Name: 複数の異なった株を勉強するためのマイクロ流体デバイス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いた複数酵母株の同時イメージング法。同一動的条件での単細胞挙動を観察し、株間交差汚染を防ぎながら環境応答を比較解析する革新的アプローチです。

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YGは、IDBからフェローシップでサポートされています。 INはアロンの仲間とエドモンドJ‭の教員仲間です。テルアビブ大学のバイオインフォマティクスのためのサフラ‬‭センター。‬この研究は、ISF助成​​金1499から1410によってサポートされていました。

1。スコッチテープマスターの作成​​5 <ol><li>紙の上で、拡大し、希望するマイクロチャネルのレイアウトを描画したり、プリントアウトする。我々のケースでは、設計は2つのY字型チャネル、ワイド各3ミリメートル（ 図2）から構成されています。 </li><li>スコッチテープの層を持つガラススライドをカバーしています。層の数は、チャネル（層当たり約60μm）の高さを決定します。私たちは3スコッチテープ層を使用していました。 </li><li>平らな面にレイアウト設計を置きます。デザインパターンオーバースライドの位置を合わせます。注意深くレイアウトに従ってメスでスライドガラス上にテープを切った。 </li><li>マイクロチャネルのレイアウトのものを除き、スライドガラスのすべての地域からセロハンテープを取り外します。 </li><li> 2〜3分間65℃で加熱オーブン中にスライドを入れます。エタノールで軽く清掃してください。 </li></ol> 2。 PDMSマイクロ流体デバイスを作製<ol><li>メーカーが推奨するように、PDMSの塩基及び硬化成分を混合する。私たちは、午前10時01分を使用硬化剤ベースの比率。約0.5cmの高さにペトリ皿にPDMSの混合物の約30ミリリットルを注ぐ。真空中のドガのPDMS必要に応じて。上向きにパターン化されたスコッチテープとPDMSに沈めスライドガラス。 PDMSの後にパターンを配置すると、スライドと皿の底部との間に気泡が形成されるのを防ぎます。皿は水準器を使って水平になっていることを確認しながら、65℃で48時間硬化させます。 </li><li>新しい90ミリメートルペトリ皿に深い約0.5mm層で、その結果、PDMSのミックスの3ミリリットルを注ぐ。 （スピンコーターが利用可能であれば、それはこのステージのために使用することができます）。 </li><li>ドガと2.1のように治す。 </li><li>そっとメスで希望のサイズにマイクロ流体デバイスを切り取る。この層は、 &quot;フロー層&quot;と呼ばれるでしょう。 </li><li>第二ペトリ皿から薄層PDMSの同じようなサイズの部分を切り取ります。これは、 &quot;井戸層&quot;と呼ばれるでしょう。 </li><li>流動層内の入口と出口のための穴を開けるために適切な大きさの生検パンチャーを（我々は、1.2 mmのIDを使用）を使用します。 </LI&gt; <li>レイアウト上のマイクロチャネルと整列して、2ミリメートル番号検パンチャーを使って、井戸のうち、設計レイアウトとパンチ以上厚いガラススライド上に井戸層を配置します。 </li><li>両方PDMS層だけでなく、エタノールで24ミリメートル×60 mmのカバーガラスを清掃してください。空気乾燥して清潔に保つ。 </li><li>プラズマはリバーシブルボンディング用の標準プラズマエッチャー（非可逆的結合用）またはハンドヘルドコロナ処理機6のいずれかを使用してカバーガラスや井戸層のPDMSの両方を扱う。慎重に（ 図3）密着性を引き起こすためにカバースリップの上に井戸層を配置。ゆっくり気泡を（必要に応じて）外にこする。 </li></ol> 3。細胞イメージング実験<ol><li>あなたはシリンジポンプで0.02の内径 &quot;（タイゴン）と柔軟なプラスチックチューブに接続されている適切なシリンジに準備ができて目的のメディアを持っていることを確認してください。 </li><li> Sを育てる液体YPDで所望の位相にセレビシエ株。徹底的にボルテックスと場所300μマイクロ遠心チューブに各株のL。 </li><li>優しくコンカナバリンA（シグマ）を各ウェルに2 mg / mlの1μlを置く。そっと水をピペッティングにより各ウェル倍から過剰コンカナバリンを洗い流す。 </li><li>コンカナバリン乾燥している間、SC培地欠けグルコース300μlの倍の株を洗ってください。細胞壁から残留グルコースを洗浄するコンカナバリンAに適切な遵守を支援します</li><li>徹底的にボルテックス細胞。ピペット0.75μlまたは独自のウェル（ 図3）にそれぞれの細胞懸濁液より少ない。優しく豊かな培地で残留細胞を洗い流す。次の2つの手順は、最大乾燥から細胞を防止するために、迅速に実行する必要があります。 </li><li>プラズマは直接井戸をぶつけないように注意しながら、徹底的に手持ちコロナ処理機を使用してチップや井戸を扱う。 2間のアライメントには細心の注意を払って、井戸にチップを慎重に置きます（このステップは、実体鏡下で行うことができます）。穏やかに、PDの2つの層を接着するために押すMS。徐々に気泡がチャネル内に残っていないことを確認しながら、約50μl豊富な培地でデバイスを完全に埋める。 </li><li>は、デバイスを接続し、適切な注入口にチューブを挿入し、メディアフローを開始します。これらは削除するのが難しいことができるように気泡がデバイスに導入されないように注意してください、これは入口または出口を切断することによって達成され、静かにカバーガラスを壊さないように注意しながら、気泡があるデバイスをタップすることができます。 </li><li>顕微鏡下に置き、各ウェルに適切な撮像ポイントを見つける。 </li><li>必要に応じて回復を可能にするために1時間以上のための豊富な培地流の下で細胞を維持。 </li><li>実験を開始します、我々はメディアの逆流を防止するために、2つのシリンジポンプのそれぞれから一定の流量を使用し、必要に応じて相対的な流量を変化させる。メディアチャネルの幅（ 図4）の80％以上が流れる中で0.8ミリリットル/時とポンプB 0.2〜200ml /時間の結果、ポンプを設定します。これは、動的にCすることができます2流量を変えることによって絞首刑。新しい条件は、チャネル2の全長に沿って数秒以内に安定させる。 </li></ol>

