活性アクチンベースアセンブリの収縮性および変形モードのin vitroでのチューニング:2次元活性ネットワークから液晶滴まで

本研究は、柔らかい生体材料に着目し、形状や組織を調節する根底にある物理的メカニズムや、生体細胞に触発された材料を探ることを目的としています。

生物学的および in vitro モデル システムは本質的に複雑であり、多くの落とし穴があり、サンプル前処理はその再現性にとって重要です。このプロトコルは、これらのシステムの再現性を向上させるように設計されています。

これらの結果は、物理的な力と生体材料のメカニズムを検出、特徴付け、機能を理解する道を開きます。これは、さまざまな生体高分子や細胞小器官に一般化できる可能性があります。

[ナレーター]まず、マイクロ遠心分離管に5マイクロリットルの10XFバッファーを加えてロードするサンプルを準備し、残りの成分を添加した後、最終サンプル量が50マイクロリットルになるように脱イオン蒸留水を一定量加えます。1マイクロリットルの25%ベータメルカプトエタノール、1マイクロリットルの225ミリグラム/ミリリットルグルコース、1マイクロリットルのグルコースオキシダーゼの混合物、および85,000単位/ミリリットルの触媒を溶液にピペットで入れます。次に、1マイクロリットルの25ミリモルATPと10マイクロリットルの2%、15センチポアズメチルセルロースを加え、ピペッティングで完全に混合します。アクチン重合を開始するには、非標識アクチンと標識アクチンを混合し、アクチン混合物を調製したF緩衝液に加えます。溶液を上下にピペットで移動させ、適切な混合を確保します。アクチンをマイクロ遠心分離管内で室温で重合させます。次に、フローセルを準備するには、顕微鏡スライドの幅を横切って互いに平行に2枚の両面テープを置き、フローセルチャネルの境界を形成します。カバースリップをテープチャネルの上に置き、顕微鏡スライドに対して垂直になるようにします。両面テープと接触しているカバースリップの部分を押し下げて、良好な密閉性を形成し、エアポケットを排除します。カミソリの刃を使用して、顕微鏡のスライドから余分なテープを切り取り、スリップをカバーして、目に見えるテープだけがサンプルチャネル内にあるようにします。2つのデプレーナーサンプル用のシリンダーサンプルチャンバーを準備するには、まずカバースリップをエタノール、水、およびエタノールですすいでください。ろ過した空気で乾燥させます。5分間のエポキシの薄層を塗布して、ガラスクローニングシリンダーをカバースリップに接着します。3.5マイクロリットルのオイル界面活性剤溶液を透明または明るい色のマイクロ遠心チューブに加えます。混合せずに、5マイクロリットルのアクチン溶液をオイル界面活性剤層の上部にピペットで入れます。チューブを閉じます。マイクロ遠心分離管の上部を持ち、下端をフリックして目に見えるエマルジョンを含む最初の泡を形成し、均一なマイクロエマルジョンが形成されるまでフリックを続けます。フローセルをロードする前に、少量の5分間のエポキシを混合します。フローセルをロードするには、1〜3マイクロリットルのオイル界面活性剤溶液をフローセルのサンプルチャネルにピペットで入れて、チャネルを濡らす小さなプラグを作成します。サンプルを追加する前に、フローセルを傾けて、オイル界面活性剤メニスカスの後退によって形成されるエアギャップを取り除きます。すぐにサンプル溶液エマルジョン懸濁液をフローセルの入口にピペットで入れ、チャネルを満たします。フローセルチャネルの両側を5分間のエポキシで密閉します。非エマルジョンサンプル用のシリンダーサンプルチャンバーにロードするには、5マイクロリットルのオイル界面活性剤溶液をガラスシリンダーチャンバーの底にピペットで入れます。カバースリップを傾けてゆっくりと回転させ、表面と下部シリンダーを界面活性剤溶液でコーティングします。ピペットを使用して余分な油界面活性剤溶液を除去し、油の完全な蒸発を防ぎながら薄い層を作ります。すぐにサンプル溶液をチャンバーに加えます。蒸発と流れを防ぐために、チャンバーをポリテトラフルオロエチレンまたはPTFEテープの小片で覆います。サンプルを顕微鏡ステージに取り付けます。20倍、40倍、60倍、または100倍の対物レンズを使用してアクチンのタイムラプスイメージングを開始し、油浸または水浸漬で、高解像度イメージングに十分な高い開口数を確保します。サンプルチャンバー内で重合する場合は、約30分間、またはフィラメントの伸長や動きが目に見えるまで重合させます。架橋剤をサンプルに加え、総体積の約半分をサンプルにゆっくりとピペッティングして、ミオシンをプレ重合フィラメントとして添加します。最後に、タイムラプスイメージングを開始します。もつれたアクチンネットワークの代表的な共焦点蛍光画像をここに示します。もつれたアクチンネットワークは、表面全体に均一に分布しています。 この画像の明るい斑点はフィラメントの重なりを表し、暗い領域はアクチンの存在が最小限であることを示します。熱変動は、局所的な強度の変化とアクチンフィラメントの目に見える曲げにつながります。ミオシンIIの添加は、アクチンネットワークの曲げと再編成を引き起こし、ミオシン点点の目に見える蓄積を長時間引き起こします。ネットワーク収縮は、ミオシン濃度とATP濃度に依存します。架橋アクチンネットワークでは、ミオシン誘発収縮は、もつれネットワークと比較して、より長い長さスケールで協調運動につながります。