Name: スクリーニング応用のためのヒトiPS細胞由来神経細胞-アストロサイト共培養の3次元バイオプリンティング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学ぶ3Dバイオプリンティングを用いたヒトiPS細胞由来神経細胞とアストロサイトの共培養法。ハイドロゲルスカフォールド内で高生存率と神経突起伸長を実現し、スクリーニング応用に適した自動化モデルを構築します。

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著者らは、プロトコルの開発と原稿へのフィードバックに協力してくれたAlex Volkerling、Martin Engel、Rachel Bleachに感謝します。

iPS細胞由来ニューロンとアストロサイトの3Dバイオプリント共培養

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<li>von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+search+for+true+numbers+of+neurons+and+glial+cells+in+the+human+brain%3A+A+review+of+150+years+of+cell+counting%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting.</a> The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).</li>
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CW、NC、JBは、英国ロンドンのMerck Sharp & Dohme (UK) Limitedの従業員です。YHは、Merck & Co., Inc.(米国ニュージャージー州ラーウェイ)の子会社であるMerck Sharp & Dohme LLCの従業員です。
図 1 は Biorender.com を使用して作成されました。

中枢神経系の正確なモデルの必要性はかつてないほど高まっており、2次元(2D)の従来の細胞培養モデルの限界により、近年、複雑な中枢神経系モデルが生成されています19。しかし、神経細胞タイプとECMの間の相互作用を表す多くの複雑な3Dモデルには、これらのモデルを工業プロセスに適用できない限界があります6,20,21。このプロトコルでは、ヒトiPS細胞由来のニューロンとアストロサイトの3D共培養モデルを開発し、3Dバイオプリンティング技術を使用してこれらの制限のいくつかを解決し、96ウェルおよび384ウェルフォーマットの生理活性ハイドロゲル足場を作成することを目的としています。
これらのモデルを開発するための方法論は、プレートマップ設計ソフトウェア、自動生成された印刷プロトコル、およびバイオプリンターからのガイド付き印刷プロセスによって簡素化されています。ただし、このプロトコルで使用される感受性iPS細胞由来細胞の種類は繊細であるため、融解と培養において以下の重要なステップに注意する必要があります。第一に、ROCK阻害剤(ROCKi)の含有は、バイオプリンティングプロセス全体および初期培養中にいくつかの利点があります。細胞の融解は、ニューロンがストレス反応を経験する可能性のある臨界点であり、不適切な融解プロトコルは生存の可能性を低下させる可能性があります22。通常、細胞を融解し、培地を添加し、細胞をできるだけ効率的にインキュベーター温度まで上昇させることが推奨されます23。但し、このプロトコルで記述されているbioprintingプロセスの間に、ニューロンおよびastrocytesは媒体よりもむしろ活性剤の解決で再懸濁されることが必要であり、細胞は印刷の操業の終わりまで室温より高く上げられない(解凍後30分まで)。したがって、融解直後にROCKiを培地に添加し、2つの遠心分離ステップ(ステップ2.1--2.7および1.3.15-1.3.20)でこれを含めることは、細胞ストレス経路を阻害するために不可欠であり、その結果、生存率レベルが低下します24。さらに、ROCKiは神経突起伸長を促進し、神経細胞の成熟を改善することが示されている25。したがって、ROCKiの補給はバイオプリンティング後48時間継続されます。ただし、細胞をアッセイに使用する前に、その後の培地交換時に完全にウォッシュオフするために、48時間後にROCKi添加物を除去することが不可欠です。
さらに注意が必要なステップは、印刷後のメディアの追加とメディアの交換(ステップ2.8-2.13)です。バイオプリントされたハイドロゲルの足場は、灰白質と同等のわずか1.1 kPaの同等の生体力学的剛性を持っています。ステップ2.10で説明したように、培地の添加および吸引中は、妨害を防ぐためにウェルの側面にピペットで静かに移すことが重要です。これは、ゲルレベルがウェルの総容量に占める割合が高い 384 ウェルプレートに特に関連しています。この方法は、細胞のエッジリフトや神経突起伸長の剪断を防ぐために、2Dコントロールウェルでも使用する必要があります。また、著者らは、iPS細胞由来の細胞培養に使用されるバイオセーフティキャビネットと同等の注意を払って取り扱う必要があるバイオプリンター内の無菌技術の重要性を強調したいと考えています。これには、グリーンライトと印刷手順で使用される70%EtOHおよびdH2Oの滅菌ろ過、バイオプリンターに手を出し入れしながらカートリッジとプレートの蓋を保管すること、印刷前後に70%エタノールワイプでバイオプリンター内の表面を除染することが含まれます。
