Name: ヒト脳組織からのタンパク質の多発反応モニタリングを用いた定量的プロテオミクスワークフロー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 学ぶヒト脳組織を用いたMRM定量的プロテオミクスワークフロー。組織溶解からトリプシン消化、質量分析までの標準化されたプロトコルを解説し、臨床試料からのタンパク質定量とバイオマーカー発見への応用を示します。

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我々は、MHRD-UAYプロジェクト(UCHHATAR AVISHKAR YOJANA)、バイオテクノロジー省(BT/PR13114/INF/22/2015)が支援するIITボンベイのSSおよびMASSFIITB施設へのプロジェクト#34_IITBを認め、MS関連の実験をすべて実施します。
私たちは、ビデオ全体の制作と編集のためのリシャブ・ヤダフ氏とオーディオを編集する彼の仕事のためのニシャント・ネウルカー氏に私たちの特別な感謝を拡張します。

この研究は、ヒト参加者からの脳組織サンプルを含み、TMHとIITB IECによってレビューされ、承認された- (IITB-IEC/2018/019)。参加者は、この研究に参加するための情報と書面による同意を提供しました。
1 脳組織からのタンパク質抽出
<ol><li>約50mgの脳組織の重量を量り、マイクロピペットを使用して300μLの1xリン酸緩衝液生理塩(PBS)で組織を洗浄する。 注:このステップは、組織の外表面上の血液を除去するために実行され、必要に応じて繰り返す必要があります。下流のタンパク質推定と処理を妨げるので、組織からできるだけ多くの血液を除去することをお勧めします。</li>
	<li>PBSでの化流に続いて、組織を含むチューブに300μLの溶精バッファー(バッファA)を加える。バッファAは8 M尿素、50 mMトリスpH 8.0、75 mM NaCl、1 mM MgCl2 およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(製造業者の指示に従って)を含む。 注:タンパク質の収量は、サンプルが保存される条件、出発物質の量、および処理中のサンプルの取り扱いの効率に至るまで、いくつかの要因によって異なります。50 mg 未満の組織の量を処理する場合、バッファー A の量を比例的に減らします。</li>
	<li>氷浴にチューブを保ちながら、プローブ超音波処理器を使用して組織をライゼします。超音波処理のために次のパラメータを使用してください:40%の振幅、2:30分のサイクルのオンとオフ5秒。</li>
	<li>ビーズビーターを使用して組織を均質化し、組織を完全に分解します。 注:このステップは、90秒間中速で実行し、その後氷上で3〜5分間インキュベーションを行う必要があります。</li>
	<li>チューブの内容物を6,000xgで4°Cで15分間遠心分離します。 上清を新鮮なチューブに移し、均質に混ぜます。 注:サンプルのアリコートを作成し、さらに使用するまで-80°Cで保存してください。</li>
</ol>2 タンパク質定量と品質チェック
<ol><li>BSAの既知の濃度で作られた標準的なグラフを使用して消化前のサンプルを定量化します。 注:タンパク質推定に使用されているアッセイが、タンパク質のライセートを作るのに使用されるバッファーと互換性があることを確認してください。SDS-PAGEゲルを動かしてタンパク質のライセートの品質を確認します。</li>
</ol>3 タンパク質消化
<ol><li>マイクロ遠心分離管に50μgのタンパク質を取り、最終的な濃度が20mMになるようにトリス2カルボキセチルホスフィン(TCEP)を添加してタンパク質を減少させます。37°Cで1時間インキュベートする。</li>
	<li>インキュベーション後、その最終濃度が40mMになるようにチューブにヨウドアセトアセトアミド(IAA)を添加して還元タンパク質をアルキル化する。30分間暗い中でチューブをインキュベートします。 注:チューブに追加する直前にIAAを準備してください。</li>
	<li>チューブ内の尿素の最終濃度が1M未満になるように還元およびアルキル化タンパク質を含むチューブにバッファーBを加える。 メモ:バッファBは25 mMトリ(pH 8.0)と1 mM CaCl2 で構成され、サンプルを希釈するために使用されます。希釈時に、トリプシンを添加した後の最適なタンパク質消化のために、チューブの内容物が8のpHを有することを確認してください。</li>
