オープンソースの液滴マイクロ流体工学によるプラスミド安定性解析

細菌におけるプラスミド保持の並列分析のために、アクセス可能なオープンソースのマイクロ流体ワークフローが紹介されています。蛍光顕微鏡法を用いてゲル微小液滴内の単一細胞微小コロニーにおけるプラスミドの存在を定量することにより、この方法は、従来のプレートカウントに代わる、正確でアクセスしやすく、スケーラブルな方法を提供します。

私たちは、細胞集団の多様性と細胞間相互作用を研究するためのハイスループットなマイクロフィリックIC法を開発しています。このような状況では、ゲル微小液滴により、DNAの溶解染色や、閉じ込められた細胞内で高度に麻痺した状態での顕微鏡観察など、有用なプロトコールステップを実行することができます。Droplet microphilicワークフローは、超高スループットと汎用性で知られていますが、ハイエンドの機器や専門的な専門知識の必要性により、採用が制限されることがよくあります。

当社のプロトコールは、蛍光染色によるハイスループットのシングルセル解析と、アクセス可能なオープンソースの顕微鏡ワークフローを使用して、従来の技術を改善します。マイクロ流体工学を介して細胞をゲルマイクロ液滴にカプセル化し、ミニセルとマイクロコロニーを同時に分析します。バルク培養やプレート培養には特異性や分解能が欠けていますが、この方法では多様な現象の正確で代表的な統計をゲル化することができます。

当社のプロトコルは、液滴マイクロ流体工学、蛍光顕微鏡、オープンソースハードウェアをラベルベースの方法で組み合わせています。このアプローチにより、シングルセル解析がより柔軟で手頃な価格になり、科学界は微生物群集に関する複雑な科学的問題に取り組むことができます。まず、超低温ゲル化温度のアガロースを摂氏2〜90度の濃度でLuria BertaniまたはLBブロスで加熱します。

温度制御されたシェーカーで混合物を10分間振とうし、次にサーモシェーカーの温度を摂氏39度に下げてアガロース溶液を冷却します。大腸菌懸濁液チューブをサーモシェーカーに4分間入れて、摂氏39度に温めます。バクテリア懸濁液とアガロース溶液を1対1の比率で混合して、アガロース濃度1%、細胞懸濁液10の3.1倍、1ミリリットルあたり6細胞の累乗を達成します。

LBとアガロース懸濁液を1対1の比率で使用したコンタミネーションモニタリング用のネガティブコントロール溶液を調製します。ガス圧力ドライバーとフローセンサーを含む完全なオープンソースのフロープラットフォームを入手してください。スライドガラスとピペットチップヒーターをセットアップに含めて、アガロースセルサンプルがチップに入る際の温度を制御します。

次に、マイクロ流体チップをストロボ強化顕微鏡ステージに配置し、液滴生成接合部が見えることを確認します。制御ソフトウェアインターフェースを使用して、ピペットチップヒーターとスライドガラスヒーターを摂氏40度に設定します。チューブ付きシリンジとPDMSプラグを使用して、1%アガロース細胞懸濁液混合物を200マイクロリットルのピペットチップにロードします。

チップをチップヒーターに挿入し、マイクロ流体チップの水相の入口に置きます。チップのPDMSシールをフロー制御システムチューブに接続されているものと交換します。次に、オイルチューブを2番目のインレットに挿入し、アウトレットチューブの端を廃棄物チューブに挿入します。

次に、ユーザーインターフェースで黙認相と油相の圧力を80ミリバールに設定し、セル懸濁液と油の注入を開始します。オイル相を 320 ミリバールに調整し、黙認相を 180 ミリバールに調整します。液滴発生が安定するまで1分間お待ちください。

液滴の発生が安定したら、出口チューブを廃液チューブから収集チューブに移します。サンプルリザーバーが空になるまで、氷上の液滴を収集し続けます。収集後、チューブを摂氏4度に1時間置き、アガロースゲルを液滴の中に入れます。

細菌を含むゲル微小液滴とネガティブコントロール液滴を摂氏37度で4時間または一晩インキュベートしてコロニーを成長させます。インキュベーション後、21ゲージの針が付いた3ミリリットルのシリンジを使用して、ゲルマイクロ液滴エマルジョンのベースからできるだけ多くの油を慎重に取り除きます。50マイクロリットルのゲルマイクロ液滴を新しいマイクロチューブに移し、さらに液滴分析のために摂氏4度で保存し、残りのエマルジョンに等しい容量のフッ素化油とPFOの1対1の混合物を追加します。

次に、エマルジョンの上に約200マイクロリットルの0.9%塩化ナトリウム緩衝液を追加します。混合物をボルテックスし、固定速度の遠心分離機で短時間スピンダウンします。液体界面の底から油相を慎重に取り除き、上部から100マイクロリットルの塩化ナトリウム溶液を捨てます。

2マイクロリットルのゲルマイクロ液滴をイメージングチャンバースライドに移し、5マイクロリットルのフッ素化オイルを添加して、最適なイメージングのための液滴の単層を形成します。顕微鏡で、明視野イメージングのために上から白色LEDマトリックス照明をアクティブにします。用意したスライドを取り付けます。

サンプルに焦点を合わせて液滴の単層を特定し、明視野画像をキャプチャします。次に、フィルターホイールを調整して、緑色の波長フィルターに合わせます。励起のために470ナノメートルのLEDに切り替え、サンプルを動かさずにコロニーの蛍光画像をキャプチャします。

2マイクロリットルのヨウ化プロピジウム染色マイクロゲルをイメージングチャンバーチップに移し、5マイクロリットルの0.9%塩化ナトリウム溶液を添加してマイクロゲルの単層を形成します。イメージング中の蒸発を防ぐために、チップの入口と出口を密閉します。ヨウ化プロピジウムイメージング用の赤色波長間隔フィルターを調整し、明視野と蛍光画像をキャプチャします。

ゲル微小液滴中の細胞のカプセル化は、明視野顕微鏡法によって確認され、異なるカプセル化された細胞を持つ均一な液滴が示されました。プラスミドにコードされた蛍光を失ったコロニーは、蛍光比分析を使用して同定しました。分析した2,785コロニーのうち、100コロニーが蛍光を失い、プラスミド損失率は3.6%でした