このモデルを開発するために選ばれたバイオインクと活性剤溶液から形成されたバイオプリントハイドロゲル足場は、RASTRUMバイオプリンターで使用するためにInventia Life Scienceが開発したさまざまなバイオインクと活性剤溶液から選択されています。ラミニンとヒアルロン酸は、軸索誘導、シナプス形成、および神経周囲網の形成における役割により、iPS細胞由来の神経細胞の成熟に関連する分子として同定されました26,27。さらに、低密度のハイドロゲルがニューロンからのより優れた神経突起伸長を可能にすることが示されているため、1.1 kPaの生体力学的剛性が選択されました12。社内または別の商用サプライヤーから分化したニューロンおよびアストロサイトを使用してプロトコルに変更を加える場合は、最も支持的なハイドロゲル足場を決定するためにマトリックス選択試験を行うことが推奨されるであろう15。さらに、最適な生存率を確保し、ハイドロゲルの過密状態を防ぐために細胞源を変更する場合は、細胞密度を最適化する必要もあります。著者らは、バイオプリンター機能に関連するすべての変更とトラブルシューティングについて、メーカーに連絡し、メーカーのプロトコルを参照することを推奨しています。
中枢神経系には、幅広い神経細胞のサブタイプとグリア細胞が含まれており、それらはすべて異なる脳のニッチに存在し、神経機能に寄与する特定の役割を持っています28。この広い範囲の文脈の中で、このモデルは最も豊富な2つの細胞タイプ(星状細胞と興奮性グルタミン酸作動性ニューロン)のみを表しています。ミクログリア、オリゴデンドロサイト、血液脳関門形成内皮細胞などの重要な細胞型は、このシステムから除外されています。ミクログリアを含めることは、神経免疫相互作用に焦点を当てる上で関連性がある可能性があり、オリゴデンドロサイトは中枢髄鞘形成に影響を与える疾患に関心がある可能性があります。病理学におけるそれらの役割に加えて、血液脳関門形成内皮細胞などの細胞は薬物代謝酵素を排泄し、薬物動態アッセイのためのこのモデルの使用に影響を与える可能性があります29。モデルのさらなる制限は、ニューロンに対するアストロサイトの比率である可能性があります。アストロサイトとニューロンの比率は脳領域によって大きく異なり、推奨値は1:1から1:3の間である30,31。このモデルのアストロサイトとニューロンの比率はおおよそ1:1.5です。したがって、このモデルは、白質野など、アストロサイトがより豊富にある脳領域のモデルには関係がない可能性があります30。
近年、3Dバイオプリント共培養モデルを開発するための他のプロトコルが発表されています。Sullivan et al., 2021の論文では、iPS細胞由来の神経前駆細胞を用いた3Dバイオプリントされた神経モデルが発表され、2D培養と比較して、プリント後の高い生存率と神経機能の増強が実証されています32。但し、このプロトコルでは、神経の前駆細胞は細胞源として使用され、4週間培養で維持された。このプロトコルでは、市販のiPS細胞由来のグルタミン酸作動性ニューロンとアストロサイトを使用しました。これにより、共培養細胞の3Dネットワークをわずか7日で確立できます。神経突起増殖解析によって実証されているように、神経突起伸長は24時間以内に始まり、細胞増殖がモニターされた156時間にわたって直線的に継続します。これらのネットワークの急速な確立は、NGN2の最適化されたドキシサイクリン誘導性遺伝子発現を使用するグルタミン酸作動性ニューロンの使用に部分的に起因しており、2D培養でも7日以内に成熟ニューロンサブタイプマーカーの発現を示す33。アッセイ開発には細胞モデルの迅速なターンアラウンドと開発が必要であるため、この技術を使用してこの成長期間を短縮することは、バイオ医薬品業界内でモデルを実装するために重要です15。
結論として、このモデルは、ニューロンとアストロサイトの3Dモデルの可能性を示しており、スクリーニング目的で迅速かつ便利に確立されます。将来的には、このモデルタイプは、さまざまな中枢神経系疾患の創薬活動に応用される可能性があり、患者や遺伝子編集された疾患のiPS細胞株を使用して、さまざまな疾患に拡大する機会があります。さらに、ドキシサイクリン誘導性NGN2発現iPS細胞由来グルタミン酸作動性ニューロンを用いることで、細胞をより短時間で成熟させることができ、神経変性研究のための老化脳モデルの開発に活用することができます。このシステムは、ミクログリアやオリゴデンドロサイトなど、共培養における追加の細胞タイプの使用によっても拡張できます。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65856">Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications</a>. The Authors section was updated from:
Chloe Ann Whitehouse1 
Yufang He2 
Janet Brownlees1 
Nicola Corbett1 
1MSD R&#38;D Innovation Centre Ltd 
2Merck &#38; Co., Inc.
to:
Chloe Ann Whitehouse1 
Yufang He2 
Janet Brownlees1 
Nicola Corbett1 
1MSD Research Laboratories, London, UK 
2Merck &#38; Co., Inc., Rahway, NJ, USA

