オープンソースの液滴マイクロ流体工学によるプラスミド安定性解析
December 27th, 2024
細菌におけるプラスミド保持の並列分析のために、アクセス可能なオープンソースのマイクロ流体ワークフローが紹介されています。蛍光顕微鏡法を用いてゲル微小液滴内の単一細胞微小コロニーにおけるプラスミドの存在を定量することにより、この方法は、従来のプレートカウントに代わる、正確でアクセスしやすく、スケーラブルな方法を提供します。
私たちは、細胞集団の多様性と細胞間相互作用を研究するためのハイスループットなマイクロフィリックIC法を開発しています。このような状況では、ゲル微小液滴により、DNAの溶解染色や、閉じ込められた細胞内で高度に麻痺した状態での顕微鏡観察など、有用なプロトコールステップを実行することができます。Droplet microphilicワークフローは、超高スループットと汎用性で知られていますが、ハイエンドの機器や専門的な専門知識の必要性により、採用が制限されることがよくあります。
当社のプロトコールは、蛍光染色によるハイスループットのシングルセル解析と、アクセス可能なオープンソースの顕微鏡ワークフローを使用して、従来の技術を改善します。マイクロ流体工学を介して細胞をゲルマイクロ液滴にカプセル化し、ミニセルとマイクロコロニーを同時に分析します。バルク培養やプレート培養には特異性や分解能が欠けていますが、この方法では多様な現象の正確で代表的な統計をゲル化することができます。
当社のプロトコルは、液滴マイクロ流体工学、蛍光顕微鏡、オープンソースハードウェアをラベルベースの方法で組み合わせています。このアプローチにより、シングルセル解析がより柔軟で手頃な価格になり、科学界は微生物群集に関する複雑な科学的問題に取り組むことができます。まず、超低温ゲル化温度のアガロースを摂氏2〜90度の濃度でLuria BertaniまたはLBブロスで加熱します。
温度制御されたシェーカーで混合物を10分間振とうし、次にサーモシェーカーの温度を摂氏39度に下げてアガロース溶液を冷却します。大腸菌懸濁液チューブをサーモシェーカーに4分間入れて、摂氏39度に温めます。バクテリア懸濁液とアガロース溶液を1対1の比率で混合して、アガロース濃度1%、細胞懸濁液10の3.1倍、1ミリリットルあたり6細胞の累乗を達成します。
LBとアガロース懸濁液を1対1の比率で使用したコンタミネーションモニタリング用のネガティブコントロール溶液を調製します。ガス圧力ドライバーとフローセンサーを含む完全なオープンソースのフロープラットフォームを入手してください。スライドガラスとピペットチップヒーターをセットアップに含めて、アガロースセルサンプルがチップに入る際の温度を制御します。
次に、マイクロ流体チップをストロボ強化顕微鏡ステージに配置し、液滴生成接合部が見えることを確認します。制御ソフトウェアインターフェースを使用して、ピペットチップヒーターとスライドガラスヒーターを摂氏40度に設定します。チューブ付きシリンジとPDMSプラグを使用して、1%アガロース細胞懸濁液混合物を200マイクロリットルのピペットチップにロードします。
チップをチップヒーターに挿入し、マイクロ流体チップの水相の入口に置きます。チップのPDMSシールをフロー制御システムチューブに接続されているものと交換します。次に、オイルチューブを2番目のインレットに挿入し、アウトレットチューブの端を廃棄物チューブに挿入します。
次に、ユーザーインターフェースで黙認相と油相の圧力を80ミリバールに設定し、セル懸濁液と油の注入を開始します。オイル相を 320 ミリバールに調整し、黙認相を 180 ミリバールに調整します。液滴発生が安定するまで1分間お待ちください。
液滴の発生が安定したら、出口チューブを廃液チューブから収集チューブに移します。サンプルリザーバーが空になるまで、氷上の液滴を収集し続けます。収集後、チューブを摂氏4度に1時間置き、アガロースゲルを液滴の中に入れます。
細菌を含むゲル微小液滴とネガティブコントロール液滴を摂氏37度で4時間または一晩インキュベートしてコロニーを成長させます。インキュベーション後、21ゲージの針が付いた3ミリリットルのシリンジを使用して、ゲルマイクロ液滴エマルジョンのベースからできるだけ多くの油を慎重に取り除きます。50マイクロリットルのゲルマイクロ液滴を新しいマイクロチューブに移し、さらに液滴分析のために摂氏4度で保存し、残りのエマルジョンに等しい容量のフッ素化油とPFOの1対1の混合物を追加します。
次に、エマルジョンの上に約200マイクロリットルの0.9%塩化ナトリウム緩衝液を追加します。混合物をボルテックスし、固定速度の遠心分離機で短時間スピンダウンします。液体界面の底から油相を慎重に取り除き、上部から100マイクロリットルの塩化ナトリウム溶液を捨てます。
2マイクロリットルのゲルマイクロ液滴をイメージングチャンバースライドに移し、5マイクロリットルのフッ素化オイルを添加して、最適なイメージングのための液滴の単層を形成します。顕微鏡で、明視野イメージングのために上から白色LEDマトリックス照明をアクティブにします。用意したスライドを取り付けます。
サンプルに焦点を合わせて液滴の単層を特定し、明視野画像をキャプチャします。次に、フィルターホイールを調整して、緑色の波長フィルターに合わせます。励起のために470ナノメートルのLEDに切り替え、サンプルを動かさずにコロニーの蛍光画像をキャプチャします。
2マイクロリットルのヨウ化プロピジウム染色マイクロゲルをイメージングチャンバーチップに移し、5マイクロリットルの0.9%塩化ナトリウム溶液を添加してマイクロゲルの単層を形成します。イメージング中の蒸発を防ぐために、チップの入口と出口を密閉します。ヨウ化プロピジウムイメージング用の赤色波長間隔フィルターを調整し、明視野と蛍光画像をキャプチャします。
ゲル微小液滴中の細胞のカプセル化は、明視野顕微鏡法によって確認され、異なるカプセル化された細胞を持つ均一な液滴が示されました。プラスミドにコードされた蛍光を失ったコロニーは、蛍光比分析を使用して同定しました。分析した2,785コロニーのうち、100コロニーが蛍光を失い、プラスミド損失率は3.6%でした
概要
この研究は、蛍光顕微鏡を用いて細菌のプラスミド保持を分析するためのオープンソースのマイクロ流体ワークフローを提示します。この方法は、ゲルマイクロドロップレットにカプセル化された単一細胞マイクロコロニーにおけるプラスミドの存在を正確に定量化することを可能にし、従来のプレート計数法に代わるスケーラブルな選択肢を提供します。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- マイクロ流体工学
- 細胞生物学
- 蛍光顕微鏡
背景
- マイクロ流体技術は細胞集団の高スループット分析を可能にします。
- 従来の方法はしばしば特異性と分解能に欠けます。
- ゲルマイクロドロップレットは単一細胞分析のための多目的なプラットフォームを提供します。
- オープンソースアプローチは高度な方法へのアクセスを民主化することができます。
研究の目的
- 細菌におけるプラスミド保持を研究するための高スループット法を開発すること。
- 単一細胞分析技術のアクセシビリティと手頃な価格を向上すること。
- 従来の培養法に代わるスケーラブルな選択肢を提供すること。
使用された方法
- 細菌細胞を含むアガロースゲルマイクロドロップレットの調製。
- ドロップレットの生成と操作のためのマイクロ流体の使用。
- プラスミド保持のイメージングと定量化のための蛍光顕微鏡。
- プラスミド損失率を決定するためのコロニー蛍光の分析。
主要な結果
