li>Staudt, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lymphoid-specific+protein+binding+to+the+octamer+motif+of+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A lymphoid-specific protein binding to the octamer motif of immunoglobulin genes.</a> Nature. 323 (6089), 640-643 (1986).</li>
<li>Singh, H., Sen, R., Baltimore, D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+factor+that+binds+to+a+conserved+sequence+motif+in+transcriptional+control+elements+of+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A nuclear factor that binds to a conserved sequence motif in transcriptional control elements of immunoglobulin genes.</a> Nature. 319 (6049), 154-158 (1986).</li>
<li>Weirauch, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+inference+of+eukaryotic+transcription+factor+sequence+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Determination and inference of eukaryotic transcription factor sequence specificity.</a> Cell. 158 (6), 1431-1443 (2014).</li>
<li>Ward, L. D., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaploReg%3A+a+resource+for+exploring+chromatin+states%2C+conservation%2C+and+regulatory+motif+alterations+within+sets+of+genetically+linked+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HaploReg: a resource for exploring chromatin states, conservation, and regulatory motif alterations within sets of genetically linked variants.</a> Nucleic Acids Res. 40 (Database issue), D930-D934 (2012).</li>
<li>Boyle, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotation+of+functional+variation+in+personal+genomes+using+RegulomeDB%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Annotation of functional variation in personal genomes using RegulomeDB.</a> Genome Res. 22 (9), 1790-1797 (2012).</li>
<li>Hume, M. A., Barrera, L. A., Gisselbrecht, S. S., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniPROBE%2C+update+2015%3A+new+tools+and+content+for+the+online+database+of+protein-binding+microarray+data+on+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">UniPROBE, update 2015: new tools and content for the online database of protein-binding microarray data on protein-DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D117-D122 (2015).</li>
<li>Mathelier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JASPAR+2014%3A+an+extensively+expanded+and+updated+open-access+database+of+transcription+factor+binding+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">JASPAR 2014: an extensively expanded and updated open-access database of transcription factor binding profiles.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), 142-147 (2014).</li>
<li>Smith, M. F. Jr, Delbary-Gossart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+%28EMSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Methods Mol Med. 50, 249-257 (2001).</li>
<li>Franza, B. R., Josephs, S. F., Gilman, M. Z., Ryan, W., Clarkson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cellular+proteins+recognizing+the+HIV+enhancer+using+a+microscale+DNA-affinity+precipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Characterization of cellular proteins recognizing the HIV enhancer using a microscale DNA-affinity precipitation assay.</a> Nature. 330 (6146), 391-395 (1987).</li>
<li>LI-COR. Odyssey Infrared EMSA Kit: Instruction Manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.licor.com/bio/pack_inserts/?pi=829-07910">http://www.licor.com/bio/pack_inserts/?pi=829-07910</a> (2014).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific, Inc. BCA Protein Assay Kit: User Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf</a> (2014).</li>
<li>Wijeratne, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+separation+using+radially+aligned+titania+nanotubes+on+titanium+wire%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide separation using radially aligned titania nanotubes on titanium wire.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 7 (21), 11155-11164 (2015).</li>
<li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fastest+Western+in+Town%3A+A+Contemporary+Twist+on+the+Classic+Western+Blot+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis.</a> J. Vis. Exp. (84), (2014).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lupus+Risk+Variant+Increases+pSTAT1+Binding+and+Decreases+ETS1+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Lupus Risk Variant Increases pSTAT1 Binding and Decreases ETS1 Expression.</a> Am J Hum Genet. 96 (5), 731-739 (2015).</li>
<li>Ramana, C. V., Chatterjee-Kishore, M., Nguyen, H., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+roles+of+Stat1+in+regulating+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Complex roles of Stat1 in regulating gene expression.</a> Oncogene. 19 (21), 2619-2627 (2000).</li>
<li>Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+%28EMSA%29+for+the+Study+of+RNA-Protein+Interactions%3A+The+IRE%2FIRP+Example%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example.</a> J. Vis. Exp. (94), e52230(2014).</li>
<li>Heng, T. S., Painter, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Genome+Project%2C+C.+The+Immunological+Genome+Project%3A+networks+of+gene+expression+in+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological Genome Project, C. The Immunological Genome Project: networks of gene expression in immune cells.</a> Nat Immunol. 9 (10), 1091-1094 (2008).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioGPS%3A+an+extensible+and+customizable+portal+for+querying+and+organizing+gene+annotation+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">BioGPS: an extensible and customizable portal for querying and organizing gene annotation resources.</a> Genome Biol. 10 (11), R130(2009).</li>
<li>Wu, C., Macleod, I., Su, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioGPS+and+MyGene.info%3A+organizing+online%2C+gene-centric+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioGPS and MyGene.info: organizing online, gene-centric information.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D561-D565 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+features+and+chromatin+structure+around+the+genomic+regions+bound+by+119+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequence features and chromatin structure around the genomic regions bound by 119 human transcription factors.</a> Genome Res. 22 (9), 1798-1812 (2012).</li>
<li>Holden, N. S., Tacon, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+problems+of+the+electrophoretic+mobility+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 63 (1), 7-14 (2011).</li>
<li>Miltenyi Biotec, Inc. µMACS FactorFinder Kit: Data sheet. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macsmolecular/protein-research/biotinylated-molecule-isolation/macs-factorfinder-kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macsmolecular/protein-research/biotinylated-molecule-isolation/macs-factorfinder-kit.aspx</a> (2014).</li>
<li>Xu, J., Liu, H., Park, J. S., Lan, Y., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osr1+acts+downstream+of+and+interacts+synergistically+with+Six2+to+maintain+nephron+progenitor+cells+during+kidney+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Osr1 acts downstream of and interacts synergistically with Six2 to maintain nephron progenitor cells during kidney organogenesis.</a> Development. 141 (7), 1442-1452 (2014).</li>
<li>Yang, T. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genevar%3A+a+database+and+Java+application+for+the+analysis+and+visualization+of+SNP-gene+associations+in+eQTL+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Genevar: a database and Java application for the analysis and visualization of SNP-gene associations in eQTL studies.</a> Bioinformatics. 26 (19), 2474-2476 (2010).</li>
<li>Fort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liver+enhancer+in+the+fibrinogen+gene+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A liver enhancer in the fibrinogen gene cluster.</a> Blood. 117 (1), 276-282 (2011).</li>
<li>Solberg, N., Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase+assay+to+study+the+activity+of+a+cloned+promoter+DNA+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Luciferase assay to study the activity of a cloned promoter DNA fragment.</a> Methods Mol Biol. 977, 65-78 (2013).</li>
<li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+repressor+element+in+the+5%27-untranslated+region+of+human+Pax5+exon+1A%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A repressor element in the 5'-untranslated region of human Pax5 exon 1A.</a> Gene. 263 (1-2), 59-66 (2001).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Guided+Human+Genome+Engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

