微生物シングルセル解析のためのマイクロ流体ピコリットルバイオリアクター:作製、システムセットアップ、操作

この手順の全体的な目標は、マイクロ流体培養デバイスを使用して、一定の環境条件下で単一の細菌と進化する同質遺伝子マイクロコロニーを完全な空間的および時間的分解能で分析することです。これは、まずCADソフトウェアを使用してマイクロ流体培養システムを設計することによって達成されます。次に、ピコリットルバイオリアクターを1ミクロンと高さで含んだポリジメチルシロキサンから使い捨てマイクロ流体培養装置を作製し、細菌の単層増殖を抑制します。

次に、微生物培養物をマイクロ流体デバイスに注入して、バイオリアクター内の単一母細胞に接種します。これらの細胞は、システムを介して増殖培地を連続的に注入することにより増殖します。結果は、工業的に関連性のあるCorynebacterium glutamicum株の培養、成長データ、および細胞間の不均一性を示す自動タイムラプス顕微鏡から得られます。

従来のバイオテクノロジーでは、ほとんどの分析は平均的なデータに基づいています。当社のマイクロ流体デバイスは、空間的および時間的な分解能で個々の細菌のシングルセル解析を容易にします。これは、同質遺伝子マイクロコロニーの細胞間の不均一性を詳しく調べるのに便利なツールです。

一般的なSU-8フォトリソグラフィーとポリジメチルシロキサンチップ成形を適用して、サブマイクロメディア解像度の使い捨てマイクロ流体デバイスを製造しています。私たちは、大腸菌やコリネバクテリウム・グルタミカムなどのいくつかのバイオテクノロジー微生物で技術を実証することに成功しました。まず、CADソフトウェアを使用してマイクロ流体デバイスを設計します。

このプロトコルで提示される設計は、2つの播種入口、2つの異なる基質を混合するための勾配発生器、1つの出口、およびそれぞれ5つのバイオリアクターからなる6つのアレイで構成されています。クリーンルームで、4インチのシリコンウェーハを準備し、付属のテキストプロトコルで説明されているように、1ミクロンのSU-8 2000.5フォトレジストをウェーハ上にスピンコードします。コーティングされたウェーハを摂氏95度のホットプレートに置き、余分な溶媒を排出し、ピコレータリアクターのトラップ領域とコーティングされたウェーハからなる第1層のフォトマスクをマスクアライナー内に挿入します。

次に、真空接触モードのウェーハを350〜400ナノメートルの光に7ミリワット/平方センチメートルの強度で3秒間さらします。摂氏95度の水平ホットプレートで露光後ベークを行い、SU-8の重合を開始します。次に、ウェーハをSU-8現像槽に1分間入れ、次にウェーハを新しいSU-8現像剤を入れた2番目の容器に数秒間移します。

ウェーハをイソプロパノールですすぎ、SU-8現像液を除去し、窒素フローまたはウェーハスピナーを使用してウェーハを乾燥させます。次に、ウェーハを摂氏150度で10分間ハードベークします。次に、マスターモールドを完成させるために、付属のテキストプロトコルで説明されているように第2の層を作製します。

PDMSチップの作製は、ベースと担持剤を10対1の割合で混合することから始めます。PDMS混合物を真空デシケーター内で約30分間、すべての気泡が消えるまで脱気します。次に、SU-8ウェーハを成形装置にセットし、ウェーハ上にPDMS混合物を3mm層に流し込みます。

その後、PDMSを80°Cのオーブンで3時間焼きます。冷却したら、PDMSスラブをウェーハから慎重に剥がし、清潔で鋭利なメスを使用してスラブを単一のチップに切断します。チップをn-ペンタン浴で90分間洗浄し、続いて2回のアセトン洗浄浴でそれぞれ90分間洗浄します。

チップを一晩乾燥させて、溶剤の残留物を取り除きます。実験の直前に、PDMSチップとチューブを接続するために使用されるコネクタよりもわずかに小さい直径のニードルまたはホールパンチャーを使用して、PDMSチップに入口と出口の穴を開けます。次に、マイクロ流体PDMSチップをイソプロパノールで慎重に洗浄し、スコッチテープを使用して付着したほこりの粒子を取り除きます。