	<li>タンパク質比に1:30酵素にトリプシンを加え、一定の揺れで37°Cで一晩チューブをインキュベートします。</li>
	<li>消化後、消化された製品を真空濃縮器に濃縮します。このステップでは、ペプチドを再構成して脱塩するか、将来の使用のために-80°Cで保存することができます。</li>
</ol>4 脱塩・ペプチド定量
注:LC-MS/MSのサンプルをロードする前に脱塩またはペプチドのクリーンアップが不可欠です。このプロセスは、市販のC18ステージチップまたはカラムを用いて行うことができる。
<ol><li>20 μLのアセトニトリル(ACN)を0.1%のギ酸(FA)で活性化します。1,000 x gで内容を1分間遠心し、流れを捨てます。 注意:遠心分離の条件は、手順の最後まで同じです。</li>
	<li>ステップ 4.1 のように、100% ACN を 0.1% FA に 20 μL 加え、内容物を遠心分離します。 注: アクティベーションの手順は、数回繰り返すことができます。</li>
	<li>活性化後、ステップ4.1で行ったステージ先端および遠心分離機を通して再構成されたペプチドサンプルの20μLを渡す。 注: この手順では、フローを破棄しないでください。</li>
	<li>ステップ 4.3 を少なくとも 5 回の流れで繰り返し、ステージチップへの最大ペプチド結合を確実にします。</li>
	<li>ステージチップを通して0.1%FAの20 μLを渡し、流れを通して廃棄します。 注: この手順を 2 回繰り返して、結果を改善します。</li>
	<li>ACNの増加濃度、すなわち、40%、60%および80%をそれぞれ通過させることによって、新鮮なマイクロフュージチューブ中に結合したペプチドを溶出させる。</li>
	<li>真空濃縮器でペプチドを乾燥させ、ペプチド定量を進めます。</li>
	<li>乾燥したペプチドを0.1%FAで再構成し、スコープ法5を用いて定量化する。</li>
</ol>5 確定目標の遷移リストの準備
注: 移行とは、MRM 実験における前駆体(Q1)から製品(Q3)の m/z 値のペアを指します。ペプチドは、同じ Q1 値を持つが、異なる Q3 値を持つ 1 つから多くの遷移を持つことができます。三四重極質量分析計は、ペプチドとその製品を検出するための遷移の情報を必要とします。したがって、対象となる実験を開始する前に、遷移リストを準備する必要があります。これは、SRMAtlas6 (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) のオンラインリポジトリまたは Skyline7 (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view) と呼ばれるオープンソースソフトウェアを使用して行うことができます。
<ol><li>UniProt(https://www.uniprot.org/)から最近のヒトプロテオームFASTAファイルをダウンロードし、スカイラインに挿入してバックグラウンドプロテオームファイルを作成します。ペプチド設定では、 バックグラウンドプロテオーム ドロップダウンに移動し、人間のプロテオームのFASTAシーケンスファイルで[追加]フィードをクリックします。次の手順に進む前に、このデータベースが選択され、切断の許容値が 0 に設定されていることを確認します。</li>
	<li>今、ペプチド設定のフィルタタブの下で、8から25アミノ酸に受け入れられたペプチドの長さを区切ります。</li>
	<li>[ 遷移設定]の [ フィルタ ] タブで [前駆体料金] を 2,3 に設定し、[ イオン料金] を 1 に設定し、[ イオンタイプ] を y に設定します。製品イオンは、ユーザーの選択に応じて選択することができます。特殊イオン の場合は N 端子を 選択し、その他のパラメータはすべてデフォルトのままにします。 注: ペプチドと遷移の設定は、実験によって異なる場合があります。</li>
	<li>[ 編集] をクリックして [挿入] に移動し、目的のペプチドまたはタンパク質を 挿入します。タンパク質を挿入し、その加盟IDをコピーし、特定のペプチドを挿入するには、ペプチド配列をコピーします。このソフトウェアは、受話IDをバックグラウンドプロテオームにマッピングし、移行リストはペプチドと遷移設定に基づいて作成されます。</li>
