scRNA-SeqおよびscATAC-Seqを用いた網膜遺伝子発現およびクロマチンアクセシビリティの多重化解析
March 12th, 2021
ここで著者らは、網膜におけるトランスクリプトームおよびクロマチンアクセシビリティプロファイルを特徴付ける際の表現型決定およびその後のscRNA-seqおよびscATAC-seqのペアに対するMULTI-seqの有用性を示す。
このプロトコルにより、初期表現型にシングルセルRNA-seqを使用できるようになります。そして、シングルセルATAC-seqと組み合わせると、遺伝子制御ネットワークの再構築が可能になります。MULTI-seqを使用することで、初期調査のコストを低く抑え、シングルセルRNA-seqとシングルセルATAC-seqのペアサンプルを固定することで、遺伝子制御ネットワークの時間経過解析が可能になります。
研究者はこのプロトコルを利用して、発生と疾患の進行を制御する遺伝子ネットワークを理解できます。まず、各サンプルに20マイクロリットルのアンカーバーコード溶液を加え、ピペットで混ぜます。氷上で5分間インキュベートします。
次に、各サンプルに20マイクロリットルのコアンカー溶液を加え、氷上でさらに5分間インキュベートします。各サンプルに1ミリリットルの氷冷1%BSAおよびPBSを加え、細胞を300 x gで摂氏4度で5分間遠心分離します。細胞ペレットを乱すことなく上清を除去する。
次に、400マイクロリットルの氷冷1%BSAとPBSを追加します。300 x gで摂氏4度で5分間遠心分離します。血球計算盤を使用して各サンプルの細胞濃度を決定し、ゲルビーズインエマルジョンまたはGEMに必要な細胞の総数と体積を計算します。
各サンプルから計算された容量を新しい滅菌1.5ミリリットルチューブに組み合わせ、組み合わせたサンプルの最終細胞濃度を決定します。GEMの生成とバーコード化の後、サイズ選択を使用して遺伝子発現cDNAクリーンアップを実行し、サンプルバーコードを含む最初の選択ラウンドの上清を廃棄しないようにします。上清を新しい滅菌1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、氷上に保管します。
常磁性ビーズベースのサイズ選択試薬をボルテックスし、260マイクロリットルの試薬と180マイクロリットルの100%イソプロパノールを上清に加えます。混合物を10回ピペットし、室温で5分間インキュベートする。チューブを磁気ラックに置き、溶液がクリアするのを待ちます。
溶液が透明になったら、上清を取り除いて廃棄します。500マイクロリットルの80%エタノールをビーズに30秒間加え、上清を捨てます。これを合計2回の洗浄で繰り返します。
ビーズを短時間遠心分離し、磁気ラックに戻します。タイマーを 2 分に設定します。次に、P10ピペットで残留エタノールを取り除き、残りの2分間磁気ラック上のビーズを風乾します。
磁気ラックからビーズを取り出し、100マイクロリットルの溶出バッファーに再懸濁します。ピペットで十分に再懸濁し、室温で2分間インキュベートした後、ビーズを磁気ラックに戻し、溶液が透明になるのを待ちます。上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
示されているように、半分の量の溶出バッファーを使用してクリーンアップを繰り返します。scATACシーケンス用のサンプルについては、P200ピペットを使用してマイクロ遠心チューブから液体を取り除き、エタノールドライアイスでサンプルをフラッシュフリーズします。scRNAシーケンシング用のサンプル中の細胞を解離するには、テキスト原稿に記載されているように、パパインを使用して解離ステップを実行します。
細胞を300 x gで室温で3分間遠心分離し、細胞ペレットを破砕することなく上清を除去した。1ミリリットルの冷やしたPBSを加え、10回または細胞が完全に懸濁するまで混合します。再度、摂氏4度で300 x gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄を2回繰り返します。
最低速度設定でチューブのボルテックスを開始し、900マイクロリットルのチルドメタノールを一滴ずつ加えながら、チューブを穏やかにボルテックスして細胞の凝集を防ぎます。細胞を氷上で15分間インキュベートします。血球計算盤を用いて固定細胞の濃度を測定し、トリパンブルーを用いて固定工程の有効性を評価した。
凍結組織と固定細胞は摂氏マイナス80度で保管してください。マルチシーケンスバーコードは、複数のサンプルの複合シーケンシングとそれに続く計算デコンボリューションを可能にします。原点のサンプルは、バーコード表現に基づいて各セルについて決定することができる。
これらの組み合わせたサンプルは、細胞クラスタリングと細胞タイプの同定の目的で単一のデータセットとして分析できます。各細胞はGEM生成前にバーコード化されているため、細胞ダブレットは複数のMULTIシーケンスバーコードの発現を示す確率が高く、クラスタリングおよび細胞タイプの同定の前にダブレットの大部分を識別および除去できます。シングルセルATACシーケンシングを使用して、シングルセルRNAシーケンシングで見つかった細胞タイプと一致する細胞タイプのデータセットを生成できます。
シングルセルRNAシーケンシング遺伝子発現とシングルセルATACシーケンシングDNAアクセシビリティ情報を組み合わせることで、遺伝子制御ネットワークの再構築が可能になります。プロトコルを試みるときは、エスノール蒸発の2分間のタイミングが、後続の溶出ステップでのシーケンス検索にとって重要であることに注意してください。ペアのシングルセルRNA-seqとシングルセルATAC-seqを使用して遺伝子制御ネットワークを再構築すると、遺伝子過剰発現およびノックアウト研究のターゲットが作成されます。
この段階でMULTI-seqを使用して、細胞型特異的効果を同定することができます。
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概要
この研究は、MULTI-seqの表現型解析への応用を示し、網膜細胞における転写蓋とクロマチンアクセシビリティを特徴づけるために、ペアを組んだ単一細胞RNAシーケンシング（scRNA-seq）と単一細胞ATACシーケンシング（scATAC-seq）に続きました。この方法は、初期の費用効果的な調査と、時間の経過に伴う遺伝子調節ネットワークの分析を組み合わせることを可能にします。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- ゲノミクス
- 細胞生物学
背景
- 初期の表現型解析に単一細胞RNA-seqが利用されます。
- 単一細胞ATAC-seqとペアを組むことで、遺伝子調節ネットワークの再構築が可能になります。
- MULTI-seqは初期調査のコストを削減します。
- 遺伝子調節ネットワークの時間経過解析を可能にします。
研究の目的
- 発達を制御する遺伝子ネットワークを理解すること。
- 細胞レベルの洞察を通じて疾患の進行を調査すること。
- 高スループットシーケンシングのための費用効果の高い方法論を活用すること。
使用された方法
- 単一細胞RNA-seqと単一細胞ATAC-seqプラットフォームを使用しました。