<ol><li>Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+substrate-bound+laminin+orient+axonal+specification+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).</li>
<li>Paliwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446, 46-51 (2007).</li>
<li>Bennett, M. R., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+measuring+gene+network+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).</li>
<li>Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Fabrication+of+Microfluidic+Devices+by+Replicating+Scotch-tape+Masters%5BTitle%5D)+AND+%22Chips+%26+Tips%22%5BJournal%5D)">Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters.</a> Chips & Tips. , (2010).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

本稿では、動的な条件の下で、次のいくつかの酵母菌株を同時に可能にするマイクロ流体デバイスを作成するためのシンプルな卓上法を提案する。一つのチャンネルに複数の系統に従うことにより、複数の系統で単一細胞応答の動態を比較するための信頼性の高いツールを提供しています。我々のアプローチの利点の一つは、クリーンルームを必要とせずに簡単なテクニックを使用してデバイスを製造する能力である。実際には、我々はまた、プラズマ処理操作（手順2.9と3.6で）スキッププロトコルを実施し、良好な結果を得たので、どのようなプラズマ装置なしのラボではまだプロトコルを実行することができました。 まだ媒体流は実験中に細胞に到達することを可能にしながら、独自のウェル中に異なる株のそれぞれを播種することにより、我々は、デバイスの組み立て中に混合セルを避ける。このプロトコルの臨界点は、細胞はそれらの（ - 3.6ステップ3.4）の上に培地をリフロー前に完全に乾かすことを許可しないさ。 Dryin2 PDMS層の間の接着の問題で各ウェル結果にあまりにも多くのメディアを使用してデバイスをクローズしようとしたときにgが出厳しく...

