発育中および成熟 シロイヌナズ ナ種子中の胚乳細胞層の顕微鏡分析のための無傷組織の調製

私たちの研究範囲の1つは種子科学です。胚乳が種子の発芽にどのように寄与するかという疑問に答えることを目指しています。種子成長阻害アッセイと呼ばれる in vitro アッセイにより、種子の発芽における胚乳の生理学的重要性が明らかになりました。シロイヌナズナの種子は非常に小さく、胚乳細胞層の位置は細胞である精巣の下にあります。化学的に固定せずに胚乳サンプルを調製することは困難です。胚乳の分析のこれまでの分析では、化学的に固定されたサンプルを使用していたため、生物タンパク質の動きを観察することができませんでした。私たちのプロトコルは、胚乳細胞のダイナミクスの5つの細胞イメージングを可能にします。私たちのプロトコルは、標準的な実験装置を使用して実行でき、細胞間イベントと分子のメカニズム、および通常の胚乳機能についてのより深い洞察を可能にします。

[ナレーター]まず、開花期まで土壌またはロックウールでシロイヌナズナの植物を育てます。開花後0日を示すために、完全に開いた花を色付きの糸でマークします。次の手順のために、開花後12〜16日の間にシリケを選択します。細いはさみを使用して、小花柄でマークされた発達中の繊毛を切り取り、1.5ミリリットルのチューブに集めます。乾燥を防ぐために解剖用の湿ったろ紙を準備し、サンプルを実体顕微鏡下に置きます。2つの鉗子を使用し、1つは保持用の太い先端、もう1つは引き裂くための鋭い先端があります。レプラムからバルブを分割します。次に、先端を閉じた鉗子を使用して、損傷しないように、角膜から発育中の種子をそっと持ち上げます。27ゲージの注射針を用いる場合、胚を取り巻く精巣と胚乳に約0.1〜0.2ミリメートルの大きさの瘢痕を作ります。種子を押しつぶさずに鉗子で保持し、子葉とラジカルの接合部に傷跡を作ります。次に、鉗子で種子をつまんで胚を押し出し、種子の封筒をつぶさないように注意し、丸い形を維持します。傷跡の空の種子封筒に注射針を挿入し、内側から外側に突き刺します。次に、針を所定の位置に保ち、先端を閉じた鉗子を使用して睾丸の表面を引っ掻きます。次に、種子の封筒の片側を切り取って開きます。次に、鋭利な先端鉗子を使用して、種子封筒をシートに開きます。単離されたサンプルは、胚乳と睾丸で構成される二重層シートになるはずです。乾燥したシロイヌナズナの種子を1.5ミリリットルのチューブに入れ、1ミリリットルの二重蒸留水を加えます。種子を室温で少なくとも40分間吸収しておきます。解剖用の実体顕微鏡のステージに湿ったろ紙を準備し、1000マイクロリットルのマイクロピペットを使用して、吸収した種子を湿ったろ紙に移します。次に、サンプルを実体顕微鏡下に置きます。注射針を使用して、胚を取り囲む精巣と胚乳に約0.2ミリメートルの大きさの傷跡を作ります。種子を押しつぶさずに鉗子で保持し、子葉とラジカルの接合部を傷跡のターゲットにします。鉗子で種子をつまんだ後、胚を押し出します。空の種子封筒をつぶさないようにし、丸い形を保ちます。注射針を使用して、空の種子封筒の上下の両方を切断し、円筒形に成形します。次に、円筒形の種子封筒を中心軸に沿って切断し、2つに分割します。結果は、胚乳と精巣で作られた二重層シートであるはずです。単離した胚乳サンプルをスライドガラス上のシートとして置き、水中に取り付けます。最後に、胚乳層がカバースリップに向かって上を向くように、サンプルの上にカバースリップをそっと置きます。顕微鏡でサンプルを観察する前に、マニキュアまたはグリースを使用してカバースリップの端を密閉し、乾燥を防ぎます。確立された調製プロトコルを使用して、開花後14日で収穫された種子から多数の胚乳細胞とその細胞内構造を正常に視覚化しました。胚乳細胞の核内で写真体が検出され、白色光下でPHYB-GFPが発現し、その存在と核局在を確認しました。胚乳細胞は、遠赤色光と赤色光を交互に露光すると可逆的な光体形成を示し、解剖後4.5時間までPHYBの光可逆性と生物学的活性を確認しました。3時間の種子阻害後の無傷胚乳細胞のミトコンドリアの蛍光タイムラプスイメージングを行い、ミトコンドリアの動きを検出しました。種子阻害の1日後に胚乳細胞でより動的なミトコンドリア運動性が観察され、時間の経過とともに活性が増加していることが示されました。