- 網膜細胞の反応に焦点を当てました。
- インキュベーション、遠心分離、マルチシーケンスバーコーディングなどの重要なステップを採用しました。
- サンプル準備、固定、シーケンス手順の詳細なプロセス。
主要な結果
- 包括的なプロファイリングのためのscRNA-seqとscATAC-seqの効果的なペアリングを示しました。
- 網膜サンプル全体での遺伝子発現とクロマチンアクセシビリティの調整を特定しました。
- 発達と疾患中の遺伝子調節ネットワークのダイナミクスに関する洞察を提供しました。
結論
- この研究は網膜細胞における遺伝子調節ネットワークの理解を深めます。
- 発達および疾患関連のメカニズムの解明に直接貢献します。
- MULTI-seqを用いた高スループット単一細胞分析の実用的な意味を強調します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding retinal gene regulatory networks is critical for identifying therapeutic targets in ocular diseases. The integration of scRNA-seq and scATAC-seq enables mechanistic de-risking by linking chromatin accessibility to transcriptional output. This approach supports target validation and predictive confidence in preclinical discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through paired gene expression and chromatin accessibility profiling.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying regulatory mechanisms in retinal cell types.
- Predictive Value: Identifies targets for overexpression and knockout studies to validate functional relevance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates matched molecular readouts for compound screening in disease-relevant retinal models.
- Operational Value: MULTI-seq barcoding increases experimental throughput and reduces cost per sample.
- Scalability: Enables time-course analysis of gene regulatory networks across developmental or disease stages.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by profiling retinal cells across conditions.
- Operational Value: Fixation and barcoding steps allow sample preservation and multi-sample coordination.
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment by linking chromatin states to cell-type-specific expression.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, enabling hypothesis testing and pathway clarification before compound screening.
- Discovery Biology: Supports reconstruction of gene regulatory networks to clarify mechanism of action.
- Screening: Prepares standardized, barcoded retinal cell systems for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of gene expression and chromatin accessibility for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through matched multi-omic profiles.
- Enterprise Reuse: MULTI-seq enables cost-effective sample multiplexing across projects and time points.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic linkage of epigenomic and transcriptomic states.
- Operational Value: Standardization via fixation, barcoding, and cleanup protocols ensures reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing ambiguity in target biology.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of retinal targets based on regulatory network activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell genomics and retinal tissue dissociation.
- Depends on access to scRNA-seq and scATAC-seq platforms and magnetic bead-based size selection.
- Necessitates cross-team standardization for barcode design and sample handling.
- Involves adaptation considerations for fixation efficiency across retinal cell types.
- Limited by doublet formation risk if barcode separation is insufficient during elution.
