Name: デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応による精製ベクターサンプル中のアデノ随伴ウイルスゲノムの定量(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: 学ぶデジタル液滴PCRによるアデノ随伴ウイルスゲノム定量法。DNase I処理と液滴生成を用いた標準化プロトコルで、遺伝子治療研究における精度と再現性を向上させる信頼性の高い測定手法を習得する。

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<meta charset="utf8"></head><body>デジタルドロップレットPCRを用いたウイルスゲノム定量のための標準化されたプロトコール

<ol><li>Balakrishnan, B., Jayandharan, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+biology+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+used+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Basic biology of adeno-associated virus (AAV) vectors used in gene therapy.</a> Curr Gene Ther. 14 (2), 86-100 (2014).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>8チャンネルピペット 10 &micro;L</td><td>エッペンドルフ</td><td>3,12,50,00,010</td><td></td></tr><tr><td>8チャンネルピペット 200 & マイクロ;L</td><td>エッペンドルフ</td><td>3,12,50,00,036</td><td></td></tr><tr><td>8チャンネルピペット 300 & マイクロ;L</td><td>エッペンドルフ</td><td>3,12,50,00,052</td><td></td></tr><tr><td>8 ウェル PCR ストリップ</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>C1000 タッチサーマルサイクラー 96&ndash;ディープウェル反応モジュール</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Buffer Control for Probes 9 mL (2 x 4.5 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) (2 x 1 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863023</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Plates (pkg of 25)</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Oil (2 x 1L)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>DG8 カートリッジホルダー</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>DG8 カートリッジ QX200/QX100 用 (24 個入り)</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 ガスケット QX200/QX100 用 (24 個入り)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (10U/&micro;L) + バッファー</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>液滴発生油 プローブ用 (10 x 7 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. フィルターチップ、0.1-10 &mu;L、34 mm、ラック、PCRクリーン、滅菌&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>30078500</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ EP デュアルフィルター T.I.P.S. フィルターチップ、20-300 &mu;L、55 mm、ラック、PCRクリーン、滅菌&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>30078560</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ EP デュアルフィルター T.I.P.S. フィルターチップ、2-100 &mu;L、53 mm、ラック、PCRクリーン、滅菌&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078543</td><td></td></tr><tr><td>Forward凍結乾燥プライマーとそれぞれのマスターストックを100 mM&nbsp;</td>ターゲット配列としての<td>IDT</td><td></td><td>GFP。フォワードプライマー:5'-GAACGGCATCAAGGTGAACT-3'Lyopohilized</td></tr><tr><td>プローブとマスターストック100 &micro;M&nbsp;</td>ターゲット配列としての<td>IDT</td><td></td><td>GFP。PrimeTime Eco Probe: /56-FAM/CAAGATCCG/ZEN/CCACAACATCGAGGA/3IABkFQ/</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl2)</td><td>Chemlab Analytical</td><td>CL00.1381</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>IDT</td><td>11-04-02-01</td><td></td></tr><tr><td>PCR プレートヒートシール、ホイル、ピアス可能 (100 個入り)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>プルロニック F-68 非イオン性界面活性剤 (100x)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>24040032</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>ハネウェル リサーチケミカル</td>ズ <td>31248</td><td></td></tr><tr><td>QX マネージャーソフトウェア</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>ddPCR データ解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>QX200 液滴発生器</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>QX200 液滴リーダー</td><td>Bio-Rad</td><td>1864003</td><td></td></tr><tr><td>試薬リザーバー</td><td>VWR</td><td>613-1181</td><td></td></tr><tr><td>100 mMの逆凍結乾燥プライマーとそれぞれのマスターストック&nbsp;</td>ターゲット配列としての<td>IDT</td><td></td><td>GFP。リバースプライマー:5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'SafeSeal</td></tr> <tr><td>反応チューブ、1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.200</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA、剪断(10 mg/mL)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9680</td><td></td></tr> TE バッファー IDT <tr><td>トリス塩酸塩(Tris-HCl)</td><td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr> を<tr><td></td><td>ご注文いただく際にプライマーを添付</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応による精製ベクターサンプル中のアデノ随伴ウイルスゲノムの定量(英語)

Quantification of Adeno-Associated Viral Genomes in Purified Vector Samples by Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