	<li>遷移リストをエクスポートします。 [計測器タイプ]のドロップダウンで、適切な計測器が選択されていることを確認します。最適化実験では、Skylineでファイルごとに必要なトランジション数を設定することで、トランジションリストを小さな数値に分割することができます。これにより、1 回の実行で、インストゥルメントが過剰に多くの遷移をスクリーニングすることがなくなります。遷移の数は、単一のメソッドを取得するためにさらに最適化する必要があります - これは、メソッドの絞り込みセクションの下で今後言及します。</li>
</ol>6 LC パラメータ
<ol><li>0.1%FA(ソルベントA)を含む水性溶媒と80%ACN(ソルベントB)を含む有機溶媒を含む二分溶媒系を使用してください。</li>
	<li>カラム温度を45°Cに設定します。</li>
	<li>LC勾配を450 μL/minの流量で10分に設定します( 表S1に示すように)。</li>
</ol>7 MS パラメータ
注:説明アッセイはTSQアルティストリプル四重極質量分析計のために開発され、最適化されています。
<ol><li>Q1 および Q3 の解像度、時間とサイクル時間の順に実行するパラメーターを最適化する - 一度に 1 つのパラメーター。Q1 と Q3 の解像度は 0.7 で最も効果的です。サイクルタイムまたはドウェル時間は、遷移の数と監視されているペプチドの平均ピーク幅に応じて微調整する必要があります。</li>
	<li>表 S2 および表 S3の MS パラメータを使用します。 メソッドの合計所要時間は 10 分です。 注: 特に指定がない限り、パラメータはメソッド絞り込みの間および後のすべての実行で同じままです。新しい実験では、サンプルの種類やサンプル処理手順に応じて、特定のパラメータを変更する必要がある場合があります。</li>
</ol>8 実行シーケンスと計測器の QC
<ol><li>水の混合物を調製:メタノール:イソプロパノール:アセトニトリル1:1:1:1比で。この混合物をブランクとして使用します。</li>
	<li>一貫して機器の性能を監視するために使用することができる任意の標準的なサンプルのためのペプチドを準備します。これはQC標準として使用されます。最適化されたBSAダイジェストからペプチドを検出し、数日間にわたって良好で一貫した応答を与える(図2)。</li>
	<li>サンプルを実行するには、シーケンスは、QC標準および臨床サンプルの後に、ブランクのカップルで開始する必要があります。2 つの連続したサンプルの間に必ず 1 つのブランクがあることを確認してください。</li>
	<li>比較を容易にするために、各サンプルの量と量が毎回均等に注入されるようにしてください。</li>
</ol>9 メソッドの絞り込み
<ol><li>スカイラインを使用して、プールされたサンプルから得られた予備データを分析します。最適な結果を選択するには、最適なピーク、トランジション、およびピークシェイプや強度などのパラメータを探します。ファイルを新しいスカイライン プロジェクトとして保存します。</li>
	<li>最適な一致ピークを見つけるためにライブラリを使用し、その結果、可能な限り最良の遷移リストをお勧めします。ライブラリは、文献または社内の実験から利用できる MS/MS ピークのセットです。</li>
	<li>新しく保存した Skyline プロジェクトから新しい遷移リストをエクスポートし、この遷移リストを使用して新しい方法を作成します。作成した新しい方法からデータを取得し、スカイラインを使用してトランジションを調整するプロセスを繰り返します。</li>
	<li>スカイラインを用いたデータ分析の後にペプチドと遷移のリストが完成したら、サイクルタイムとドウェルタイムの異なる順列を試して方法を微調整します。 注:重い標識された合成ペプチドとインデックス保持時間(iRT)ペプチドを使用すると、方法の洗練が容易になります 8,9.したがって、これらのペプチドを用いて方法の微調整を行う方がよい。</li>
	<li>絞り込み実験の保持時間情報を使用して、スケジュールされた最終メソッドを作成します (取得期間が定義されています)。</li>
	<li>個々の被験者のサンプルを準備します。これらのサンプルのデータは、最終的なスケジュールされた方法を使用して取得されます。</li>
	<li>データが取得されると、Skylineに生ファイルをインポートすることで、さらにダウンストリーム分析とグループ別比較を実行できます。</li>
</ol>