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65856">Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications

創薬業界における中枢神経系(CNS)疾患の研究は拡大しています1.しかし、てんかん、統合失調症、アルツハイマー病など、多くの中枢神経系疾患には、いまだに根治的な治療法がありません2,3,4。中枢神経系疾患における効果的な治療法の欠如は、少なくとも部分的には、脳の正確なin vitroモデルの欠如に起因している可能性があります5。その結果、現在のin vitroモデルとin vivoデータの間にトランスレーショナルギャップが生じ、その後の研究活動のボトルネックとなっています。
このトランスレーショナルギャップにより、近年、神経オルガノイド、ニューロスフェロイド、足場ベースのモデルなど、新しい3D細胞モデルの開発が大幅に増加しています6。これらのモデルの3D構造は、生体力学的ストレス、細胞間接触、脳細胞外マトリックス(ECM)などの神経微小環境の再現に役立ちます7。脳ECMは、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、および神経血管ユニット7を含む神経細胞タイプ間の空間を占める神経生理学の動的要素である。脳ECMの再現は、ニューロンの形態とニューロンの発火に影響を与えることが示されており、脳の多くの複雑な3Dモデルは、神経細胞タイプによるECMタンパク質の沈着を実証しています8,9,10,11。足場ベースのモデルは、脳ECM12を表す多孔質の合成または生物学的ハイドロゲルマトリックスに懸濁された成熟神経共培養からなる。オルガノイドやスフェロイド系とは異なり、足場ベースの3Dモデルでは、存在するECMタンパク質のカスタマイズが可能であり、生体力学的ストレスを模倣するためのハイドロゲルの剛性の調整可能性という利点もあります13,14。
3Dニューラルモデルの圧倒的多数は、脳微小環境の再現の増加を示していますが、すべてのモデルが創薬アプリケーションの実装に適しているわけではありません15。3Dモデルを産業プロセスに実装するには、システムがスクリーニングアプリケーションのスループット要件を満たし、比較的短い開発時間が必要です16。3Dバイオプリンティングは、人為的ミスによって引き起こされるばらつきを排除するとともに、開発時間の短縮、スループットの向上、より高いレベルの精密制御を備えた3D足場ベースのニューラルモデルを作成する可能性を提供する新しい技術です17。このプロトコルは、ヒドロゲル足場中のヒトiPS細胞由来のグルタミン酸作動性ニューロンとアストロサイトの3D共培養モデルを提示します。このハイドロゲル足場には、生理学的に代表的な生理活性ペプチド(RGD、IKVAV、YIGSR)およびECMタンパク質が模倣生体力学的剛性内に含まれています。これらの完全長ECMタンパク質には、ヒト皮質に豊富に存在する完全長ラミニン-211とヒアルロン酸が含まれ、 in vivo 測定で1.1 kPaの剛性があります18。このモデルは、創薬の実用性を考慮して設計されており、神経突起伸長アッセイと並行して、細胞色素と抗体を用いたイメージング技術を用いたスクリーニング解析に適した96ウェルまたは384ウェルプレートフォーマットの3Dバイオプリンターを使用して作成されます。細胞は、培養後7日以内に神経細胞タイプマーカーの発現と神経突起および星状突起の増殖を示します。したがって、このプロトコルは、創薬アプリケーションで使用するためのハイスループット3D神経共培養モデルを開発するための方法論を提示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig01.jpg"> 図1:共培養の3Dバイオプリントに使用される方法論の実例的な概要。 ヒトiPS細胞由来のニューロンとアストロサイトは、生理活性ペプチドを含むアクチベーターおよびバイオインク溶液と組み合わされ、ドロップオンデマンドバイオプリンティング技術を使用して、96ウェルまたは384ウェルフォーマットのハイドロゲルスキャフォールドにバイオプリントされます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>サーモフィッシャー</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>384 ウェルプレート</td><td>PerkinElmer</td><td>6057300</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>PerkinElmer</td><td>6055300</td><td></td></tr><tr><td>アクチベーター液 F299</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>アクチベーター液 F3</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x) マイナス Vit A</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>バイオインク液 F261</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>バイオインク液 F32</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリンハイクレート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5207</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG H&L Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150115</td><td></td></tr>ヤ<tr><td>ギ抗ウサギIgGH&L Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Abcam</td><td>ab228551</td><td></td></tr><tr><td>ヒト BDNF 組換えタンパク質</td><td>サーモフィッシャー</td><td>PHC7074</td><td></td></tr><tr><td>ヒト NT3 組換えタンパク質</td><td>サーモフィッシャー</td><td>PHC7036</td><td></td></tr><tr><td>iCell アストロサイト</td><td>富士フイルム CDI</td><td>1434</td><td></td></tr><tr><td>INCell アナライザー 6500HS</td><td>分子デバイス</td><td>N/A</td><td>ハイコンテントイメージングシステム</td></tr><tr><td>IncuCyte S3</td><td>Sartorius&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ioGlutamatergic Neurons (Large vial)</td><td>Bit.bio</td><td>e001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin (1 mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead kit (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1)</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-BIII tubulin NL637 conjugated</td><td>R&D systems</td><td>SC024</td><td></td></tr><tr><td>神経基礎培</td>地 <td>サーモフィッシャー</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>ノーマル ドンキー セラム</td><td>アブ</td><td>カム ab7475</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live (Hoechst 33342)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PEI 50% in H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181978</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Borate Buffer 20x</td><td>Thermofisher</td><td>28341</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>データ解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>Rabbit anti-ionotropic glutamatre receptor 2 (GluR2)</td><td>Abcam</td><td>ab206293</td><td></td></tr><tr><td>RASTRUM(TM) Bioprinter</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td><td>Bioprinter</td></tr><tr><td>RASTRUM(TM) バイオプリンターカートリッジ</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td><td>バイオプリンターカートリッジ</td></tr><tr><td>RASTRUM(TM) ターゲティングプレート</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td><td>ターゲティングプレート</td></tr><tr><td>Rho キナーゼ (ROCK) 阻害剤</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr><tr><td>羊 抗 GFAP NL493 標識</td><td>R&Dシステム</td><td>ズSC024</td><td></td></tr><tr><td>Signals イメージアーティスト&nbsp;</td><td>パーキンエルマー&nbsp;</td><td>N/A</td><td>画像解析プラットフォーム</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermofisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>倒立顕微鏡プラットフォーム&nbsp;</td></tr></tbody></table>