結果は、適切なソフトウェアを使用して視覚化できます。各ウェルについて、1D振幅プロットには、その振幅に対するすべての液滴が表示されます。正の液滴と負の液滴が明確に分離されることが期待されます。プラスとマイナスの液滴雲の間に全液滴の10%以上が見つかった場合(液滴雨と呼ばれる現象)、サンプルを再測定する必要があります( 図1を参照)。水滴雨に関する追加情報は、ディスカッションで入手できます。
サンプル名、許容された液滴の数(イベントカウント)、濃度(コピー数/μL)など、記録されたすべての情報を要約するデータテーブルを作成できます。理想的には、イベント数は 15,000 から 20,000 の許容された液滴の間に収まる必要があります。井戸のイベント数が 10,000 未満の場合は、データ ポイントを分析から除外する必要があります。出力データの例を 表 5 に示します。
vg力価は、サンプルの希釈率を考慮して、濃度(コピー/μL)に基づいて計算できます。dd_PCRの作業範囲は10〜10,000コピー/μLです。10コピー/μL未満の値は分析から除外する必要があります。サンプルのvg力価、および陽性コントロールとネガティブコントロールを計算する必要があります。ポジティブコントロールの測定値は、理論値に対して20%未満の変動係数(%CV)を持つ必要があります。ネガティブコントロールは5コピー/μL未満である必要があります。さらに、各サンプルのリピート間および異なる希釈間の%CVを計算する必要があります。異なる希釈液間の%CVが20%を超えると、値は不正確であると見なされ、サンプルの再測定が必要になる場合があります。
測定が成功するとは、正と負の液滴雲が明確に分離されていること、少なくとも10,000個の液滴が受け入れられていること、10コピー/μLから10,000コピー/μLの間の値、および繰り返し間の%CVが20%未満であることが特徴です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig01.jpg"> 図1:dd_PCR液滴の可視化 (A)1D振幅プロットは、正と負の液滴が明確に分離されていることを示しており、液滴の分配が成功したことを示しています。(B)プロットは、液滴雨として知られる正と負の液滴の分離が不十分であることを示しており、これは最適でない分割またはアッセイの潜在的な問題を示唆しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig02.jpg"> 図2:デジタル液滴PCRを使用してウイルスゲノムを定量するためのワークフロー (1)バッファー、試薬、および溶液は、製造元の指示に従って調製するか、プロトコルのステップ1(ストック溶液の調製)に従って調製します。(2)45 μLのDNase I溶液を8チューブPCRストリップの各チューブに分注します。サンプルをボルテックスして短時間遠心分離した後、5 μLのサンプルをチューブの1つに加えます。DNase Iとサンプル含有8チューブPCRストリップをサーモサイクラーで37°Cで1時間インキュベートした後、サンプルを段階希釈します。(3)PCRマスターミックスを記載通りに調製し、19.8μLを8チューブPCRストリップの各チューブに分注します。ステップ2のサンプル連続希釈液をマスターミックスに加えます。20 μL のマスターミックスプラス サンプル溶液をカートリッジの中央列にロードし、60μLの液滴発生オイルを液滴発生カートリッジの下部ウェルに移します。次に、カートリッジを液滴発生器に入れ、指定された条件に従って実行します。液滴生成後、カートリッジの最上列から42.5 μLをマルチウェルPCRプレートに移します。(4)PCRプレートをPCRサーモサイクラーにロードし、所定の条件に従って運転します。プレートはdd_PCRリーダーを使用して分析されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表 1: 精度データ。 この表は、4セットの品質管理(QC)サンプルから得られた精度データを示しており、それぞれに5つの濃度(QC1-QC5)があります。各QCを5回測定しました。異なる実行間の変動係数(%CV)は繰り返し性(A)を表し、異なるサンプルセット間の変動係数(%CV)は中間精度(B)を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:サンプル希釈。 この表は、予想されるウイルスゲノム力価(vg/mL)に基づく推奨サンプル希釈を示しています。少なくとも2つの値がアッセイの作業範囲内に収まるように、合計3回の希釈が推奨されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%202.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表3:dd_PCRマスターミックスの構成。 この表は、フォワードプライマーとリバースプライマー(909 nM)、プローブ(227 nM)、プローブ用のdd_PCRスーパーミックス(dUTPなし、1x)を含むdd_PCRマスターミックスの組成を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%203.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表4:熱サイクル条件。 この表には、推奨されるPCRプログラムの詳細が示されており、これには、(1)95°Cで10分間のインキュベーションによるキャプシドの破壊と酵素の活性化、(2)DNA変性のための94°Cでの30秒のサイクル40サイクル、アニーリングと伸長のための60°Cでの1分間、(3)酵素の不活性化のための98°Cでの10分間のインキュベーション、 (4)4°Cで保持します。 アニーリング温度は、使用するプライマー/プローブセットに基づいて最適化が必要な場合があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%204.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表 5: 実際の AAV 実行からの出力データの例。 この表は、1 つのサンプルが 2 つの異なる希釈率で、それぞれが重複して測定された実際の AAV 実行からの出力データの例を示しています。ウイルスゲノム(vg)力価(vg/mL)は、10(DNase I前処理)×10(マスターミックスでの希釈)×1,000(μLからmL)×AAV希釈バッファーでの希釈という式で計算されます。STDEVは標準偏差を表し、CVは変動係数を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%205.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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ヒトアデノウイルス5型に基づく高容量アデノウイルスベクターのクローニングおよび大規模生産