細胞は絶えず新陳代謝、転写プロファイルと細胞機能を変化させることにより、動的に変化する環境に反応している。これらの現象を研究するために、そのような変化を定量化することができる方法が必要とされる。そのような応答のための読み出しの一つのタイプは、栄養ストレスに応答して、ストレスに関連する転写因子の局在の変化である。 マイクロ流体デバイス1は、動的にセル2-4環境条件を操作するために使用されてきた。細胞の環境を正確に制御し、動的に変更することができます。細胞は外部条件の操作時も含めて、常時、ライブ画像化することが可能であり、最小限の試薬の量が必要とされています：彼らは、ライブセルイメージングのためのいくつかの利点を提示する。マイクロ流体デバイスのための非常にシンプルなデザインは、2つの条件の間に交替できるように、Y字型装置2です。我々は日常的にできるようにY字型のマイクロ流体デバイスを使用チャンネル内のセルを動的に変更したアプリケーション。我々は、酵母細胞内で蛍光標識されたストレス関連転写因子の局在の変化に追従するために、このデバイスを使用します。私たちは、栄養条件を変更するの下でこれらの変更を行います。たとえば、我々は非常に細かい時間分解能では、no-グルコース培地の期間内に媒体をグルコース含有のパルス（または一連のパルス）を提供することができる。しばしば、このような実験では、1つは、異なる細胞株（例えば、別の変異体、または異なる野生分離株）の応答を比較することに興味を持っています。 Y字型チャネルは、各チャネルに1株に限られている - 複数の菌株を使用する場合は、系統を区別する簡単な方法はありません。これを克服するために、異なるチャンネルを使用することができます。我々は複数の系統に同じ力学条件を適用したい場合、我々は、複数のチャネルとYチャネルの概念を組み合わせるしたいと思います。このソリューションを実装するには2つの課題があります：それはtを適用することは難しいことができます彼はすべてのチャンネルに同時に同じ条件、一つのデバイスに取り付けることができ、Yチャネル数に幾何学的な限界がある。そこで我々は、動的条件下で一つのチャンネルに複数の系統を表示するための方法を探していました。 ここでは、同じ動的条件下で1チャンネルでの撮像複数の株を対象とし、二層マイクロ流体デバイスを記述します。最下層は、穴の列に薄いPDMSから構成されています。この層は、我々はガラスにコンカナバリンAでそれらを付着し、異なる菌株を配置先となるウェルを作成するカバーガラスに装着されている。第二層はスコッチテープ法5を使用して作成されたY字型のマイクロ流体デバイスです。ウェル内で株を配置した後第二層は、迅速に整列され、最初の1に取り付けられた、異なる株が含まれている複数のウェルを有する一つのチャネルを作成します。この最終的なデバイスは、一つのチャンネルで複数の株に続いて、ここですべてのことができます株はちょうど同じ時間に同じ条件にさらされています。全体の設計と製造プロセスがないソフトリソグラフィと、簡単な手段を用いて、ベンチトップで行うことができます。

<table border="1"><tbody><tr><td>試薬/機器</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td></tr><tr><td> PDMS-SYLGARD 184 </td><td>ダウコーニングの米国</td><td></td></tr><tr><td>減圧デシケーター</td><td>ナルゲン</td><td> 5310-0250 </td></tr><tr><td>生検パンチャー</td><td>テッド·ペラ社</td><td>ハリスユニコア15076（2ミリメートル）、15074（1.2ミリメートル） </td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td> Chemyx </td><td>フュージョン200 </td></tr><tr><td>コロナ処理機</td><td>電気技術製品</td><td> BD-20 </td></tr><tr><td> Tygonチューブ</td><td>タイゴン</td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td>コンカナバリンA- </td><td>シグマ</td><td> C7275 </td></tr><tr><td>スコッチテープ</td><td> 3Mスコッチ</td><td>透明テープ1/2 &quot; </td></tr></tbody></table>