スクリーニング応用のためのヒトips細胞由来神経細胞-アストロサイト共培養の3次元バイオプリンティング

Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications

細胞モデルを薬物スクリーニングに利用するためには、効率的な開発時間を確保しながら、スループットと均質性の要件を満たす必要があります。ただし、公開されている多くの 3D モデルは、これらの基準を満たしていません。そのため、早期創薬用途での有用性は限定的です。3次元(3D)バイオプリンティングは、3Dモデルの開発に適用して、開発期間の短縮、標準化の促進、スループットの向上を実現できる新しい技術です。ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)由来のグルタミン酸作動性ニューロンおよびアストロサイトの3Dバイオプリント共培養モデルを開発するためのプロトコルを紹介します。これらの共培養物は、生理活性ペプチド、完全長細胞外マトリックス(ECM)タンパク質のハイドロゲルマトリックス内に埋め込まれており、生理学的剛性は1.1 kPaです。このモデルは、96ウェルおよび384ウェルフォーマットで迅速に確立でき、平均72%の印刷後生存率を実現します。このモデルにおけるアストロサイトとニューロンの比率は1:1.5であることが示されており、これはヒトの脳の生理学的範囲内である。これらの3Dバイオプリント細胞集団は、成熟した神経細胞タイプマーカーの発現と、培養後7日以内に神経突起および星状細胞突起の成長も示しています。その結果、このモデルは、神経突起伸長アッセイと並行して細胞色素や免疫染色技術を用いた分析に適しています。これらの生理学的に代表的なモデルを大規模に作成できるため、神経科学ターゲットのミディアムスループットからハイスループットのスクリーニングアッセイでの使用に最適です。

