複数の異なった株を勉強するためのマイクロ流体デバイス

私たちは、クリーンルームやソフトリソグラフィーを必要とせずに、複数の異なる株に類似した、動的な条件を適用することができるマイクロ流体デバイスを製造するための簡単​​な方法を提示する。

次の方法の全体的な目標は、同じ動的条件下で異なる酵母株の単一細胞の挙動を画像化することです。これは、2層のマイクロ流体デバイスを作製することによって達成されるか、または最下層にそれぞれ異なるひずみを別々に含み、最上層に第2のステップとして動的流動条件を提供します。異なる酵母株をウェルに入れ、装置を閉じて、複数の分離した菌株を持つ単一のチャネルを作成します。

次に、動的な媒体の変化に対する細胞の応答を画像化します Yチャネルの2つの入力で流速を制御することにより、結果は、同じ動的条件にさらされた異なる株とウェル間のクロスコンタミネーションがないことを示しています。このマイクロ流体デバイスには、他の既存のシステムに比べていくつかの重要な利点があります。これにより、同じ動的条件下で複数の異なる株をイメージングできます。

また、重要なことは、特別な機器を必要とせずに、どのラボでも簡単に製造できることです。この方法は、飢餓パスに対するさまざまな野生の東の分離者の反応をどのように追跡するかについての議論から来ました。目的のマイクロチャネルレイアウトを開始、描画、または印刷してスケーリングします。

次に、スライドガラスをスコッチテープの層で覆いますチャネルの目的の高さを達成するために、レイアウトデザインを平らな面に置き、スライドをデザインパターンに合わせます。次に、レイアウトに従ってスライドガラスのテープを慎重にカットします。スライドガラスのすべての領域からスコッチテープをはがします。

マイクロチャネルのレイアウトでそれらを受け入れます。スライドを摂氏65度の加熱オーブンに3分間置きます。その後、エタノールでやさしく洗浄します。

PDMSのベース成分と硬化成分は、メーカーが推奨するように混合します。約30ミリリットルのPDMS混合物をペトリ皿に約0.5センチメートルの高さまで注ぎます。必要に応じて、PDMSを真空中で脱気します。

パターン化されたスコッチテープを上に向けて、スライドガラスをPDMSに沈めます。PDMSの後にパターンを配置すると、スライドとディッシュの間に気泡が形成されるのを防ぎます 底硬化 摂氏65度で48時間、新しい90ミリメートルのペトリ皿の気泡レベルを使用して皿が水平であることを確認します。3ミリリットルのPDMSミックスを注ぎます。

この手順は、使用可能な場合はスピンコーダーで実行できます。DGAと前述の通りの治癒。次に、マイクロ流体デバイスのフロー層をバイオプシーパンチャーで目的のサイズにそっと切り取ります。

フロー層の入口と出口に穴を作成します。また、2番目のシャーレから同様のサイズのウェル層を切り取り、厚いグラスの上に置きます。デザインレイアウトをスライドします。

次に、エタノールを使用してレイアウト上のマイクロチャネルに合わせてウェルを打ち抜き、両方のPDMS層とガラスカバースリップを清掃して風乾します。次に、ガラスカバースリップとウェル層PDMSを、非可逆的ボンディング用の標準プラズマエッチャーまたは可逆的ボンディング用のハンドヘルドコロナ処理装置のいずれかで処理します。ウェル層をカバースリップの上に慎重に配置して、接着を引き起こします。

気泡をやさしくこすり落とします。適切なシリンジで目的のメディアを準備し、シリンジポンプを介してねじ込まれたタイゴンチューブに接続します。細胞イメージング用。

強みを活用する。目的の段階まで進み、培養物を徹底的にボルテックスし、300マイクロリットルをマイクロ遠心チューブに移します。1マイクロリットルのコンカンナAをPDMSウェル層の各ウェルにそっと置きます。

Aのコンが乾燥している間に水を静かにピペッティングすることにより、各ウェルから余分なコナAを2回洗い流します。グルコースが不足しているSC培地300マイクロリットルで菌株を2回洗浄します。細胞壁から残留グルコースを洗浄すると、コンバルへの適切な付着に役立ちます。

ボルテックス後、細胞は細胞懸濁液の約0.5マイクロリットルを個々のウェルに完全にピペットで移します。残留細胞をリッチ培地でやさしく洗い流します。次の2つのステップは、細胞が乾燥するのを防ぐために迅速に実行する必要があります。

オプションのステッププラズマとして、チップとウェルを直接ウェルに当たらないように注意して処理します。次に、ステレオスコープの下で、2つの間の位置合わせに細心の注意を払いながら、チップをウェルに慎重に置きます。PDMSの2つの層を軽く押して接着します。

デバイスを約50マイクロリットルの濃厚な媒体でゆっくりと完全に満たし、チャネル内に気泡が残っていないことを確認します。次に、チューブを挿入してデバイスを接続し、適切なインレットに挿入し、メディアの流れを開始します。チューブ内に気泡が形成されないように注意してください。気泡がデバイスに詰まって流れを破壊する可能性があるためです。

デバイスを顕微鏡の下に置き、それぞれに適切なイメージングポイントを見つけます。細胞を豊かで中程度の流れの下に1時間以上、必要に応じて十分に保ちます。回復を可能にするため。

一定の流量設定で実験を開始します。ポンプAは毎時0.8ミリリットル、ポンプBは毎時0.2ミリリットルです。ミディアムAの場合、チャネルの幅の80%以上を流します。

相対的な流量を変更することで、デバイス内の条件を動的に変更できます。新しい条件は、チャネル全体に沿って数秒以内に安定し、異なるひずみ間の分離を実証します。2つの識別可能な酵母株を代替ウェルでイメージングします。

この実験では、ウェル間の細胞漏出がないことに注意してください。どちらの株も、動的に変化する条件の同時効果をテストするために、転写因子MSN 2にYFPタグが付けられています。2 つの入力チャネルの流量を変更して、グルコース媒体を含まないステップを作成しました。

これにより、MSN 2 の核への局在化が起こりました。重要なことは、単一細胞内の核MSNの2つのYFPレベルのタイムトラックを分析できることです。したがって、PDMSマイクロ流体デバイスは、複数のウェルに同時動的条件を適用するために使用できます。

この手順を試行する際は、デバイスの組み立て中に細胞を乾燥させないように注意することが重要です。一度習得すれば、この技術はソフトリソグラフィーを必要とせずに簡単に行うことができます。