アデノ随伴ウイルス (AAV) 抗体とアセンブリ活性化の役割を研究する応用を定量化するための簡単なドット プロット法の詳細を本稿では蛋白質 (薬学会合同)、すべて AAV が見つかりましたウイルスの非構造タンパク質の新規クラス血清型、同種および異種 AAV...

AAV 滴定とそのアデノ随伴ウイルスのアセンブリ活性化機能の評価のための定量的ドットしみ試金蛋白質

このプロトコルは、小さなAAV産生、ビトリアル内注射、遺伝子画像化、および遺伝子ゲノムDNA分離と共に、デジタル液滴PCR(dd-PCR)を用いてマウスの遺伝子のAAVトランスダクション効率を定量化する方法を示しています。...

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ここでは、遺伝子治療ベクターの臨床開発を支援するために、液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応によるヒト涙液中のアデノ随伴ウイルスベクターのコンプライアント検出における優れた実験室慣行の開発と検証のためのプロトコルを提示します。...

涙液のバイオシェディング研究におけるアデノ随伴ウイルスベクターの検出のための検証可能な液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応アッセイ

組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)は、臨床および前臨床の遺伝子導入に広く使用されています。rAAVの用途としてはあまり評価されていませんが、精製を必要とせずに培養細胞を強力に形質導入できることです。rAAVに不慣れな研究者向けに、導入遺伝子カセットクローニング、粗ベクター産生、細胞培養形質導入のプロトコルを提供しています。...

未精製組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた培養細胞における導入遺伝子発現

ここでは、成体マウスにアデノ随伴ウイルス(AAV)を全身投与するためのマウス側尾静脈注射の最適化されたプロトコルについて詳しく説明します。さらに、AAV形質導入を評価するために一般的に使用されるアッセイのプロトコルについても説明します。...

成体マウスにおける側方尾静脈注射によるアデノ随伴ウイルスの一貫した送達

非破壊ボリュームの可視化は、最も効率的ではX線マイクロコンピュータ断層撮影（CT）となっている断層の技術によって達成することができます。...

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロCTによる>生物試料

グローバル拡張機能を正確に、因果関係に基づく定量は、パラメータ化され拡張期経由 transmitralフロー充填（PDF）形式主義の運動学的モデリングベースの分析によって達成された。 PDFファイルは、固有の剛性、リラクゼーション、および負荷パラメータを生成し、機能障害の高感度かつ特異的インデックスを提供しながら、「新しい」の生理を解明。...

パラメータ化拡張期充満フォーマリズムを経由Transmitral流れの運動学的モデルベースの​​解析によるグローバル拡張期機能の定量化

スペクトルマッピングによる強化された暗視野顕微鏡法とハイパースペクトルイメージングにより、従来の方法よりも速度と精度が向上した組織学的サンプル中のナノスケール材料のスクリーニング、局在化、および同定が可能になります。この論文の目標は、組織学的サンプル中の金属酸化物ナノ粒子の暗視野イメージングとハイパースペクトルマッピングの方法を提供することです。...

強化された暗視野顕微鏡とハイパースペクトルマッピングにより組織学的試料中の金属酸化物ナノ粒子の同定

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DNA結合色素化学と液滴デジタルPCRを使用したマイクロRNA定量循環

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