神経突起成長解析 このプロトコルでは、iPS細胞由来のグルタミン酸作動性ニューロンとアストロサイトを、3Dバイオプリンターを使用して共培養でハイドロゲルマトリックスにバイオプリントしました。プリント後の最初の7日間は、生細胞顕微鏡を使用して12時間ごとに細胞を画像化しました。バイオプリンティング後、細胞は丸みを帯びた形態を持ち、ハイドロゲルマトリックス全体に分散し、培養の最初の数日間で徐々に変化して突起の少ない小さな細胞クラスターを形成する必要があります(代表的な健康な細胞の増殖については、補足ビデオ1を参照してください)。4日目までに、健康な細胞はゲル全体に移動してより大きなクラスターを形成し、神経突起伸長を介して接続されます。7日目までに、単一の細胞はほとんど残らず、神経突起と星状突起の相互接続束が強化されているように見え、クラスターから多くの小さな神経突起の成長が形成されているのが見られます(図2A)。7日間の増殖期間にわたって撮影された一連の生細胞明視野画像を用いて、セクション3に詳述したように神経突起伸長の分析を行った。この分析により、神経突起伸長は12時間から156時間の間にほぼ直線的に増加することが示されました(図2B)。この神経突起伸長期には、細胞体クラスターも大きくなり(補足ビデオ1参照)、これはハイドロゲル全体の細胞移動を示しています。
細胞生存率と個体数比 このプロトコルでは、1,500,000,000のニューロン/mLおよび5,000,000,000のastrocytes/mLから成り立つ2,000,000,000のcells/mLの集中が細胞モデルのbioprintingのために使用されます。カルセイン-AM(生細胞)、エチジウムホモ二量体-1(死細胞)、および核染色による生細胞染色を使用して、7日間にわたって生存する細胞の数をセクション4に従って計算できます(図3A)。代表的な培養物の細胞生存率の結果は4日目に示されており、全細胞の72%±1%(平均±SEM)が生きており、Calcein-AMの染色が見られ、全細胞の29%±2%(平均±SEM)が死滅し、エチジウムホモ二量体-1による染色が見られます(図3B)。カルセイン-AMおよびエチジウムホモ二量体-1による細胞染色の代表的な画像を補足 図1 に示します。死細胞はハイドロゲルに保持され、細胞供給プロセス中に除去されないため、3D培養の細胞生存値は2D培養と直接比較できないことに注意する必要があります。
セクション5および 図4に記載されているように、Β-IIIチューブリンおよびGFAPの免疫蛍光染色を使用して、画像解析を実施して、ニューロンとアストロサイト間の細胞集団比を決定することができます(図3A)。代表的な培養におけるモデルあたりの総細胞数のうち、Β-IIIチューブリン陽性ニューロンは49%±3%(平均±SEM)を占め、GFAP陽性アストロサイトは30%±4%(平均±SEM)を占めています。これにより、アストロサイトとニューロンの比率はそれぞれ1:1.5になります。これにより、モデルあたりの総細胞数が21%残り、どちらの細胞マーカーでも染色されません。細胞生存率分析では、4日目に29%の細胞が生存不能であることが示されたため、これらの細胞はハイドロゲル内で死滅している可能性があります。
細胞マーカーの発現 バイオプリントされたニューロンとアストロサイトの形態は、ニューロン細胞タイプマーカー(Β-IIIチューブリン)およびアストロサイトティックマーカー(GFAP)の免疫染色によって評価されました。示した代表的な培養物では、免疫染色は個々の細胞タイプに局在しており、健康な細胞形態を示し、両方の細胞タイプで細胞突起の伸長が見られます(図4A、B)。ハイドロゲルと細胞の構造は3次元であるため、各画像は図4A、Bの構造を通る1つのスライスのみを表しています。図4Cは、ハイドロゲル全体の画像のマージスタックを示しており、X、Y、およびZ平面での細胞局在の図を示しています。図4Dは、Β-IIIチューブリンのみの免疫染色を示しています。細胞体クラスターからのより細かい神経突起伸長を強調します。グルタミン酸作動性ニューロンの表現型をさらに調べるために、グルタミン酸作動性イオン受容体マーカーであるGluR2の免疫染色を行うことができます。図4E内では、領域4E.1(挿入図)が強調表示されており、神経突起束に沿った高解像度の点状染色が示されています。したがって、このことは、この共培養のニューロンがグルタミン酸作動性表現型を有することを裏付けている。すべての免疫染色画像において、免疫蛍光染色された非細胞構造が細胞クラスターおよび神経突起を取り囲んで観察することができます。これらの構造は、ヒドロゲルに結合する少量の非特異的抗体と組み合わさってヒドロゲル内に保持されたデブリを表している可能性が高い。これは、3D足場モデル内では、細胞供給中に死んだ細胞や破片が除去されないため、バイオプリント培養では予想されます。二次抗体のヒドロゲル非特異的結合を実証するために、代表的なネガティブコントロール免疫染色画像を補足図2に示します。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig02.jpg"> 図2:グルタミン酸作動性ニューロンとアストロサイトをバイオプリンターを使用してハイドロゲルマトリックスにバイオプリントし、明視野顕微鏡を使用して12時間ごとにイメージングしました 。 (A)解析中の細胞培養の明視野画像の例。