微生物シングルセル解析のためのマイクロ流体ピコリットルバイオリアクター:作製、システムセットアップ、操作

本手順の全体的な目的は、マイクロ流体培養デバイスを用いて、一定の環境条件下で単一細菌および進化する同系マイクロコロニーを、空間的・時間的に完全な解像度で解析することである。これはまず、CADソフトウェアを用いてマイクロ流体培養システムを設計することで達成される。次に、ポリジメチルシロキサンを用いて使い捨てのマイクロ流体培養デバイスを作製する。このデバイスにはピコリットルバイオリアクターが含まれており、細菌を単層成長に制限するために高さが1 micronに設定されている。

次に、微生物培養液をマイクロ流路デバイスに注入し、バイオリアクター内の単一のマザーセルを接種します。これらの細胞は、システムを通じて増殖培地を連続的に注入することで増殖させます。結果として、工業的に重要な Corynebacterium glutamicum 株の培養、増殖データ、および細胞間の不均一性を示す自動タイムラプス顕微鏡観察の結果が得られます。

従来のバイオテクノロジーにおける分析の多くは、平均データに基づいています。当社のマイクロ流体デバイスは、空間的および時間的分解能を伴う個々の細菌のシングルセル解析を可能にします。これは、同系マイクロコロニーにおける細胞間の不均一性を詳細に観察するための有用なツールです。

一般的なSU-8フォトリソグラフィとポリジメチルシロキサン（PDMS）チップ成形を用いて、サブミクロンレベルの分解能を持つ使い捨てマイクロ流体デバイスを作製します。我々は、Escherichia coliやCorynebacterium glutamicumなどの複数のバイオテクノロジー微生物を用いて、この技術を実証しました。まず、CADソフトウェアを使用してマイクロ流体デバイスを設計します。

本プロトコルで提示する設計は、2つの播種入口、2つの異なる基質を混合するためのグラジエントジェネレーター、1つの出口、および5つのバイオリアクターからなる6つのアレイで構成されています。クリーンルームにおいて、4インチシリコンウェハーを用意し、付随するテキストプロトコルに従って、1 µmのSU-8 2000.5フォトレジストをウェハー上にスピンコートします。コートしたウェハーを95 °Cのホットプレートに置き、過剰な溶媒を除去した後、ピコリットリアクターのトラッピング領域を含む第1層のフォトマスクとコート済みウェハーをマスクアライナーに挿入します。

次に、真空接触モードで、350〜400 nmの光を強度7 mW/cm²で3秒間照射します。水平なホットプレートを用いて95 °Cでポストエクスポージャーベークを行い、SU-8の重合を開始させます。続いて、ウェハをSU-8現像液に1分間浸漬し、その後、新鮮なSU-8現像液が入った2つ目の容器にウェハを数秒間移します。

ウェハをイソプロパノールで洗浄し、SU-8現像液を除去した後、窒素気流またはウェハスピナーを用いてウェハを乾燥させます。次に、150 °Cで10分間、ウェハをハードベークします。続いて、マスターモールドを完成させるため、付属のテキストプロトコルに従って2層目を作製します。

ベース剤と硬化剤を10対1の比率で混合し、PDMSチップの作製を開始します。真空デシケーター内で、気泡がすべて消失するまで約30分間、PDMS混合物を脱気します。次に、SU-8ウェハーを成形装置にセットし、ウェハー上に3 mmの厚さでPDMS混合物を注ぎます。

その後、PDMSをオーブンで80 °Cで3時間焼成します。冷却後、ウェハーからPDMSスラブを慎重に剥がし、清潔で鋭利なメスを用いてスラブを個別のチップに切り分けます。チップをn-ペンタン浴で90分間洗浄し、続いてアセトン浴で90分間の洗浄を2回行います。

溶媒の残留物を除去するため、チップを一晩乾燥させます。実験の直前に、チューブとPDMSチップを接続するために使用するコネクタよりもわずかに直径の小さい針またはホールパンチャーを用いて、PDMSチップに入口と出口の穴を開けます。次に、マイクロ流路PDMSチップをイソプロパノールで丁寧に洗浄し、セロハンテープを使用して付着した塵粒子を除去します。