<ol><li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+reaction+monitoring-based+proteomics%3A+Workflows%2C+potential%2C+pitfalls+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li>
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<li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li>
<li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li>
</ol>

著者らはサーモフィッシャーから出版料の支援を受けた。

免疫体化学や西洋ブロッティングなどの技術は、長年にわたりタンパク質標的の検証のための金の基準と考えられていました。これらの方法は、プロトコルのわずかな変更と技術への依存がほとんどない今日でも使用を見つけ、非常に面倒で退屈です。さらに、バッチ間で常に同じ特異性を示すものではなく、多くの専門知識を必要とする高価な抗体の使用も含まれます。さらに、質量分析のような高スループット技術を使用して同定されたタンパク質のごく一部しか、適合性の抗体が利用可能であり、さらに全体の手順を複雑にします。したがって、ターゲットプロテオームアッセイは、ターゲット10を検証するための新しいアプローチとして徐々に取り上げられています。ターゲット発見の大部分がハイスループットオミクスプラットフォームで起こっているので、検証されたターゲットのパネルは、臨床スクリーニングアプリケーション11、12、13についても検討されています。
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過去10年間、質量分析(MS)の急速な発展とクロマトグラフィー技術の理解の向上が、MSベースのプロテオミクスの進歩に大いに役立っています。西洋ブロッティングや免疫組織化学などの分子生物学ベースの技術は、再現性の問題、ターンアラウンドタイムの遅さ、観察者間変動性、タンパク質を正確に定量化できないことに長い間苦しんできました。このことから、高スループットプロテオミクスアプローチの優れた感度は、細胞内のタンパク質の役割をよりよく理解するための代替的で信頼性の高いツールを分子生物学者に提供し続けています。しかし、ショットガンプロテオミクスのアプローチ(データ依存型取得またはDDA)は、多くの場合、機器の感度と分解能に大きく依存しているだけでなく、複雑な組織の低い豊富なタンパク質を検出することができません。ここ数年、世界中のラボは、これらの高度に複雑なデータセットを処理できるコンピューティングパワーと信頼性の高いソフトウェアを必要とするデータ・インディペンデント・アクイジション(DIA)のような技術を開発してきました。しかし、これらのテクニックはまだ進行中の作業であり、あまりユーザーフレンドリーではありません。標的MSベースのプロテオミクスアプローチは、MSアプローチの高スループット性とELISAのような分子生物学アプローチの感度との間で完璧なバランスを提供します。標的質量分析ベースのプロテオミクス実験では、発見ベースの散弾銃プロテオミクス実験または利用可能な文献1、2から仮説駆動のタンパク質またはペプチドを検出することに焦点を当てています。多発反応モニタリング(MRM)は、複雑なサンプルからのタンパク質/ペプチドの正確な検出と定量を行うタンデム四重極質量分析計を使用する、このような標的MSアプローチの1つです。この技術は、低解像度の機器を使用する必要があるにもかかわらず、より高い感度と特異性を提供します。
四重極は4つの平行棒から成り、各棒は斜め反対側の棒に接続される。RF電圧とDC電圧を交互に適用することにより、四重極ロッド間に変動分野が生まれます。四重極内のイオンの軌道は、反対側のロッド間に同じ電圧が存在することによって影響されます。RFを直流電圧に印加することにより、イオンの軌跡を安定化させることができる。それは選択的に特定のイオンを通過させることができる質量フィルターとして使用することを可能にする四重極のこの特性である。必要に応じて、四重極は静的モードまたはスキャンモードで動作させることができます。スタティックモードでは、指定されたm/zを持つイオンのみが通過できるため、そのモードは非常に選択的で、対象のイオンに固有のモードになります。一方、スキャンモードでは、m/z範囲全体のイオンが通過します。したがって、タンデム四重極質量分析計は4つの可能な方法で動作することができます:i)第2のスキャンモードで動作している間、静的モードで動作する最初の四重極。ii)第2の静的モードで動作している間、スキャンモードで動作する最初の四重極。iii)スキャンモードで動作する両方の四極子。とiv)両方の四極子が静的モード3で動作します。典型的なMRM実験では、両方の四重極が静的モードで動作し、断片化後に特定の前駆体および生成された製品を監視することができます。これは、技術が非常に敏感かつ選択的になり、正確な定量化を可能にする。
分子生物学者にとって、人間の脳組織とその細胞は宝庫です。人体の常に興味深い器官のこれらの顕著な単位は、その機能に分子および細胞の洞察を提供することができます。脳組織のプロテオミクスの調査は、健康な脳の全身機能を理解するのに役立つだけでなく、いくつかの疾患によって引き起こされたときに調節が不整合になる細胞経路を理解するのに役立つだけでなく、 4.しかし、そのすべての異質性を持つ脳組織は、分析する非常に複雑な器官であり、分子レベルでの変化をよりよく理解するための協調的なアプローチを必要とします。以下の研究は、脳組織からタンパク質を抽出することから始まる全てのワークフローを説明し、MRMアッセイの方法を作成し、最適化し、標的の検証に向けて説明する(図1)。ここでは、より広範な研究コミュニティに技術とその課題を導入することを目的として、ヒト脳組織を用いたMRMベースの実験の成功に関わる主要なステップを体系的に強調しました。