- 明視野顕微鏡によるゲルマイクロドロップレット内での細胞のカプセル化を確認。
- 分析されたコロニー間で3.6%のプラスミド損失率を特定。
- 高スループット分析のためのオープンソースワークフローの有効性を実証。
- 多様な細菌集団におけるプラスミド保持の正確な統計を提供。
結論
- 開発された方法は微生物群集の研究を強化します。
- 単一細胞分析への柔軟で手頃なアプローチを提供します。
- このワークフローは様々な専門知識を持つ研究者によって採用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Plasmid stability is a critical parameter in synthetic biology and microbial engineering, directly impacting the reliability of engineered strains in biopharma R&D. High-throughput, quantitative analysis of plasmid retention without antibiotic selection enables robust target validation and de-risks early discovery workflows. Open-source droplet microfluidics democratizes access to advanced single-cell analytics, supporting scalable portfolio decisions and translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of plasmid stability in engineered microbial populations.
- Supports functional validation of genetic constructs under selection-free conditions.
- Provides high-resolution data for mechanistic de-risking of synthetic circuits.
- Facilitates predictive confidence in strain performance for downstream applications.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microbial systems for high-throughput screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for assay standardization.
- Enables parallel analysis of thousands of microcolonies, increasing statistical power.
- Supports scalable and reusable assay platforms for diverse genetic constructs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial system stability with translational biomarker strategies when relevant.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by quantifying genetic retention.
- Reduces risk of late-stage failure due to plasmid instability in engineered strains.
- Provides mechanistic insights for predictive de-risking in translational workflows.
Pipeline & Workflow Integration
This open-source microfluidic workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling robust single-cell analytics from early target validation through assay development and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying plasmid retention at single-cell resolution.
- Screening: Delivers reproducible, high-throughput assay outputs for reliable compound or construct evaluation.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based measurements to compare genetic stability across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by ensuring engineered strain fidelity.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, open-source platform adaptable to various genetic and microbial systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in engineered strain validation.
- Operational Value: Standardizes and scales single-cell analysis with accessible instrumentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust genetic stability data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial engineering projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence microscopy, and microbial genetics.
- Needs open-source hardware for precise flow and temperature control.
- Demands cross-team standardization for reproducible data integration.
- Adaptable to various microbial models and genetic constructs with minimal modification.
- Limited by the need for fluorescence-based readouts and compatible imaging infrastructure.
