Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-Based Assay for Measuring Interactions of CRAF with 14-3-3 Proteins in Live Cells

Russell Spencer-Smith

doi:10.3791/66436

生細胞におけるCRAFと14-3-3タンパク質との相互作用を測定するための生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)...

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Biochemistry

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Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-Based Assay for Measuring Interactions of CRAF with 14-3-3 Proteins in Live Cells

生細胞におけるCRAFと14-3-3タンパク質との相互作用を測定するための生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)ベースのアッセイ

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06:44 min

March 1, 2024

DOI: 10.3791/66436-v

Russell Spencer-Smith^1,2,3

¹Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics,Medical University of South Carolina, ²Hollings Cancer Center,Medical University of South Carolina, ³Laboratory of Cell and Developmental Signaling, Center for Cancer Research,National Cancer Institute-Frederick

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

このプロトコルは、生細胞中のCRAFキナーゼと14-3-3タンパク質との相互作用を測定するためのBRETベースのアッセイを説明しています。このプロトコルでは、細胞の調製、BRET排出量の読み取り、およびデータ解析の手順を概説しています。また、アッセイ最適化のための適切なコントロールとトラブルシューティングの特定を含む結果の例も示します。

私たちの研究の主な焦点は、Ras-MAPKキナーゼ経路内の希少疾患関連変異の研究を通じて、Ras-MAPKキナーゼ経路の新たな脆弱性を明らかにすることです。私たちは最近、生細胞におけるRAFキナーゼの自己阻害活性を測定するための別のBRETベースのアッセイを開発しました。重要なことに、このアッセイは、BRAFシステインリッチドメインのまれな生殖細胞変異のグループを特徴付けるために不可欠であり、BRAF自己阻害を維持し、構成的BRAF生物学的活性を防止するためにこのドメインが決定的に重要であることを示しました。

このアッセイは、1433タンパク質とRAFキナーゼCRAFとの相互作用を測定し、これらの相互作用は、発生と疾患の両方でRAF機能を媒介する上で重要な役割を果たします。さらに、このアッセイは、RAFの自己阻害およびRAF-RAF相互作用を測定するための以前に確立されたアッセイと組み合わされ、生細胞におけるRAFキナーゼの調節メカニズムを解剖するためのツールキットの基礎を形成します。

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