<table><tbody><tr><td><強>試薬</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル(MSグレード)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A/0620/21</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>HiMedia</td><td>TC194-25G</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td> フィ<td>ッシャーサイエンフィック</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸(MSグレード)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>147930250</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>Sigma</td><td>1149-25G</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール (MS グレード)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Q13827</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Fischer Scienific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>メタノール (MS グレード)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>MS グレード水</td><td>Pierce</td><td>51140</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液生理食塩水</td><td>HiMedia</td><td>TL1006-500ML</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュ ダイアグノスティック</td>ス <td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>DF6D661300</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>シグマ</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>トリス ベース</td><td>メルク</td><td>648310</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン (MS グレード)</td> <td>ピアス</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>メルク</td><td>MB1D691237</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypersil Gold C18カラム</td><td>Thermo</td><td>25002-102130</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>ギルソン</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>ステージチップ</td><td>MilliPore</td><td>ZTC18M008</td><td></td></tr><tr><td>ジルコニア/シリカビーズ</td><td>BioSpec 製品</td><td>11079110z</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビーズビーター(ホモジナイザー)</td><td>Bertin Minilys</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー(分光光度計)</td><td>Thermo</td><td>MultiSkan Go</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Eutech</td><td>CyberScan pH 510</td><td></td></tr><tr><td>Probe Sonicator</td><td>Sonics Materials, Inc</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Shaking</td><td>Drybath Thermo</td><td>88880028</td><td></td></tr><tr><td>TSQ Altis 質量分析計</td><td>Thermo</td><td>TSQ02-10002</td><td></td></tr><tr><td>uHPLC - Vanquish</td><td>Thermo</td><td>VQF01-20001</td><td></td></tr><tr><td>真空濃縮器</td><td>Thermo</td><td>Savant ISS 110</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト脳組織からのタンパク質の多発反応モニタリングを用いた定量的プロテオミクスワークフロー

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

過去10年間の人間の脳組織のプロテオミクス分析は、脳の理解を大きく高めています。しかし、脳関連疾患は世界中の死亡の主要な貢献者であり続け、病態生物学をさらに深く理解する必要性が必要です。西洋ブロッティングや免疫体化学などの従来の抗体ベースの技術は、労働集約的で質的または半定量的であることに加えて、低スループットであることに苦しんでいます。従来の質量分析ベースの散弾銃アプローチでさえ、特定の仮説を裏付ける決定的な証拠を提供することができません。標的プロテオミクスアプローチは、主に仮説駆動であり、長く使用されてきた従来の散弾銃プロテオミクスアプローチとは異なります。多発反応監視は、タンデム四重極質量分析計または三重四重極質量分析計と呼ばれる特殊な質量分析計の使用を必要とするそのような標的型アプローチの1つである。今回の研究では、人間の脳組織を用いたタンデム四重極質量分析ベースのプロテオミクスワークフローを成功させ、より広範な研究コミュニティにこのワークフローを導入することを目的として、主要なステップを体系的に強調しました。