<html>シーケンシングおよびジェノタイピング技術の進歩は著しく、疾患に関連する遺伝子変異体を同定するために我々の能力を強化しているが、これらの変異体によって影響を受ける機能のメカニズムを理解するために我々の能力が遅れています。問題の主な原因は、多くの疾患関連変異体は、上のコード可能性が高い遺伝子発現を制御困難ツー予測メカニズムに影響を与えるゲノムの領域、n個に位置していることです。ここでは、EMSAとDAPA技術に基づくプロトコル、おそらく多くの非コード変異体の機能に寄与遺伝子型に依存するTF結合事象を識別するための貴重な分子ツールを提示します。これらの二つの技術は、過去に広く使用されてきたが、それらは、ごく最近TF結合の遺伝的変異の分析のために適応されています。 TFを超えて、EMSAは、プロトコル36にわずかな調整をRNA結合タンパク質の遺伝的変異の効果を分析するために使用することができます。 ove_contentは &quot;&gt;本明細書に提示プロトコルは、シンプルかつ実行するのは簡単です。それにもかかわらず、特定の部分は、実験前に追加の考慮を必要とする第一に、厳密な統計分析を行うことで、...

ゲノムワイド関連研究（GWAS）を含むシーケンシングおよびジェノタイピングベースの研究、候補遺伝子座の研究、およびディープシーケンシング研究は、統計学的疾患、形質または表現型と関連している多くの遺伝的変異を同定しました。初期の予測に反して、これらの変異体（85-93％）の大部分は非コード領域に位置しており、タンパク質1,2のアミノ酸配列を変更しません。これらの非コード変異体の機能の解釈と関連する疾患、形質または表現型にそれらを接続する生物学的メカニズムを決定することは3-6に挑戦証明されています。遺伝子発現 - 私たちは、重要な中間表現型にバリアントをリンクする分子メカニズムを識別するための一般的な戦略を開発しました。このパイプラインは、特に遺伝的変異による結合TFの調節を同定するために設計されています。この戦略を予測することを目的とした計算手法および分子生物学技術を組み合わせインシリコ候補変異体の生物学的効果、および（ 図1）、経験的に、これらの予測を検証します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54093/54093fig1.jpg" /> 図1： 非コード遺伝子変異体の解析のための戦略的アプローチ 、この原稿に関連付けられた詳細なプロトコールに含まれていない手順は灰色で網掛けされている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54093/54093fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 多くの場合、それぞれの統計的に関連する変異体と高い連鎖、不平衡（LD）にあるすべてのものを含むように変異体のリストを拡張することによって開始することが重要です。 LDは、R 2統計7によって測定することができる2つの異なる染色体位置における対立遺伝子の非ランダムな関連の尺度です。 r 2は林の尺度でありますR 2の変種間の完全な結合を示す= 1 2を持つ2つの変異体、間の影の不均衡。高LDにおける対立遺伝子は祖先集団全体の染色体上に同時分離することが判明しています。現在のジェノタイピングアレイは、ヒトゲノム中のすべての既知の亜種が含まれていません。その代わりに、彼らは人間のゲノム内のLDを利用し、LD 8の特定の領域内の他の変異体のためのプロキシとして機能する知られている変異体のサブセットを含みます。それは意味のある生物学的効果との因果バリアントバリアントとLDにあるため、このように、任意の生物学的影響のない変異体は、特定の疾患に関連することができます。手続きは、PLINK 10,11、全ゲノム関連解析のためのオープンソースのツールと互換性のあるバイナリファイルに千ゲノムプロジェクト9バリアントコールファイル（VCF）の最新リリースを変換することをお勧めします。続いて、各入力遺伝VAとLDのR 2&gt; 0.8と他のすべての遺伝的変異ほほ笑むは候補として同定することができます。