病変マウス網膜におけるミクログリアの動態およびシナプスとの相互作用のライブイメージングおよび特徴付け

当研究室の研究範囲は、発生過程におけるシナプス再構築における緑内障およびミクログリアの根本的なメカニズムを研究することです。現在の実験的課題は、ミクログリアが網膜神経節細胞シナプスを積極的に分解しているのか、それとも単に受動的に破片を除去しているのかという点にあります。まずマウス網膜をフィルターペーパーに置き、実験室用のワイプで乾燥させます。

網膜を逆さまにしてMatTekのペトリ皿に置きます。網膜を金属ビーズかリングで押さえます。次に、人工脳脊髄液を3〜5滴加えます。

サンプルを回転ディスク共焦点顕微鏡の下に置き、網膜をプレビューするために設定を調整します。Z軸に沿って、10〜20マイクロメートルの総深さで、ステップサイズ0.3マイクロメートルで画像を収集します。フレーム間の間隔を20〜30秒に保ち、信頼性の高いセルトラッキングを可能にします。

ミクログリアの表面レンダリングを行うには、ファイルコンバーターソフトウェアを使ってタイムラプスファイルをIMS形式に変換します。以前に取得した画像の特性に基づいてボクセルサイズを入力します。解析ソフトウェアの分野では、observeフォルダをクリックして変換済みファイルを開き、画像が3Dビューであることを確認しましょう。

個々のマイクログリアを検出するには、オブジェクトのツールバーで「新しい表面を追加」アイコンをクリックしてください。興味のある領域のみをセグメント選択し、時間経過の表面を追跡し、表面を分類し、アルゴリズム設定でオブジェクト間統計を行います。その後、青い再生ボタンをクリックして進めます。

サーフェスレンダリングのチャンネルを選択してください。オプションで、表面作成を滑らかにし、表面の詳細を入力するためにsmoothを有効にしてください。閾値設定では、セル検出のために機械学習のセグメントを選択します。

トレーニングデータでは、背景と前景のペイントブラシツールを使いましょう。希望するペイントブラシを選択して、Shiftと左クリックで筆のストロークを描きます。補間表示が有効であることを確認し、その後「train」を選択して予測します。

中央の黄色いポインターを使ってZ軸を移動します。X、Y、Zの平面をまたいで、いくつかの時間枠にわたって複数回のストロークを描きます。1回のエントリーにつき3〜5回の短いストロークを使い、正確な表面を作るまで繰り返し調整してください。

黄色い長方形を使って、トレーニング表示と実際に作成された表面を切り替えて最終チェックします。また、時間経過を通じて表面が細胞の形態と一致しているかも確認してください。終わったら、分割オブジェクトの選択を外します。

ボクセルヒストグラムのしきい値を調整して、プライマリサーフェスの一部でない小さく繋がっていないオブジェクトを除去します。その後、はさみツールを使って表面を手動で編集し、余計なオブジェクトや切断面を除去します。必要に応じて、オブジェクトに対して許容されるギャップの閾値を設定し、移動セルのトラッキングアルゴリズムを選択します。

メインサーフェスに紐づかないオブジェクトをフィルターでトラッキングします。作業が終わったら、動くセルの表示を透明なプロファイルに設定し、次のステップのための句点を視覚化します。個々のPSD95の句点を検出するには、オブジェクトツールバーの青い表面アイコンをクリックしてください。

その後、時間経過でトラックスポットを選択し、ポイントを分類し、オブジェクトとオブジェクトの統計を合わせて再生ボタンを押します。シナプスマーカーのソースチャネルを選択します。スライサーや他のチャンネルをオフにしてPSD95だけを表示してください。

コントロールボタンとポインター選択ツールを使って、プンクタのXY直径を推定してください。フレーム全体に残る明るい点をいくつか選び、背景の減算をオフにしましょう。次にスポット品質に基づくフィルターを追加します。

すべての時間枠にわたる正確なPSD95の句点を含めるようにヒストグラムを調整してください。誤検知の箇所は編集で削除してください。キューブカーソルとサークルカーソルの間を切り替えて、1〜2フレームしか残らないスポットを削除してください。

希望すれば、許容される隙間の閾値を設定し、シナプススポットの追跡アルゴリズムを選択します。実際の句点に紐づいていないスポットトラックをヒストグラムしきい値でフィルターし、小さなオブジェクトトラックを除外します。表面までの最短距離を用いて分類を定義します。

0マイクロメートル未満の点点のようにセットを包み込み、表面から約0〜0.5マイクロメートルの距離で接触し、0.5以上で接触していない位置で設定します。上記の分類を使ってイベントにラベルを割り当てます。表面や斑点がミクログリアと点を適切に表現したら、統計タブ内のすべての統計をエクスポートします。

ミクログリアは、レーザー誘発性眼圧亢進後に対照群に比べて突起置位の長さが増加しました。マイクログリア速度はレーザー治療眼で対照群よりも有意に高かった。レーザー治療後、ミクログリアとPSD95点との接触イベント数が増加しました。

タイムラプス記録により、レーザー処理された網膜は対照網膜と比べてより優れた微膠細胞運動性とPSD95点との相互作用が増加していることが示されました。私たちの重要な発見は、マウスの一時的な眼圧上昇後にミクログリア数、複雑さ、運動性、シナプス共局在が増加していることを示しています。当プロトコルは体外画像検査を提供しており、白内障や角膜の不透明度問題を回避し、より迅速な実験と全体的なスループット向上を実現します。

本研究の発見は、マイクログリア-ニューロンの相互作用、細胞コミュニケーション、動態をトランスジェニック蛍光線を用いて可視化し、高解像度のタイムラプスイメージングを可能にすることで研究を前進させます。