複数の異なった株を勉強するためのマイクロ流体デバイス

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

環境変化への細胞応答の研究は、多くの実験的な課題があります。セルは、比較の方法で、多くの場合、変化する条件の下で撮像する必要があります。マルチウェルプレートは、日常的に多くの異なる株または細胞株を比較するために使用されるが、環境動態の制御は制限付きで許可されています。マイクロ流体デバイスは、他の一方で、周囲の条件で絶妙な動的な制御を可能にするが、それはイメージに挑戦し、それらのいくつかの菌株よりも区別されています。ここでは、簡単かつ迅速に一つのチャンネルに複数の異なる酵母菌株に動的に変化する条件を適用することができるマイクロ流体デバイスを製造する方法について述べる。デバイスは、ソフトリソグラフィーを必要とせずに簡単な手段によって設計され、製造されています。それは、マイクロウェルを宿す第二層に付着したY字型の流路で構成されています。菌株は、独立したマイクロウェル内に置かれ、まったく同じ動的条件下で結像される。我々は、デモ異なる酵母菌株の栄養変化のパルスにタンパク質局在応答を測定するためのデバイスの使用をnstrate。

異なる系統間の分離が可能であることを示すために、我々は代替ウェルで2つの区別酵母株をイメージした。イメージングフル井戸は井戸（ 図5a、b）の間には、セルのリークを示していない。両株はYFPでタグ付けされた転写因子MSN2を持っています。動的に条件を変えての同時効果をテストするために、我々は核 ​​（ 図5c、d）へMsn2-YFPの局在をもたらし無グルコース培地のステップを作成し、2入力チャンネルに流量を切り替えた。すべての井戸で測定された応答は、デバイスが複数のウェルへの同時動的条件の適用のために使用することができる示し、同時に発生した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4257/4257fig1.jpg" /> 図1。デバイスの設計は。デバイスはカバーガラス、薄い&quot;ウェルズ&quot;層とチューブが接されている&quot;フロー&quot...

私たちは、クリーンルームやソフトリソグラフィーを必要とせずに、複数の異なる株に類似した、動的な条件を適用することができるマイクロ流体デバイスを製造するための簡単​​な方法を提示する。