変異体がヨーロッパ系の科目で同定された場合、同様の祖先の被験者からのデータは、LDの拡張のために使用されるべきで、STEP- 例えばこのための適切な参照集団を使用することが重要です。 LDの拡張はしばしば、候補変異体の数十をもたらし、これらのうちのごく一部が、疾患機構に寄与する可能性があります。多くの場合、実験的に個別にこれらの変異体のそれぞれを調べることは実行不可能です。バリアントの優先順位を決定するためのフィルタとして一般に公開機能ゲノムデータセットの数千人を活用することが有効です。例えば、ENCODEコンソーシアム12は 、DNアーゼ-seqの13、ATACなどの技術からクロマチンアクセシビリティデータと共に、文脈の広い範囲でのTFおよび補因子の結合を記述したChIP-seqの実験で何千もの、およびヒストンマークを行いました-seq 14、およびFAIRE-seqの15。 DATABこのようなUCSCゲノムブラウザ16、ロードマップエピゲノミクス17、青写真エピゲノム18、Cistrome 19、及び再マップ20としてのASおよびWebサーバは、細胞型および条件の広い範囲にわたって、これらおよび他の実験技術によって生成されたデータへの無料アクセスを提供します。実験的に調べるためにあまりにも多くの変異体が存在する場合、これらのデータは、関連する細胞および組織型における可能性の調節領域内に位置するものを優先順位付けするために使用することができます。さらに、変異体​​は、特定のタンパク質のためのChIP-seqのピークの範囲内にある場合には、これらのデータは、特定のTF（複数可）またはその影響を与える可能性があります結合補因子に関して潜在的なリードを提供することができます。 次に、優先順位を付け、得られた変異体は、EMSA 21,22を使用して予測結合遺伝子型依存性タンパク質を検証するために実験的にスクリーニングされます。 EMSAは、非還元TBEゲル上でオリゴの移行の変化を測定します。蛍光標識オリゴとともにインキュベートします核溶解液、および核因子の結合は、ゲル上のオリゴの動きを遅らせるます。このように、より多くの核因子を結合した​​オリゴは、スキャン時に強い蛍光シグナルとして提示します。特に、EMSAは、バインディング影響される特定のタンパク質についての予測を必要としません。 変異体は、予測調節領域内に位置し、示差的結合核因子することができるされていることが確認されると、計算方法は、その結合それらが影響する可能性のある特定のTF（複数可）を予測するために使用されます。私たちは、CIS-BP 23,24、RegulomeDB 25、UniProbe 26、およびJASPAR 27を使用することを好みます。候補者のTFが識別されると、これらの予測は、具体的には、これらのTF（EMSA-スーパーシフトとDAPA-西部劇）に対する抗体を用いて試験することができます。 EMSA-スーパーシフトは、核溶解液とオリゴにTF特異的抗体の添加を含みます。 EMSA-スーパーシフトで陽性の結果がのreprですEMSAバンドのさらなるシフト、またはバンドの損失としてesented（参照28に概説されています）。相補DAPAにおいて、変異体および20塩基対の隣接ヌクレオチドを​​含む5 &#39;ビオチン化オリゴ二本鎖を特異的オリゴを結合、核因子を捕捉するために、関連する細胞型（複数可）からの核溶解物と共にインキュベートします。オリゴ二重核因子複合体を磁気カラムにビーズをストレプトアビジンにより固定されています。バインドされた核要因が溶出29,48を介して直接収集されます。結合予測は、その後、タンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロットによって評価することができます。明らかな予測、またはあまりにも多くの予測が存在しない場合には、DAPA実験の変異プルダウンからの溶出は、質量分析を使用して候補のTFを同定するためにプロテオミクスコアに送信することができ、続いて前述のこれらを使用して検証することができますメソッド。 articlの残りの部分でE、EMSA及び遺伝的変異のDAPA分析のための詳細なプロトコルが提供されます。

