微小粒子状物質に曝露されたゼブラフィッシュ胚中の多環芳香族炭化水素を検出するための修正QuEChERS-HPLC法

この研究は、EOMに曝露されたゼブラフィッシュ胚のPAHを定量するための修正QuEChERS-HPLC法を開発し、胚の質量サイズと生物学的マトリックスの複雑さによる内部PAHレベルの測定における技術的課題によって引き起こされる現在のギャップに対処することを目的としています。信頼できる結果を得るには、グループあたり 200 個の胚が必要であり、実際的な課題があります。HPLCと蛍光検出器を組み合わせることで、分析法の感度をさらに向上させることができます。他の技術と比較して、この修正されたQuEChERS-HPLC法は、サンプルのハングタイムを大幅に短縮し、EOMに曝露されたゼブラフィッシュ胚の16 PAHのレベルを分析するための迅速かつ効率的なアプローチを提供します。

[ナレーター]まず、受精後72時間でインキュベーターから胚を含む皿を取り出して、QuEChERSサンプルを準備します。胚を純水で3回洗います。胚を1.5ミリリットルのチューブに移し、余分な水分を取り除きます。チューブを摂氏マイナス80度の冷凍庫に30分間入れて、胚を凍結乾燥します。凍結乾燥後、ガラス棒を使用して胚を粉砕します。25マイクロリットルの16多環芳香族炭化水素(PAH)をDMSO対照群に混合標準溶液を加えて、スパイク回収率をテストします。次に、1ミリリットルのn-ヘキサンを加え、30秒間ボルテックスします。混合物を摂氏35度で30分間超音波処理します。次に、サンプルを7,000gで5分間遠心分離します。上清を新しいチューブに移します。採取した上清を、摂氏35度の水浴中の窒素流下で蒸発させて乾燥させます。1ミリリットルのアセトニトリルを加え、30秒間ボルテックスします。10ミリグラムの第一級第二級アミン、45ミリグラムの硫酸マグネシウム、および15ミリグラムのC18充填液をサンプルに加え、30秒間ボルテックスします。7,000gで5分間遠心分離し、上清を新鮮なチューブに移します。窒素下で上清を0.5ミリリットルに蒸発させ、0.22マイクロメートルの微多孔質膜を通してサンプルをろ過します。アセトニトリルを使用して、16 PAH混合標準液用に1〜500ナノグラム/ミリリットルの範囲の一連の作業溶液を調製します。アセトニトリルまたは水移動相を使用して、20マイクロリットルのサンプル溶液を液体クロマトグラフに注入し、画面に示されている溶出手順に従います。x軸に標準作業溶液の質量濃度、y軸に対応するピーク面積で標準曲線をプロットし、5ナノグラム/ミリリットルから500ナノグラム/ミリリットルの範囲をカバーします。精製したサンプルを、蛍光検出器(FLD)およびダイオードアレイ検出器(DAD)を備えた液体クロマトグラフに注入します。保持時間を比較して PAH の存在を特定します。ピーク面積を測定して濃度を決定します。最後に、測定された質量濃度に基づいて 16 種類の PAH の内部濃度を計算します。受精後72時間のゼブラフィッシュ胚中の多環芳香族炭化水素(PAH)の濃度をこの表に示します。抽出可能な有機物(EOM)が曝露したゼブラフィッシュ胚から6つのPAHが検出されました。対照的に、DSMO コントロール サンプルでは 2 つの PAH のみが同定され、EOM サンプルのレベルよりも有意に低かった。