ヒト脳組織からのタンパク質の多発反応モニタリングを用いた定量的プロテオミクスワークフロー

このプロトコルは、臨床サンプルからのタンパク質の多重反応モニタリング(MRM)のための三重四重極質量分析計の使用を導入することを目的としています。我々は、サンプル調製から臨床サンプルのデータ分析に始まる体系的なワークフローを提供し、必要な予防措置をすべて講じています。

標的型プロテオミクスアプローチは、短期間のプロテオミクスベースの実験や分子生物学ベースの実験からタンパク質を検証するための選択肢として急速になりつつあります。多発反応モニタリングは、生物学的サンプルからタンパク質を検出して定量するためにますます使用されているそのような標的アプローチの1つです。本研究では、MRM実験の基本的な要件を読者に紹介することを目的として、ヒトの脳組織からタンパク質を検出し、定量化する様々なステップを歩いてきた。

約50mgの脳組織の重量を量り、300マイクロリットルの1倍のリン酸緩衝生理食塩水で組織を洗う。このステップは、組織の外表面上の任意の血液を除去するために行われ、したがって、できるだけ多くの血液を除去することをお勧めします。PBSでの化水に続いて、組織を含むチューブに300マイクロリットルの溶菌バッファーを加える。

氷浴にチューブを保ちながら、プローブ超音波処理器を使用して組織をライゼします。ビーズビーターを使用して組織を均質化し、組織を完全に分解します。チューブの内容物を摂氏4度で15分間15分間遠心分離する。

上清を新鮮なチューブに移し、均質に混ぜます。上清の小さなアリコートを取り、標準的なタンパク質アッセイを用いてタンパク質含有量を定量化する。ここでは、ブラッドフォードアッセイを用いたタンパク質推定例を示す。

マイクロ遠心分離チューブに50マイクログラムのタンパク質を取り、最終的な濃度が20ミリモルになるようにTCEPを加えることによって内容物を減らします。37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブにヨウ酢酸アセトアミドを添加して還元されたタンパク質をアルキル化し、最終的な濃度が40ミリモルとなる。

30分間暗い中でチューブをインキュベートします。今度は、尿素の最終濃度が1モル未満になるように、還元されたアルキル化タンパク質を含むチューブにバッファBを加える。30酵素対タンパク質比に1にトリプシンを加え、一定の揺れで37度で一晩チューブをインキュベートします。

消化後、消化したペプチドを真空濃縮器に濃縮する。このステップでは、ペプチドは、再構成して脱塩するか、または将来の使用のためにマイナス80で保存することができます。LC-MS MSにサンプルをロードする前に、脱塩、またはペプチドのクリーンアップが不可欠です。サンプル中の塩やその他の汚染物質は、カラムを詰まらせ、長期的には器具の感度に影響を与える可能性があります。

このプロセスは、市販のC18 STAGEチップまたはカラムを使用して実行することができる。ここでは、C18 STAGEチップを用いたペプチド脱塩のワークフローを描いた。脱塩後、真空濃縮器でペプチドを乾燥させます。

これらのクリーンペプチドを再構成し、スコープ法を用いて定量化を進める。このために、サンプルの2マイクロリットルをマイクロドロッププレートにロードし、スライドに示すように濃度を計算します。移行リストの準備は、SRM または MRM 実験の重要なステップです。

遷移リストには、質量分析計が遷移を監視するために必要なすべての情報が含まれています。これには、前駆体および生成物イオンのm x z値、遷移の衝突エネルギー、装置の極性、およびデータ取得の時間範囲が含まれる。スカイラインを使用して、遷移リストを準備します。

UniProtのヒューマンプロテオームファスタファイルを使用してバックグラウンドプロテオームを準備し、ペプチド設定の[背景]タブで選択されていることを確認します。[フィルタ]タブで、最小長を 8、最大長を 25 に設定します。ペプチドに他の変更がない場合は、デフォルト設定を使用し続けます。