<table><tbody><tr><td>カスタムDNAオリゴヌクレオチド</td><td>統合されたDNA技術</td><td></td><td></td></tr><tr><td>http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry 塩化カリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP366-500</td><td>KCl、CEバッファーHEPES</td></tr><tr><td>(1 M)用フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>15630-080</td><td>CEおよびNE</td></tr><tr><td>バッファーEDTA(0.5M)、pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>R1021</td><td>CE、NE、およびアニーリングバッファー用</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>NaCl、NEバッファー用</td></tr><tr><td>Tris-HCl (1M)、pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>BP1756-100</td><td>アニーリングバッファー</td></tr>用 <tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (1x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21040CM</td><td>PBS、細胞洗浄用</td></tr><tr><td>DL-ジチオスレイトール溶液 (1 M)</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td>還元剤</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Thermo Scientific</td><td>87786</td> TFs <td></td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤カクテル</td>の異化作用を防止します&nbsp;<td>Thermo Scientific</td><td>78420</td><td>TFの脱リン酸化を防止</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 核</td>抽出用の代替<td>IBI Scientific</td><td>IB01140</td><td>NP-40</td></tr><tr><td>BCAタンパク質アッセイキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>タンパク質濃度の測定用</td></tr><tr><td>Odyssey EMSAバッファーキット</td><td>Licor</td><td>829-07910</td><td>必要なすべてのEMSAバッファーを含む</td></tr><tr><td>TBEゲル、6%、12ウェル</td><td>Invitrogen</td><td>EC6265BOX</td><td>EMSA</td></tr><tr><td>TBE バッファー用 (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B52</td><td>For EMSA</td></tr><tr><td>FactorFinder Starting Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-318</td><td>必要なすべてのDAPAバッファーが含まれています</td></tr><tr><td>Licor Odyssey CLx</td><td>Licor</td><td></td><td>DAPA/EMSA用推奨スキャナー</td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>10,000ユニット/ mlのペニシリン、10,000&microが含まれています。ストレプトマイシンのg / ml、および25 &micro;菌類のg/ml&reg;Antimycotic薬剤</td></tr><tr><td>のウシの胎児の血清</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td>FBS、培養媒体</td></tr><tr><td>RPMI 1640 媒体のための</td><td>Gibco</td><td>22400-071</td><td>Lグルタミンおよび25 mM HEPESを含んでいる</td></tr></tbody></table>