画像は 156 時間、スケールバーは 400 μm を表します。 (B)ImageJのNeuronJパッケージを用いて測定した培養物からの神経突起伸長の平均長さ(μm)。各データポイントはn = 3ニューライトであり、データはSEM±平均として示されています。 この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig02large.jpg" target="_blank">図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig03v2.jpg"> 図3:2,000万細胞/mLの濃度の活性剤溶液を細胞モデルのバイオプリンティングに使用しました 。 (A)細胞生存率は、生細胞/死細胞色素(それぞれカルセイン-AMおよびエチジウムホモ二量体-1)を用いて計算しました。値は±4日目にウェルあたりの全細胞集団の72%1%(平均±SEM、n = 3)が生きており、29%±2%(平均±SEM、n = 3)の細胞が死滅していることを示しています。示されている値は、SEM±平均値を表しています。 (B)ウェルあたりの細胞集団のニューロンおよびアストロサイトの割合は、 図4に示す染色の画像解析により計算しました。ニューロンは、7日目にΒ-IIIチューブリン陽性に染色された細胞の割合(49%±3%、SEM±平均、n = 3)を表し、アストロサイトは、7日目にGFAP陽性に染色された細胞の割合(30%±4%、SEM±平均、n = 3)を表します。表示されている値は、SEM±平均値を表しています。 図3 に示す計算のためのすべてのイメージングは共焦点イメージングシステムで行い、すべての分析は画像解析プラットフォームとGraphPad Prismでメソッドに従って実行しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig04.jpg"> 図4:7日目のグルタミン酸作動性ニューロンとアストロサイトの3Dバイオプリント共培養における神経細胞タイプマーカーの発現 。 (A,B)ニューロンマーカーΒ-IIIチューブリンとアストロサイトマーカーGFAPの免疫蛍光染色を倒立顕微鏡プラットフォーム上で10倍の倍率で画像化。スケールバーは 100 μm を表します。 (C)Hoechstと共染色したニューロンマーカー β-IIIチューブリンおよびアストロサイトマーカーGFAPの免疫蛍光染色をXYZ平面図に示し、共焦点イメージングシステムで10倍の倍率で画像化。画像解析プラットフォーム上で作成。スケールバーは 100 μm を表します。 (D)Hoechstと共染色したニューロンマーカー β-IIIチューブリンの免疫蛍光染色、共焦点イメージングシステムで20倍の倍率でイメージング。スケールバーは100μmを表します。 (E)ヘキストと共染色したグルタミン酸作動性マーカーGluR2の免疫蛍光染色を、倒立顕微鏡プラットフォーム上で10倍の倍率で画像化。ボックス 3E.1 は、GluR2 染色の強調表示された領域を示しています。スケールバーは100μmを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足動画1: グルタミン酸作動性ニューロンおよびアストロサイトは、バイオプリンターを使用してハイドロゲルマトリックスにバイオプリントされ、明視野顕微鏡を使用して12時間ごとに画像化されました。分析中の細胞培養の明視野画像のビデオ、右下隅に時点が示され、スケールバーは400μmを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/Supplementary%20Video%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:4日目のバイオプリントニューロンとアストロサイトの生死解析の画像例。 Calcein-AM染色試薬は緑色(488 nm)、エチジウムホモ二量体染色試薬は赤色(647 nm)で示しています。画像は、画像解析プラットフォーム上で作成されたXYZ平面ビューで表示されます。スケールバーは100μmを表す。 (A)イメージングは、共焦点イメージングシステムを用いて、倍率4倍で行った。(B)共焦点イメージングシステムを用いて倍率10倍でイメージングを行った こちらをクリックしてダウンロード <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">してください。</a>
補足図2:免疫蛍光染色後のネガティブコントロール画像の例。 一次抗体は省略し、緑色(488 nm)および赤色(647 nm)の二次抗体を免疫染色プロトコルに従って使用しました。画像は、画像解析プラットフォーム上で作成されたXYZ平面ビューで表示されます。スケールバーは100μmを表します。イメージングは、10倍の倍率で共焦点イメージングシステムを使用して行った。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、iPS細胞由来のニューロンとアストロサイトの3Dバイオプリント共培養を行うためのプロトコルを紹介します。この共培養モデルは、96ウェルまたは384ウェルフォーマットのハイドロゲル足場内で生成され、7日以内に高いポストプリント生存率と神経突起伸長を示し、両方の細胞タイプの成熟マーカーの発現を示します。