脳に異常を持つ患者の各群から10サンプル、5サンプルから3つのタンパク質の相対定量を行った。これらのタンパク質には、脳細胞において多様な役割を果たすことが知られているアポリポプロテインA-I(APOA-I)、ビメンチン(VIM)およびニコチンアミドホスホリン酸化転移酵素(NAMPT)が含まれていた。データの実行後の分析は、Skyline-daily(Ver 20.2.1.286)を使用して実行されました。3つのタンパク質に対応する10個のペプチドを合計で監視した。これらには、APOA-I用の3つのペプチド、VIM用の4つのペプチド、NAMPT用の3つのペプチドが含まれていました。これらの10ペプチドからの遷移の総数は57に及んだ。サンプルは、それらが属する状態に応じて、2つのグループのいずれかにグループ化されました。スカイラインのグループ比較機能を用いて、これらのペプチドのピーク満量を比較し、相対定量値を計算した(図3)。
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このプロトコルは、臨床サンプルからのタンパク質の多重反応モニタリング(MRM)のための三重四重極質量分析計の使用を導入することを目的としています。我々は、サンプル調製から臨床サンプルのデータ分析に始まる体系的なワークフローを提供し、必要な予防措置をすべて講じています。

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

標的型プロテオミクスアプローチは、短期間のプロテオミクスベースの実験や分子生物学ベースの実験からタンパク質を検証するための選択肢として急速になりつつあります。多発反応モニタリングは、生物学的サンプルからタンパク質を検出して定量するためにますます使用されているそのような標的アプローチの1つです。本研究では、MRM実験の基本的な要件を読者に紹介することを目的として、ヒトの脳組織からタンパク質を検出し、定量化する様々なステップを歩いてきた。約50mgの脳組織の重量を量り、300マイクロリットルの1倍のリン酸緩衝生理食塩水で組織を洗う。このステップは、組織の外表面上の任意の血液を除去するために行われ、したがって、できるだけ多くの血液を除去することをお勧めします。PBSでの化水に続いて、組織を含むチューブに300マイクロリットルの溶菌バッファーを加える。氷浴にチューブを保ちながら、プローブ超音波処理器を使用して組織をライゼします。ビーズビーターを使用して組織を均質化し、組織を完全に分解します。チューブの内容物を摂氏4度で15分間15分間遠心分離する。上清を新鮮なチューブに移し、均質に混ぜます。上清の小さなアリコートを取り、標準的なタンパク質アッセイを用いてタンパク質含有量を定量化する。ここでは、ブラッドフォードアッセイを用いたタンパク質推定例を示す。マイクロ遠心分離チューブに50マイクログラムのタンパク質を取り、最終的な濃度が20ミリモルになるようにTCEPを加えることによって内容物を減らします。37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブにヨウ酢酸アセトアミドを添加して還元されたタンパク質をアルキル化し、最終的な濃度が40ミリモルとなる。30分間暗い中でチューブをインキュベートします。今度は、尿素の最終濃度が1モル未満になるように、還元されたアルキル化タンパク質を含むチューブにバッファBを加える。30酵素対タンパク質比に1にトリプシンを加え、一定の揺れで37度で一晩チューブをインキュベートします。消化後、消化したペプチドを真空濃縮器に濃縮する。このステップでは、ペプチドは、再構成して脱塩するか、または将来の使用のためにマイナス80で保存することができます。LC-MS MSにサンプルをロードする前に、脱塩、またはペプチドのクリーンアップが不可欠です。サンプル中の塩やその他の汚染物質は、カラムを詰まらせ、長期的には器具の感度に影響を与える可能性があります。このプロセスは、市販のC18 STAGEチップまたはカラムを使用して実行することができる。ここでは、C18 STAGEチップを用いたペプチド脱塩のワークフローを描いた。脱塩後、真空濃縮器でペプチドを乾燥させます。これらのクリーンペプチドを再構成し、スコープ法を用いて定量化を進める。このために、サンプルの2マイクロリットルをマイクロドロッププレートにロードし、スライドに示すように濃度を計算します。移行リストの準備は、SRM または MRM 実験の重要なステップです。遷移リストには、質量分析計が遷移を監視するために必要なすべての情報が含まれています。これには、前駆体および生成物イオンのm x z値、遷移の衝突エネルギー、装置の極性、およびデータ取得の時間範囲が含まれる。