機能電気泳動移動度シフトアッセイ（emsa）を用いた非コーディング遺伝的変異体およびdna親和性沈殿アッセイ（dapa）のスクリーニング

Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) and DNA-affinity Precipitation Assay (DAPA)

集団および家族ベースの遺伝学的研究は、通常、臨床的疾患または表現型と統計的に関連する遺伝的変異の特定をもたらします。多くの疾患や形質では、ほとんどの変異体はノンコーディングであるため、遺伝子発現を制御する微妙で比較的予測が難しいメカニズムに影響を与えることで作用する可能性があります。ここでは、ノンコーディングバリアントを優先し、その機能をスクリーニングするための一般的な戦略的アプローチについて説明します。このアプローチには、機能ゲノムデータベースを使用した計算の優先順位付けと、それに続くリスク対立遺伝子および非リスク対立遺伝子への転写因子(TF)の差次的結合の実験的分析が含まれます。遺伝的変異の電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)およびDNA親和性沈殿アッセイ(DAPA)分析の両方で、合成DNAオリゴヌクレオチド(オリゴ)を使用して、疾患または表現型関連細胞の核溶解物中の因子を同定します。EMSAでは、結合した核因子の有無にかかわらずオリゴヌクレオチド(多くの場合TF)を、トリス-ホウ酸-EDTA(TBE)ポリアクリルアミドゲル上の非変性電気泳動により分析します。DAPAでは、オリゴヌクレオチドを磁気カラムに結合させ、DNA配列に特異的に結合する核因子を溶出し、質量分析または還元型ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分析し、その後ウェスタンブロット分析を行います。この一般的なアプローチは、あらゆる疾患、形質、表現型に関連するノンコーディング遺伝的変異の機能を研究するために広く使用できます。

このセクションでは、EMSAまたはDAPAを実行するときに何を期待するの代表的な結果が提供され、そして溶解物の品質に関して変動性が特徴です。例えば、複数回の凍結融解のタンパク質試料は変性をもたらし得ることが示唆されています。これらの「凍結融解」サイクルの文脈においてEMSA分析の再現性を調査するために、1遺伝子変異体で異なる2 35 bpのオリゴが指示された量のために解凍し、再凍結した核溶解物の単一バッチと共にインキュベートしました。回の図2を 、この特定のBリンパ球の核抽出液まで5回凍結融解することは、一見するタンパク質の完全性に影響を与えないことを示しています。しかし、核タンパク質の安定性は、サンプルによって異なりますので、使用する個々のセルラインでテストする必要があります。異なるバッチpreparからの変化を有することも可能です核溶解物のations。この変化は溶解前に、細胞継代数、または他の要因に細胞周期の段階によるものであるかどうかは、実際の結果を確実にするために、溶解物の異なるバッチを使用して、EMSAの結果を再現することが重...

転写因子(TF)DNA結合に影響を与える非コード遺伝的変異を特定するための戦略的な計画とプロトコルを提示します。遺伝子型依存性TF DNA結合の電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)およびDNAアフィニティー沈殿アッセイ(DAPA)分析のための詳細な実験プロトコルが提供されています。

機能電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いた非コーディング遺伝的変異体およびDNA親和性沈殿アッセイ（DAPA）のスクリーニング

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical ...

