遺伝子および組織特異的エンハンサーを選択するためのWebベースのワークフロー

私たちは、遺伝子がどのように調節され、適切なタイミングと適切な場所で発現されるかを理解するために、ノンコーディングゲノムを解読することに関心があります。私たちは、ウェブベースのゲノミクスツールを使用してユーザーフレンドリーなプロトコルを開発し、すべての生物学者が強化された発見にアクセスできるようにします。エンハンサーの場所を絞り込むのに役立つマルチモーダルデータの幅広い可用性と、オープンソースのWebインターフェイスを介してこのデータに簡単にアクセスできます。

これにより、研究者のプログラミングの専門知識を必要とせずに、包括的なエンハンサーの同定が可能になります。このプロトコルは、エンハンサー生物学のバックグラウンドを持たない人でも、目的の遺伝子のエンハンサーを取得するために公開されているデータセットのナビゲートを開始するための基盤を提供します。心臓生物学で有名な TBX5 をケーススタディとして使用します。

私たちのワークフローは、心臓の発達メカニズムと先天性心疾患に光を当てる可能性のある21のエンハンサーを特定しました。私たちは、空間ゲノミクスを含む新しいデータソースでプロトコルを拡張すると同時に、生物学者向けのユーザーフレンドリーなツールを追加開発します。まず、Ensembl Genome Browserを開きます。

目的の種とバージョンに一致するゲノムアセンブリを選択します。検索フィールドに目的の遺伝子を入力し、[移動]をクリックします。結果から、適切なアンサンブル遺伝子IDをクリックします。次に、[概要]セクションまでスクロールし、[詳細な領域]リンクをクリックして、目的の遺伝子の周囲の領域を視覚化します。次に、Gene Legend トラックを使用して、目的の遺伝子に隣接する 2 つの遺伝子を検索します。

これらの遺伝子は、GENCODEトラックの基本的な遺伝子アノテーション内で、EnsemblとHavanaのアノテーションをマージしたものを表す視覚的要素として表示されます。遺伝子名の横にあるより大きいまたはより小さい記号を観察することにより、目的の遺伝子の方向性を決定します。これらの遺伝子間の遺伝子間領域をクリックしてカーソルをドラッグし、ポップアップボックスの「領域にジャンプ」をクリックして、選択した領域を表示します。

トラックビューアの上部にある「追加」または「トラックの削除」をクリックして、表示をカスタマイズします。ズーム コントロールとナビゲーション コントロールを使用してビューを調整し、領域の視覚化を強化します。[Region in Detail] タブ ビューアで、サイドバーの [Configure This Page] をクリックします。

[領域イメージの構成] サイドバーの [規制] で、[細胞または組織別のアクティビティ] を選択します。細胞または組織の検索バーを使用して目的の組織を検索して選択するか、バーの下にあるアルファベットインデックスを使用します。[細胞または組織]オプションの隣にある[実験]タブをクリックします。

エンハンサーのマーカーとして H3K4me1 と H3K27ac を選択し、プロモーターのマーカーとして H3K4me3 を選択し、[トラック表示の設定] をクリックします。次に、「トラックの表示」を選択して、エンハンサー検出領域内のH3K4me1でマークされた領域と、目的の遺伝子の上流にあるH3K4me3でマークされた領域を視覚化します。H3K4me1トラック内の色付きのビジュアル要素またはボックス要素をクリックして、定義された検出領域内にマークされた領域のゲノム座標を取得します。

これにより、Hists と Pols ポップアップが開き、要素のゲノム位置が塩基ペアで表示されます。または、トラックをクリックしてドラッグして、各ゲノム特徴の関心領域を手動で定義し、グラフピークをH3K4me1またはH3K27acトラックの下に囲みます。次に、ゲノム位置座標をテキストファイルにコピーし、ファイルをBED形式で保存します。

4DN データポータルにアクセスします。ホームページで、メインの積み上げ棒のY軸として「実験セット」が選択され、X軸として「実験タイプ」が選択され、プロットが生物ごとにグループ化されていることを確認します。X 軸に沿って In Situ Hi-C バーを見つけ、人体実験セットを表す部分をクリックします。

ポップアップで、「参照」ボタンをクリックし、心筋筋芽細胞」と、心臓器官形成に関連する目的の遺伝子TBX5を選択します。目的の組織に対応する関連するバイオサンプルのタイトル」列のリンクをクリックします。次に、[処理済みファイル] タブで [データの探索] をクリックして、Hi-C データセットをより詳細に調べます。

目的の組織で同定されたプロモーターの座標を入力し、ヒートマップを右クリックして領域を水平方向にマークします。これらの線により、ヒートマップ全体でプロモーター領域を視覚的に追跡できます。必要に応じて、検索バーの Y 座標の上限と下限が対象領域の境界に揃うまで、ビューを垂直方向にドラッグしてビューを調整します。

不要な線を削除するには、線を右クリックして [水平] または [垂直線] を選択し、[シリーズを閉じる] をクリックします。実験的に検証されたすべてのコントロールエンハンサーの座標を入力し、最小相互作用値に基づいて相互作用しきい値を計算します。事前に準備されたビューを使用して、文献の3つのコントロールエンハンサーをEnsemblのプロモーター領域と並べて表示します。

次に、ヒートマップ行列の右側にあるカラーキーで示されているように、ゼロ以外の相互作用スコアの最低値を選択することにより、これらの制御エンハンサーを使用してプロモーターエンハンサーしきい値を定義します。すべてのH3K4me1関連エンハンサー領域のゲノム座標を入力し、Hi-Cヒートマップに垂直にマークします。H3K4me3でマークされた領域の相互作用スコアを相互作用しきい値と比較することにより、弱く相互作用する領域を除外します。

このしきい値を超える相互作用周波数を示すゲノム座標(ヒートマップ上でより集中または暗いシグナルとして表示)を選択し、BED形式で保存します。VISTA Cardiac Enhancer Browserで同定された4つの心臓エンハンサーのうち3つ、HS2329、mm1282、およびmm370は、Webベースのエンハンサー検出プロトコルによって予測された領域と重複していました。エンハンサー2は、エンハンサー検出プロトコルによって予測された領域と実験的に検証されたエンハンサーの両方と重複しました。

エンハンサー16は、予測されたエンハンサー領域と以前の実験データの両方と重複を示しました。エンハンサー9は、パイプラインから予測されたエンハンサーと重複しませんでしたが、部分的なH3K4me1シグナル濃縮を示しました。