スカイラインを使用して、遷移リストを準備します。UniProtのヒューマンプロテオームファスタファイルを使用してバックグラウンドプロテオームを準備し、ペプチド設定の[背景]タブで選択されていることを確認します。[フィルタ]タブで、最小長を 8、最大長を 25 に設定します。ペプチドに他の変更がない場合は、デフォルト設定を使用し続けます。ペプチドの設定が完了したら、トランジション設定をクリックします。[フィルタ]タブで、[前駆体料金]を 2 と 3 に設定します。イオン料金を 1 に設定し、Ion タイプを y に設定します。製品イオンは、ユーザーの選択に応じて選択することができます。すべてのパラメータをデフォルトのままにします。ここで、選択したターゲットタンパク質の受取 ID を挿入します。これは、[編集]タブをクリックし、[挿入]を選択して、最後にアクセスIDを貼り付ける方法で行うことができます。IDは、バックグラウンドプロテオーム内のタンパク質にマッピングされ、先に設定したペプチドと遷移設定に基づいて作成された遷移リストが作成されます。この遷移リストをエクスポートします。[インストゥルメントタイプ]ドロップダウンオプションをクリックして、適切な計測器が選択されていることを確認します。この場合、器械はサーモアルティスである。未定義の遷移リストの遷移数が多すぎるため、リストごとに 350 回の遷移の制限を保持し、複数のメソッドとしてエクスポートします。バイナリー溶媒システムが使用されます。溶媒Aは1%FA、溶媒Bは80%ACNである。流量を毎分450マイクロリットル、勾配を示すように保ちます。カラムコンパートメント温度を摂氏45度に設定します。列および LC システムの詳細については、テキストを参照してください。TSQ Altis の MS 設定がここに示されていることを確認します。単一の遷移リストをインポートして、新しいメソッドを作成します。四重極1と四重極3の解像度を7に保つことを提案します。必要に応じて、これらをさらに最適化できます。実行の一貫性と結果的にデータ品質を確保するには、次に示すように実行シーケンスを準備します。ブランクのカップルから始めて、ブランク混合物の組成のテキストを参照し、続いて既知の濃度のQC標準光BSAを参照して、機器の日単位応答の変動を監視する。QCはサンプルの直前に行う必要があります。次に、すべてのサンプルを間にブランクで並べて表示します。各サンプルの等量を注入し、1回の注射につき25~1ナノグラムのペプチドを考慮する。洗練されたメソッドを作成するには、最初にサンプル全体に対して未定義のメソッドを実行します。結果をスカイラインにインポートし、各ペプチドを手動で確認します。ペプチドごとに、全てのサンプルにおいて一貫して良好なピークを示す前駆体を1つ選択する。良好なピークを示していない前駆体とペプチドを削除します。.すべてのピークに適切なアポイントトが設定されていることを確認します。右のピークを選択し、各前駆体の下の遷移をさらに細かくするために、ライブラリを使用できます。ライブラリは、現在の実験データのペプチドと遷移と一致するMS-MSスペクトルデータのセットです。DART P値が1近いピークを選択し、ライブラリに一致しないトランジションを削除します。DART P値は、実験ピークとライブラリピークの間でのマッチの良さを示します。最適化の1つまたは2つのラウンドの後、洗練されたリストが準備されます。この絞り込みリストは、個々のサンプルに対して実行できます。洗練されたランをスカイラインにインポートし、ピークに適切にアポイントする。ドキュメント グリッドの各サンプルに注意して注釈を付けるには、[ドキュメントの設定] の下にある [注釈] タブを使用します。グループ比較機能を使用して、実験の条件 1 と条件 2 の比較を作成します。これにより、調整されたP値を持つテーブルが与え、2つのグループ間で値を折り畳みます。私たちの知る限りでは、これは、ヒト脳組織サンプル中のアポリポタンパク質A-1、ビメンチン、ニコチンアミドホスホリボシルトランスファーゼのタンパク質のペプチドを検出するためにMRMを使用した最初の研究です。LC勾配、ドウェル時間、サイクルタイム、衝突エネルギーなどのさまざまなパラメータを最適化すると、MRM実験の成功に大きく影響します。この技術は、異なる臨床状態と疾患を区別する能力を持つバイオマーカーのパターンを開発するために使用できると考えています。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典:Wulf, M., et.al.ニューロメラニン顆粒のプロテオミクスプロファイルのLC-MS / MS分析のためのレーザーマイクロダイセクションベースのプロトコル。J. Vis.