ペプチドの設定が完了したら、トランジション設定をクリックします。[フィルタ]タブで、[前駆体料金]を 2 と 3 に設定します。イオン料金を 1 に設定し、Ion タイプを y に設定します。

製品イオンは、ユーザーの選択に応じて選択することができます。すべてのパラメータをデフォルトのままにします。ここで、選択したターゲットタンパク質の受取 ID を挿入します。

これは、[編集]タブをクリックし、[挿入]を選択して、最後にアクセスIDを貼り付ける方法で行うことができます。IDは、バックグラウンドプロテオーム内のタンパク質にマッピングされ、先に設定したペプチドと遷移設定に基づいて作成された遷移リストが作成されます。この遷移リストをエクスポートします。

[インストゥルメントタイプ]ドロップダウンオプションをクリックして、適切な計測器が選択されていることを確認します。この場合、器械はサーモアルティスである。未定義の遷移リストの遷移数が多すぎるため、リストごとに 350 回の遷移の制限を保持し、複数のメソッドとしてエクスポートします。

バイナリー溶媒システムが使用されます。溶媒Aは1%FA、溶媒Bは80%ACNである。流量を毎分450マイクロリットル、勾配を示すように保ちます。

カラムコンパートメント温度を摂氏45度に設定します。列および LC システムの詳細については、テキストを参照してください。TSQ Altis の MS 設定がここに示されていることを確認します。

単一の遷移リストをインポートして、新しいメソッドを作成します。四重極1と四重極3の解像度を7に保つことを提案します。必要に応じて、これらをさらに最適化できます。

実行の一貫性と結果的にデータ品質を確保するには、次に示すように実行シーケンスを準備します。ブランクのカップルから始めて、ブランク混合物の組成のテキストを参照し、続いて既知の濃度のQC標準光BSAを参照して、機器の日単位応答の変動を監視する。QCはサンプルの直前に行う必要があります。

次に、すべてのサンプルを間にブランクで並べて表示します。各サンプルの等量を注入し、1回の注射につき25~1ナノグラムのペプチドを考慮する。洗練されたメソッドを作成するには、最初にサンプル全体に対して未定義のメソッドを実行します。

結果をスカイラインにインポートし、各ペプチドを手動で確認します。ペプチドごとに、全てのサンプルにおいて一貫して良好なピークを示す前駆体を1つ選択する。良好なピークを示していない前駆体とペプチドを削除します。.

すべてのピークに適切なアポイントトが設定されていることを確認します。右のピークを選択し、各前駆体の下の遷移をさらに細かくするために、ライブラリを使用できます。ライブラリは、現在の実験データのペプチドと遷移と一致するMS-MSスペクトルデータのセットです。

DART P値が1近いピークを選択し、ライブラリに一致しないトランジションを削除します。DART P値は、実験ピークとライブラリピークの間でのマッチの良さを示します。最適化の1つまたは2つのラウンドの後、洗練されたリストが準備されます。

この絞り込みリストは、個々のサンプルに対して実行できます。洗練されたランをスカイラインにインポートし、ピークに適切にアポイントする。ドキュメント グリッドの各サンプルに注意して注釈を付けるには、[ドキュメントの設定] の下にある [注釈] タブを使用します。

グループ比較機能を使用して、実験の条件 1 と条件 2 の比較を作成します。これにより、調整されたP値を持つテーブルが与え、2つのグループ間で値を折り畳みます。私たちの知る限りでは、これは、ヒト脳組織サンプル中のアポリポタンパク質A-1、ビメンチン、ニコチンアミドホスホリボシルトランスファーゼのタンパク質のペプチドを検出するためにMRMを使用した最初の研究です。

LC勾配、ドウェル時間、サイクルタイム、衝突エネルギーなどのさまざまなパラメータを最適化すると、MRM実験の成功に大きく影響します。この技術は、異なる臨床状態と疾患を区別する能力を持つバイオマーカーのパターンを開発するために使用できると考えています。