環境変化に対する細胞応答の研究には、多くの実験的な課題が伴います。細胞を、しばしば...な状態にある変化し続ける条件下でイメージングする必要があります。

本手法の全体的な目的は、同一の動的条件下で、異なる酵母株の単一細胞の挙動をイメージングすることです。これは、2層構造のマイクロ流体デバイスを作製することで達成されます。まず下層に各異なる酵母株を個別に封入し、次に上層によって動的な流れの条件を供給します。各ウェルに異なる酵母株を配置してデバイスを密閉することで、複数の分離した菌株を持つ単一のチャネルが形成されます。次に、ダイナミックな培地変化に対する細胞応答をイメージングします。Y字型チャネルの2つの入力口の流量を制御することで、同一のダイナミックな条件下に置かれた異なる菌株の結果が得られ、ウェル間のクロスコンタミネーションも発生しないことが示されました。このマイクロ流体デバイスは、既存の他のシステムに比べていくつかの重要な利点があります。具体的には、同一のダイナミックな条件下で複数の異なる菌株のイメージングが可能です。また重要な点として、特別な装置を必要とせず、どのようなラボでも簡単に作製することが可能です。この手法は、野生型East分離株の飢餓パスに対する反応を追跡する方法についての議論から生まれました。まず、目的のマイクロチャネルのレイアウトを、縮尺に合わせて描くか印刷してください。次に、ガラススライドの上にスコッチテープを層状に貼り付けます。チャネルの目的の高さを得るために、レイアウト設計図を平らな面に置き、設計パターンに合わせてスライドを配置します。次に、レイアウトに従ってガラススライド上のテープを慎重に切り抜きます。ガラススライドのすべての領域からスコッチテープを取り除きます。マイクロチャネルのレイアウトに従って、それらを定着させます。スライドを65 °Cの加熱オーブンに3分間入れます。その後、エタノールで穏やかに洗浄してください。製造元の推奨に従って、PDMSのベース成分と硬化剤を混合します。PDMS混合液を約30 milliliters、ペトリ皿に高さ約0.5 centimetersになるように注ぎます。必要に応じて、真空状態でPDMSを脱気します。パターン化したスコッチテープを上に向けて、ガラススライドをPDMSに浸します。PDMSを入れた後にパターンを配置することで、スライドとディッシュの底の間に気泡が形成されるのを防ぐことができます。新しい90 millimeterのペトリ皿に3 millilitersのPDMS混合液を注ぎ、気泡レベルを用いてディッシュが水平であることを確認し、65 °Cで48時間硬化させます。この手順は、スピンコーターが利用可能な場合はそれを用いて行うことができます。DGAsおよびキュアは前述の通りに行います。次に、バイオプシーパンチャーを用いて、マイクロ流体デバイスのフロー層を目的のサイズに慎重に切り出します。フロー層に、入口と出口のための穴を開けます。また、2枚目のペトリ皿から同様のサイズのウェル層を切り出し、厚いガラス上に配置します。その上に設計レイアウトをスライドさせて重ねます。次に、レイアウトのマイクロチャネルに合わせてエタノールを用いてウェルをパンチアウトし、両方のPDMS層とガラスカバースリップを洗浄して風乾させます。続いて、不可逆的な接合には標準的なプラズマエッチャーを、可逆的な接合にはハンドヘルドコロナ処理装置を用いて、ガラスカバースリップとウェル層のPDMSを処理します。密着させるため、ウェル層をカバースリップの上に慎重に配置します。気泡を優しく押し出します。適切なシリンジに必要な培地を準備し、シリンジポンプに通したタイゴンチューブに接続します。細胞イメージングに使用します。ストレッチャーを使用します。目的の相に移動し、培養物を十分にボルテックスし、300 µLをマイクロ遠心チューブに分注します。PDMSウェル層の各ウェルに、con canna Aを1 µLずつ静かに滴下します。Con Aが乾燥している間に、水を穏やかにピペッティングし、各ウェルから過剰なCon Aを2回洗い流します。グルコースを含まないSC培地 300 µLで、菌株を2回洗浄します。細胞壁から残留グルコースを洗浄することで、コンバルへの適切な接着を助けます。ボルテックス処理後、細胞懸濁液約0.5 µLを各ウェルに丁寧にピペットで分注します。残った細胞を富栄養培地で緩やかに洗い流します。細胞の乾燥を防ぐため、次の2つのステップは迅速に行う必要があります。オプションの手順として、ウェルに直接当たらないよう注意しながら、チップとウェルをプラズマ処理します。次に、実体顕微鏡下で、両者のアライメントに細心の注意を払いながら、チップをウェル上に慎重に配置します。軽く押して、2層のPDMSを密着させます。約50 µLのリッチ培地をデバイスにゆっくりと完全に満たし、チャネル内に気泡が残っていないことを確認します。次に、チューブを適切なインレットに挿入してデバイスを接続し、培地のフローを開始させます。チューブ内に気泡が発生しないように注意してください。気泡がデバイス内で停滞し、フローを妨げる可能性があります。デバイスを顕微鏡下に設置し、各ウェルで適切なイメージングポイントを探します。細胞を回復させるため、十分な量の培地を1時間、あるいは必要に応じてそれ以上の時間、流し続けます。一定流速の設定で実験を開始します。ポンプAを0.8 milliliters per hourに、ポンプBを0.2 milliliters per hourに設定してください。培地がチャネル幅の80%以上にわたって流れていることを確認します。相対的な流量を変化させることで、デバイス内の条件を動的に変更することが可能です。新しい条件は、数秒以内にチャネル全体で安定します。異なる菌株間の分離を実証するため、識別可能な2種類の酵母菌株を交互のウェル内でイメージングします。この実験では、ウェル間で細胞の漏出がないことに注意してください。動的に変化する条件の同時効果を検証するため、両方の菌株において転写因子MSN2にYFPをタグ付けしています。2つの入力チャネルの流量を変更し、グルコース不含培地のステップを作成しました。これにより、MSN twoが核に局在しました。重要な点として、単一細胞における核内MSN two YFPレベルのタイムコースを解析することが可能です。したがって、このPDMSマイクロ流体デバイスを用いることで、複数のウェルに対して同時に動的な条件を適用することができます。この手順を行う際は、デバイスの組み立て中に細胞を乾燥させないよう注意することが重要です。この手法を習得すれば、ソフトリソグラフィーを用いる必要なく簡単に実施することができます。

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