スクリーニング応用のためのヒトiPS細胞由来神経細胞-アストロサイト共培養の3次元バイオプリンティング

For a cell model to be viable for drug screening, the system must meet throughput and homogeneity requirements alongside having an efficient development ...

3D細胞モデリングは、過去10年間で飛躍的に拡大した新しい分野です。これらのモデルは、ニューロンの成長を促進し、疾患の表現型をより正確に表すことが示されています。しかし、これらのモデルをより高いスループットにするためのシフトがあり、開発に自動化を取り入れる必要があると考えています。従来の3D培養方法の確立は手間と時間がかかりますが、3Dバイオプリンティングは、これらの開発プロセスのスケールアップに適用できる技術です。この技術により、何百もの同一のモデルを人為的ミスなく効率的に作成することができます。このプロトコルは神経細胞が生物学的に活動的なハイドロゲルのマトリックスで3Dで育つので複雑な文化を開発する。しかし、重要なことは、このプロトコルはモデル開発においてスピードと利便性を優先しており、この分野ではそれが欠けており、産業界への実装を妨げる可能性があるということです。このプロトコルは、ユーザーからの限られた入力で多くの3D共培養を非常に効率的に確立する方法を定義します。これにより、ハイスループットアッセイで複雑な細胞培養モデルを使用する際の障壁が取り除かれ、神経細胞の種類に対する3D培養の影響のさらなる調査が促進されることを期待しています。

three-dimensional-bioprinting-human-ipsc-derived-neuron-astrocyte

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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ヒト多能性幹細胞を用いたアストロスフィアの生成と維持

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ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロ サイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング

このプロトコルは、以前にインビトロで神経前駆体から数週間分化していたヒト幹細胞由来ニューロンを再中断および培養するための詳細な手順を説明する。この手順は、光顕微鏡検査および高含有量スクリーニングと互換性のある形式で、神経伝達物、シナプス、および後期発現ニューロンマーカーのイメージングベースのアッセイを容易にします。...

ニューウトジェネシスとシナプス成熟の高含有量スクリーニングに対するヒト多能性幹細胞由来ニューロンの分化後再形成

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ニューラル様組織の工学的なマウス皮質アストロサイトの3Dバイオプリンティング

この記事では、ベンチトップ3D懸濁バイオリアクターにおけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンの生成のためのプロトコルについて説明します。...

3次元浮遊バイオリアクターにおけるヒトニューロゲニン2誘導性ニューロンの生産

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三次元コラーゲンマトリックスアッセイにおけるマウスのドーパミンと線条体片の解剖と文化

方法は、6自由度（6DF）モーションシミュレータを用いて、ヒトにおける三次元前庭眼用反射を（3D VOR）を測定するために記載されている。...

フリーダムモーションプラットフォーム度6を使用した三次元前庭眼反射テスト

学ぶ3Dバイオプリンティングを用いたヒトiPS細胞由来神経細胞とアストロサイトの共培養法。ハイドロゲルスカフォールド内で高生存率と神経突起伸長を実現し、スクリーニング応用に適した自動化モデルを構築します。

スクリーニング応用のためのヒトiPS細胞由来神経細胞-アストロサイト共培養の3次元バイオプリンティング

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