この実験戦略の全体的な目標は、疾患に関連する非コード変異の機能を調査することです。この方法は、実際にはアミノ酸配列を変化させない遺伝的変異が依然として疾患の表現型にどのように寄与しているかなど、ゲノミクスにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、機能活性の遺伝的分散を評価するための合理化されたプロセスを提供し、影響を受ける調節タンパク質と経路に関する洞察を提供することです。この手法は、原因となる変異体が候補となるあらゆる疾患の調査に役立ちます。なぜなら、これらのバリアントを分析する手順は、研究対象の表現型に関係なく普遍的だからです。この方法は、ヒトの疾患に関する洞察を提供することができますが、あらゆる生物の突然変異にも適用できます。この実験では、Bリンパ芽球様細胞から核溶解物を調製しますが、この手順はほとんどの細胞株に適用できます。血球計算盤で細胞をカウントした後、溶解する細胞の数をスピンダウンします。培地を吸引し、氷冷PBSを10ミリリットル加え、細胞を再度スピンダウンします。細胞をPBSで再度洗浄し、スピン後にPBSを除去します。細胞口蓋を氷冷PBSに再懸濁し、10個あたり1ミリリットルのPBSを7番目の細胞に使用します。細胞懸濁液の1ミリリットルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに分注し、各チューブがPBS中の10〜7番目の細胞を含むようにします。2分間遠心分離し、PBSから吸引します。CEバッファー、1ミリモルのジチオスレイトール(DTT)、1Xホスファターゼ阻害剤、および0.5ミリモルのフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)のワーキングストックに加えます。各セルパレットを400マイクロリットルのこの緩衝液で再懸濁し、氷上で15分間インキュベートします。各微量遠心チューブに25マイクロリットルの10%ノニデットP-40を加え、ピペッティングで混合します。摂氏4度、最高速度で3分間遠心分離します。上清をデカントして捨てます。次に、NEバッファー、1ミリモルDTT、1Xホスホアーゼ阻害剤、および1ミリモルPMSFのワーキングストックに加えます。各細胞口蓋を30マイクロリットルのこの緩衝液で再懸濁し、ボルテックスにより混合します。4°Cでチューブローテーター内で10分間インキュベートします。2分間遠心分離します。核溶解物である透明な上清を収集します。マイナス80°Cで保存する前に核溶解物を分注して、タンパク質を分解する可能性のある複数回の凍結融解サイクルを回避してください。この手順は、プロトコールのテキストに記載されているように、オリゴヌクレオチドの50ナノモルのワーキングストックを調製することから始めます。オリゴを摂氏90度のヒートブロックに5分間置きます。5分後、ヒートブロックをオフにし、オリゴを少なくとも1時間室温までゆっくりと冷ましてから使用してください。次に、電気泳動移動度シフトアッセイまたはEMSAゲルを調製します。プレキャストの6%トリス-ホウ酸-EDTAまたはTBEゲルからスライドを取り出し、脱イオン水で数回すすぎ、ウェルからバッファーを取り除きます。ゲル電気泳動装置を組み立て、内部チャンバーに0.5X TBEバッファーを充填して漏れがないか確認します。外側のチャンバーにバッファーが漏れない場合は、外側のチャンバーを約3分の2まで満たします。ゲルを100ボルトで60分間予備分析します。プレランが完了したら、各ウェルを200マイクロリットルの0.5X TBEバッファーでフラッシュします。結合バッファーマスターミックスを調製します。微量遠心チューブ内で、すべての反応に共通するこれらの試薬を混合します。10X結合バッファー、DTTポリソルベート、ポリ(dI-dC)およびサケ精子DNA。EMSA反応を設定するには、各微量遠心チューブにヌクレアーゼフリーの水を追加し、すべての試薬を添加した後の最終容量が20マイクロリットルになるようにします。各微量遠心チューブに適切な量のマスターミックスを加えます。8マイクログラムの核溶解物を適切な微量遠心チューブに加えます。核抽出物を含まないオリゴを含むチューブをネガティブコントロールとして含めます。50フェムトモルのオリゴを適切な微量遠心チューブに加え、フリックして混合します。内容物をチューブの底まで短く回転させます。すべてのチューブを室温で20分間インキュベートします。