使い捨て診断用マイクロ流体アプリケーション

私はキャサリン・クラウドブリッジです。ボストン大学で製造、工学、および生物医学工学の教授を務めております。また、生物医学マイクロデバイス・マイクロ環境研究室のディレクターでもあります。私たちは主に、資源が限られた環境での応用に向けた使い捨て診断デバイスの開発に取り組んでいます。

そこで、これらのデバイスを製作するためにマイクロフルイディクスを利用します。私たちは、実際的に2つの研究分野に関心を持っています。主に、生体分子や細胞がプラスチックポリマー表面とどのように相互作用するかを調べることに重点を置いています。

それが私たちの主要な研究テーマです。その研究は、使い捨て診断用のマイクロ流体アプリケーションに具現化されています。したがって、研究室ではマイクロ流体デバイスを製作しています。

熱可塑性素材を用いるため、通常、研究室でマイクロ流体デバイスの作製に広く利用されているゴム状の素材であるPDMSは使用しません。私たちは熱可塑性プラスチックでデバイスを作製しています。これらの熱可塑性デバイスを用いて、中央集権的な研究施設から離れた現場（フィールド）でもマイクロスケールの分子生物学的な解析が可能になる手法に関心を持っています。

研究室での具体的な仕組みとしては、小さなプラスチックカードを作製し、その内部に固相抽出カラム、細胞溶解カラム、あるいは混合カラムを組み込んでいます。また、検出技術としてチップ上でのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）も行っています。これらすべてが小型デバイスに統合されており、この研究の長期的な展望としては、最終的に、遠心分離機や加熱インキュベーターなどの設備が整った大規模な研究室が利用できない現場や環境に持ち運び可能な、ハンドヘルド型の統合デバイスを実現することを目指しています。

理想的には、血液、尿、便、または鼻咽頭スワブ（粘液）などのヒト検体から開始し、チップの出力として、特定の微生物に感染しているかどうかという「はい」か「いいえ」の答えを得られるようにしたいと考えています。その手法は、微生物の種類に応じて、患者の検体中にその特定の微生物のDNAまたはRNAが存在するかを確認することによるものです。

したがって、技術的な課題の大部分は、サンプルの調製過程にあります。血液や糞便、尿などの検体から開始する場合、粒子状の不純物が多く含まれていたり、PCRやその他の増幅技術に対する阻害剤が含まれていたりする、不純物の多いヒト検体という状態からスタートすることになります。最終的には、非常にクリーンな溶出核酸サンプルを得る必要があり、それを用いて増幅を行い、目的の微生物が存在したかどうかを判断するための特定のDNAまたはRNAを検出します。

したがって、これらのサンプルを精製するには、いくつかの手順を行う必要があります。まず、サンプルのろ過を行う必要がありますが、サンプルによっては、チップに導入する前に粗ろ過または短時間の遠心分離ステップが含まれる場合があります。そのため、私たちは常に臨床医から提供されたままの状態のサンプルから開始するようにしています。

尿、便、および鼻咽頭スワブにおいて、私たちの目標は、臨床医に通常通りに検体採取を行ってもらうことです。そして、その検体をチップに導入します。したがって、その段階でさらなるろ過が必要な場合は、チップ内でろ過が行われることになります。

第2ステップでは、分子アッセイを行うため、サンプル中の細胞および微生物を溶解させる必要があります。そのため、通常は小孔径のフィルターにサンプルを強制的に通過させる溶解ステップを実施します。場合によっては、そのフィルターに、鋭利なエッジを持つカーボンナノチューブなどのナノ粒子が含まれていることがあります。これにより、私たちが扱っているグラム陽性菌のC difficileのように、細胞壁が強固で溶解が非常に困難な生物を破砕することが可能です。

したがって、より堅牢なライシスカラムが必要となります。通常、チップ内で化学的および機械的なライシスを組み合わせて行います。その後、ライセートから精製された核酸を抽出することを目的としています。

次に、溶解物をマイクロ流体チップ内に組み込まれた固相抽出カラムに通します。この固相抽出カラムはプラスチック製で、チップの作製後にマイクロ流体チャネル内で光開始化学を用いて作製されています。また、核酸を結合および遊離させるため、通常はシリカ粒子が含浸されています。