また、170ミクロンの薄いスライドガラスを最初にアセトンで洗浄し、次にイソプロパノールで洗浄し、次に脱イオン水で洗浄し、窒素の流れでスライドを乾燥させます。きれいになって乾いたら、50ワットの電力と20sccmの酸素流量を使用して、スライドガラスとPDMSチップをプラズマで25秒間酸化します。次に、PDMSとガラスチップを慎重に位置合わせしてから、PDMSをガラスに載せると、数秒で結合します。

セットアップを摂氏80度で10秒間焼き、ボンドを固定します。チップ実験用の細菌を調製するには、C.glutamicumなどの目的の細菌株の単一コロニーを20ミリリットルの新鮮なBHI培地に接種し、培養物をロータリーシェーカーで摂氏30度で一晩、120RPMでインキュベートします。翌朝、10マイクロリットルのスターター培養物を20ミリリットルの所望の培地を含む第2の培養物に移し、細胞を同じ条件下で一晩増殖させる。

翌日、倒立顕微鏡のインキュベーターを摂氏30度に予温します。これには、個々の設定に応じて最大 2 時間かかる場合があります。セットアップが温まっている間に、インキュベーターを開き、目的の対物レンズを選択し、必要な封入剤で調製します。

次に、チップをチップホルダー内に取り付けて固定します。サンプルを顕微鏡の中央に置き、ピコリットルバイオリアクターアレイに焦点を合わせます。チップに焦点を合わせた状態で、インレットとアウトレットを適切なチューブで接続し、アウトレットチューブを廃棄物リザーバーに配置します。

次に、シリンジに新しいメディアを充填し、シリンジポンプに入れ、マイクロ流体チャネルを毎分200ナノリットルの流量で1時間すすぎ、チップをプライミングします。細胞がまだ初期の指数関数的増殖段階にある間に、1ミリリットルの細菌培養物を滅菌シリンジに移し、シリンジと培地を含むチューブを細胞懸濁液と新しいチューブと交換します。細胞懸濁液を毎分200ナノリットルの体積流量でチャネルに注入し、ほとんどのピコリットルバイオリアクターが満たされるまで

充填するバイオリアクターの数が少ない場合は、流量を毎分800〜1200ナノリットルに増やします。所望の量の細胞が播種されたら、細胞懸濁液を切断し、増殖培地をチップに再接続し、毎分100ナノリットルで新鮮な培地で灌流します。次に、チップをスキャンし、タイムラプスイメージング用の特定のバイオリアクターを選択します。

次に、バイオリアクターを最初から最後までイメージングし、実験を開始するために、タイムラプス顕微鏡シーケンスを構成します。すべてのピコリットルバイオリアクターが生い茂ったら、実験を停止し、チップを適切に廃棄します。分析を開始するには、まず、どのバイオリアクターが母細胞の数や位置など、実験に必要なすべての基準を満たしているかを判断します。

画像Jなどの解析プログラムを用いて、各時点における細胞数をカウントすることにより、各マイクロコロニーの増殖速度を決定します。セル番号の対数に対して時間をプロットすることにより、最大成長率を計算します。ここで紹介するシステムは、成長、形態、蛍光シグナルなどのさまざまな生物学的パラメーターに関して、さまざまな細菌種を研究するために適用できます。

この例では、C.glutamicumを標準的な培養条件下で培養し、3つの同質遺伝子マイクロコロニーから得られた成長曲線をここに示しています。ピコリットルバイオリアクターは、ここに示すように、タイムラプス蛍光顕微鏡を使用してタンパク質産生にアクセスするのにも有用であることが証明されています。細胞を低濃度のタンパク質誘導体IPTGに曝露することにより、タンパク質の細胞間変動を、単一の母細胞から始まるコロニー内の単一細胞レベルで研究することができます。

実証された技術は、完全な環境制御で単一の細菌細胞を監視および分析するために適用できます。これは、従来のベンチスケールの栽培システムではほとんど不可能です。このビデオを見れば、同等のシングルセル解析を行うためのマイクロ流体培養チップの調製方法について十分に理解できるはずです。