次に、2マイクロリットルの10X Orangeローディング色素を各マイクロ遠心チューブに加えます。ピペットを上下に動かして混ぜます。ピペッティングで上下に動かして混合し、各サンプルを別々のウェルに排出して、サンプルをプレランの6%TBEゲルにロードします。オレンジ色の染料がゲルの3分の2から4分の3に移動するまで、ゲルを80ボルトで約60〜75分間泳がせます。ランが完了したら、ジェルナイフを使用してプラスチックカセットをこじ開けます。カセットからゲルを取り出し、0.5%TBEバッファーの入った容器に入れて乾燥を防ぎます。ゲルを赤外および化学発光イメージングシステムの表面に置きます。画像を乱す可能性のある気泡や汚染物質を排除します。プロトコルのテキストに記載されているように、スキャンシステムソフトウェアを使用してゲルをスキャンします。この手順を開始するには、プロトコールのテキストに記載されているように、5マイクロモルのオリゴワーキングストックを調製します。オリゴを摂氏95度のヒートブロックに5分間置きます。5分後、ヒートブロックをオフにし、オリゴをゆっくりと室温まで冷ましてから使用してください。次のバッファーを室温まで温めます:結合バッファー、低ストリンジェンシー洗浄バッファー、高ストリンジェンシー洗浄バッファー、および溶出バッファー。各バリアントの結合混合物を準備します。1容量の核溶解物と2容量の結合バッファーを混合します。1X ホスファターゼ阻害剤、0.5 ミリモル PMSF、および 1X 結合エンハンサーを添加します。10マイクロリットルの5マイクロモルビオチン化捕捉DNAを各結合混合物に加えます。チューブを数回フリックして混ぜます。結合混合物を室温で20分間インキュベートします。次に、各結合混合物に100マイクロリットルのストレプトアビジンMicroBeadsを追加します。室温で10分間インキュベートします。試験する各オリゴプローブについて、磁気セパレーターに結合カラムを置きます。カラムに、結合混合物に使用されたバリアントオリゴがラベルされていることを確認してください。各結合カラムの真下に微量遠心チューブを置き、100マイクロリットルの結合バッファーを塗布してカラムをすすぎます。各結合混合物の内容物を別々のカラムにピペットで移します。液体がカラムを通ってマイクロ遠心チューブに完全に流れるようにします。100 マイクロリットルの低ストリンジェンシー洗浄バッファーをカラムに塗布し、カラムリザーバーが空になるまで待ちます。100 マイクロリットルの低ストリンジェンシー洗浄バッファーをカラムに再度塗布します。100マイクロリットルの高ストリンジェンシー洗浄バッファーをカラムに塗布し、カラムリザーバーが空になるまで待ちます。100 μLの高ストリンジェンシー洗浄バッファーをカラムに再度塗布します。30 マイクロリットルの天然溶出バッファーをカラムに加え、5 分間静置します。最後に、結合した転写因子を溶出するために、さらに50マイクロリットルのネイティブ溶出バッファーを添加します。EMSAの結果の再現性と凍結融解サイクルの結果を調べるために、遺伝的変異の参照対立遺伝子または非参照対立遺伝子を含むオリゴを使用して、凍結融解を複数回繰り返した後のBリンパ球核抽出物の同じ調製を調査しました。青い矢印は空いているプローブを示します。転写因子のオリゴへの結合は、赤い矢印で示されているように、ゲルの上半分にバンドとして見られます。これらの結果は、この特定の核抽出物を最大5回凍結融解しても、タンパク質の完全性に影響が及ばないように見えることを示しています。また、EMSAのS/N比を最適化することも重要です。さまざまな濃度のオリゴを使用して、核溶解物の1つの調製物を調査しました。バンドの強度の増加、最大100フェムトモルのオリゴが観察されました。狼瘡関連リスク対立遺伝子の研究からの代表的な結果をここに示します。転写因子であるSTAT 1は、DAPAによって最初に同定され、続いてプロテオミクス分析が行われました。その後、DAPAウェスタンブロットにより、STAT 1の同一性、およびSTAT 1のリン酸化型がループスリスクオリゴに高結合していることが確認されました。この手順に続いて、質量分析やウェスタンブロットなどの他の手法を実行できます。これは、対立遺伝子依存性結合を示す調節タンパク質を特定するのに役立ちます。ルシフェラーゼのようなレポーターアッセイは、対立遺伝子の機能としての遺伝子発現の変化を調べるためにも使用できます。