ヒト脳組織から単離されたニューロメラニン顆粒のプロテオミクスプロファイルのLC-MS/MS分析

人間とマウスの脳組織のために尿素/チオ尿素/ SDS緩衝液を使用した一般的なタンパク質抽出プロトコルを可能にする2D-DIGEとミニ2DEのイムノブロット法によるそれに続くキャラクタライゼーションによるタンパク質のINDENTIFICATION。この方法は、人間の生検および実験モデルから、より再現性と信頼性の高い結果を得るために1を可能にします。...

コンセンサス脳由来のタンパク質、2D-DIGEとミニ2DEイムノ両方を使用して、ヒトおよびマウスの脳プロテオーム研究のための抽出プロトコール

このプロトコルは、選択された反応モニタリングを使用して、複雑な生物学的サンプル内の標的タンパク質の絶対定量アッセイを実行する方法を説明しています。これは、マウスマクロファージ走化性シグナル伝達経路のタンパク質を正確に定量するために使用されました。標的ペプチドの選択、アッセイ開発、定性的および定量的アッセイについて詳しく説明します。...

絶対タンパク質定量のための質量分析法を選択反応モニタリング

我々は、高スループット、多重化を説明、およびプロテオミクス脳脊髄液（CSF）の臨床翻訳のための潜在的に開発されたアッセイをターゲットに。テストでは、このようなアポリポタンパク質Eバリアント（E2、E3およびE4）などの神経変性のための潜在的なマーカーおよびリスク要因を、定量、およびそれらの対立遺伝子の発現を測定することができます。...

神経変性のバイオマーカーおよびアポリポタンパク質Eアイソフォームの状態を定量化するために高スループット、多重化およびターゲットプロテオームCSFアッセイ

ここでは、高解像度 (〜 30,000) の MS モノクローナル抗体のスパイク ペプチド水準の定量化のためのペプチド断片の検出続くペプチド前駆体のイオン移動度分離と相まってガスクロマト...

液体クロマトグラフィーによるイオン移動 QTOF 質量分析法によるタンパク質のバイオ医薬品の宿主細胞蛋白質の定量化のための HS MRM アッセイ

正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス...

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

記載されたプロトコルは、ラベルベースとラベルフリー定量の2つのアプローチを用いて、組織サンプルの最適化された定量プロテオミクス分析を提供します。ラベルベースのアプローチは、より正確なタンパク質定量の利点を有する一方で、ラベルフリーアプローチはより費用対効果が高く、コホートの何百ものサンプルを分析するために使用されます。...

組織サンプルの質量分析ベースのショットガンプロテオミクスの包括的ワークフロー

質量分析ベースのプロテオミクス分析によるこの生化学的精製方法は、アミロイド線維コアの堅牢な特性評価を容易にし、アルツハイマー病を予防するための標的の同定を加速させる可能性がある。...

脳からのアミロイド線維コアの生化学的浄化とプロテオミクス特性評価

ここでは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の単離関心領域を用いた質量分析法に基づくプロテオミクス法を確立します。このプロトコールは、アーカイブされたホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の特定の組織領域からのプロテオームを解析するために使用されます。...

選択した組織領域を用いた質量分析ベースのプロテオミクスのための合理化されたアプローチ

このプロトコルは、レーザーキャプチャーマイクロディセプションを用いて、腫瘍血管新生の定量的プロテオミクス解析のために、グリオーマサンプルから高品質な新生血管組織を十分に調製することに成功し、従来の主に血管新生因子に焦点を当てた研究の限界を克服し、グリオーマ血管新生の大規模なプロテオミクスプロファイルを提供しました。...

腫瘍血管新生の定量的プロテオミクス解析のためのヒト膠質腫組織からの新生血管組織の調製

学ぶヒト脳組織を用いたMRM定量的プロテオミクスワークフロー。組織溶解からトリプシン消化、質量分析までの標準化されたプロトコルを解説し、臨床試料からのタンパク質定量とバイオマーカー発見への応用を示します。

ヒト脳組織からのタンパク質の多発反応モニタリングを用いた定量的プロテオミクスワークフロー

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