場合によっては、例えばmRNAを特異的に結合および溶出させたい場合にはoligo DTビーズを、あるいは特定のタンパク質を結合および溶出させたい場合には特定の抗体を付加したビーズを組み込むことがあります。また、これらの機能をすべて備えた抽出カラムを作成することも可能です。しかし、本日はシリカビーズを用いてベースとなる抽出カラムを作成する方法について説明します。

その後、溶解物をシリカカラムに通します。これは、マクロスケールの実験室で使用するQiagenキットと同様の原理で動作します。次に、不要な成分、つまり細胞溶解物やヒト検体の残存成分に含まれるすべての炭水化物、脂質、その他の不純物を除去するために洗浄を行います。そして最後に、水を用いて溶出させます。

これらのマイクロスケール固相抽出カラムの優れた点は、通常1〜5 µL程度の極めて少量の水で溶出できることです。これにより、導入した核酸のほぼすべてを回収することができ、チャネルから回収される最初の10 µLで約70〜90%の回収率が得られます。

したがって、2～10 µLで2回洗浄することで、投入した核酸のほぼすべてを回収できます。これにより、PCRが可能なクリーンなサンプルが得られるだけでなく、標準的なベンチトップキットで得られるよりもはるかに高濃度なサンプルを得ることができます。これらのサンプル調製技術の最終的な目的は、他者が行ってきた他の研究と互換性のあるサンプルを作成することです。

チップ上でPCR増幅が可能であることを示した、この分野における非常に優れた研究成果です。RNAウイルスを扱う場合や、遺伝子発現実験を行いたい場合は、チップ上で逆転写反応を行うこともできます。当社のサンプル調製技術はチップ上のPCRと直接的に結合させることができるため、ベンチでのクリーンアップやサンプル調製を行う必要はありません。

さらに、小さなチップ上でマルチプレックスPCRを行うために必要となる微量サンプルを得るための、濃縮ステップについても説明します。本日の実験では、PDMSではなく熱可塑性プラスチックで作られたマイクロ流体チップの組み立て方法を示します。そのため、一般的な方法とは異なる作製プロセスおよびチップの封止方法が必要となります。

次に、チップ内で光開始化学反応を行い、細胞溶解と固相抽出の両方に使用されるポリマーモノリスを作製する方法について説明します。現在、研究室ではこれらの工程をモジュールとして個別に実施していますが、これらを統合させることで、最終的に水中に高濃度に濃縮された核酸（RNAおよびDNA）のサンプルを得ることができます。このサンプルをPCRモジュールやその他の増幅モジュールに導入することで、微生物や感染症の同定が可能になります。実際、私たちは現在ある助成金による研究に取り組んでおり、ボストン医療センターから、インフルエンザA型に感染している可能性がある患者さんの検体を収集し始めています。現在はインフルエンザの流行期であるため、そのようなサンプルを収集しています。

そして研究室では、インフルエンザA型に感染しているかどうかを確認するためのゴールドスタンダードなアッセイを行っています。これは基本的に培養法であり、完了までに数日かかります。それと並行して、これらのサンプルを現在のチップの各モジュールに通しています。具体的には、溶解カラムおよび固相抽出カラムに通した後、PCRを実施し、ゴールドスタンダードな手法と比較してどの程度の精度で検出できるかを確認しています。

現在の状況は以上です。これらの実験がうまくいけば、今後4年から6年ほどの間に、インフルエンザA型向けの統合チップと完全なアッセイを構築できると考えています。また、現在はクロストリジウム・ディフィシル（clostridium difficile）および糞便検体の解析についても取り組んでいます。デバイスの統合だけでなく、アッセイの統合についても完成に非常に近づいています。

したがって、アッセイの開発とチップの設計は密接に連携して行われる必要があります。特定のアプリケーションにおいて、ベッドサイドでの実用化に至るには、まさにターゲット指向のプロセスが不可欠です。ベッドサイドでの使用に向けてチップを最適化するためには、開始サンプルおよび検出対象となる微生物を正確に把握していなければなりません。

したがって、プロトタイプ形式での実現は、そう遠くないところで可能になると考えています。それが私たちの最終目標ですので、到達できることを願っています。