また、170 micronの薄いガラススライドを、まずアセトン、次にイソプロパノール、続いて脱イオン水で洗浄し、窒素気流で乾燥させます。洗浄および乾燥後、出力50 Watts、酸素流量20 sccmの条件で、ガラススライドとPDMSチップを25秒間プラズマ酸化させます。その後、PDMSとガラスチップを慎重に合わせ、PDMSをガラスの上に配置すると、数秒で接合されます。

セットアップを80 °Cで10秒間加熱し、接合部を固定します。チップ実験用に細菌を調製するため、C.glutamicumなどの目的の細菌株の単一コロニーを20 mLの新鮮なBHI培地に接種し、ロータリーシェーカーを用いて120 RPM、30 °Cで一晩培養します。翌朝、このスターター培養液から10 µLを、目的の培地20 mLを含む2つ目の培養液に移し、同様の条件下で一晩細胞を増殖させます。

翌日、倒立顕微鏡のインキュベーターを30 °Cに予熱します。この操作には、装置の構成によって最大2時間かかる場合があります。予熱している間に、インキュベーターを開いて目的の対物レンズを選択し、必要な封入剤を用いて準備してください。

次に、チップをチップホルダーに取り付け、しっかりと固定します。顕微鏡上でサンプルを中央に配置し、ピコリットルバイオリアクターアレイに焦点を合わせます。チップにピントが合った状態で、適切なチューブを用いて入口と出口を接続し、出口チューブを廃棄液リザーバーに入れます。

次に、シリンジに新鮮な培地を満たしてシリンジポンプにセットし、チップをプライミングするため、流速 200 nanoliters per minute で1時間、マイクロ流路を洗浄します。細胞がまだ対数増殖期の初期段階にある間に、細菌培養液 1 milliliter を滅菌シリンジに移し、培地が入ったシリンジとチューブを、細胞懸濁液が入ったシリンジと新しいチューブに交換します。ほとんどのピコリットルバイオリアクターが満たされるまで、細胞懸濁液を体積流量 200 nanoliters per minute で流路内に注入します。

充填されるバイオリアクターの数が少ない場合は、流量を800〜1200 nanoliters per minuteに上げてください。目的の細胞数が播種されたら、細胞懸濁液を切り離し、チップに増殖培地を再接続して、100 nanoliters per minuteで新鮮な培地を灌流させます。次に、チップをスキャンし、タイムラプスイメージングを行う特定のバイオリアクターを選択してください。

次に、バイオリアクターの開始から終了までを撮影し、実験を開始するために、タイムラプス顕微鏡のシーケンスを設定します。すべてのピコリットルバイオリアクターが過成長したら、実験を停止し、チップを適切に廃棄してください。解析を開始するには、まず、母細胞の数や位置など、実験で求められるすべての基準を満たしているバイオリアクターを特定します。

Image Jなどの解析プログラムを用いて、各時点での細胞数をカウントし、各マイクロコロニーの増殖率を決定します。時間と細胞数の対数をプロットし、最大増殖率を算出してください。本システムは、増殖、形態、または蛍光シグナルなどのさまざまな生物学的パラメータに関して、多様な細菌種の研究に適用することが可能です。

この例では、C.glutamicumを標準的な培養条件下で培養し、その結果得られた3つの同系マイクロコロニーからの増殖曲線を示しています。また、ここで示すように、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いることで、ピコリットルバイオリアクターがタンパク質生産の解析に有用であることが証明されています。タンパク質誘導剤であるIPTGを低濃度で細胞に曝露させることにより、単一の母細胞から始まったコロニー内において、タンパク質の細胞間変動を単一細胞レベルで研究することが可能です。

実演されたこの手法は、環境を完全に制御しながら単一の細菌細胞をモニタリングおよび分析するために適用可能です。これは従来のベンチスケールの培養システムではほとんど不可能です。このビデオを視聴することで、同様の単一細胞分析を行うためのマイクロ流体培養チップの作製方法について、十分に理解することができるはずです。