screening-for-functional-non-coding-genetic-variants-using

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

自閉症や統合失調症などの一般的な疾患を引き起こすのde...

そのような自閉症や統合失調症のような一般的な疾患でのde novo変異を同定するための戦略

このビデオでは、赤外線蛍光標識DNAプローブを使用してタンパク質-DNA相互作用を検出する電気泳動移動度シフトアッセイを実演します。タンパク質がDNAプローブに結合すると、大きな複合体が形成され、ゆっくりと移動し、ゲル上にシフトしたバンドとして現れます。...

転写因子-DNA複合体の検出のための電気泳動移動度シフトアッセイ

このビデオの記事は、遺伝子標的と2成分系の応答調節因子の結合部位を決定するためのin vitroのマイクロアレイベースの方法を説明します。...

細菌のための2つの成分​​規制システムを遺伝子標的を決定するために、DNA親和性精製チップ（DAP-チップ）方法

ここでは、RNA /タンパク質相互作用を分析するためのプロトコルを提示する。電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）は、ネイティブゲル電気泳動中のRNA /タンパク質複合体および遊離RNAの差動移動に基づいている。放射性標識RNAプローブを用いて、RNA /タンパク質複合体は、オートラジオグラフィーによって可視化することができる。...

IRE / IRP例：RNA  - タンパク質相互作用の研究のための電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）

ここで重要な生物学的質問に取り組むためのケーススタディとして、赤外蛍光色素標識DNAプローブと一緒に精製されたSOX-2タンパク質を用いた蛍光電気泳動移動度シフトアッセイ（FEMSA）の最適化されたプロトコルを記述します。...

赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

ここでは、ドロップオフ ddPCR と加水分解プローブの一意のペアを使用して単一の反作用で対象地域の複数の遺伝子の変異を正確に定量化するためのプロトコルを提案する.

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

デジタルのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) は、単一のヌクレオチドの亜種と DNA コピー数変異体の高感度検出のための便利なツールです。ここでは、管内チップ形式でデジタル PCR...

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

ここでは、患者の生体液(生体流体)に存在する循環DNAにおける腫瘍体細胞変異を検出するプロトコルを提示する。当社の液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)ベースの方法は、腫瘍変異アレーリン周波数(MAF)の定量化を可能にし、腫瘍応答の診断および時間的モニタリングに最小限に侵襲的な補体を促進する。...

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

この記事では、血管免疫芽球性リンパ腫におけるサンガーシーケンシングに基づく低周波検出法の応用について紹介します。この方法を他の病気に適用するための基礎を提供します。...

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

ダーク/ライト遷移テストは、マウスの不安様行動を測定するために最も広く使用されている試験の一つです。ここで、我々はテストを行う方法についての詳細な手順を示して映画を紹介。...

マウス用ダーク/ライト遷移テスト

学ぶEMSAとDAPAを用いた非コーディング遺伝的変異体の機能解析法。疾患関連変異の転写因子結合への影響を評価し、調節タンパク質と経路への洞察を提供する汎用的なプロトコルです。

機能電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いた非コーディング遺伝的変異体およびDNA親和性沈殿アッセイ（DAPA）のスクリーニング

さらに動画を探す