Name: 生理学的免疫原性樹状細胞を生成するための新規プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 学ぶ、生理学的免疫原性樹状細胞（PhDC）を生成する新規プロトコル。血小板シグナル伝達を利用した単球から樹状細胞への変換法により、抗腫瘍免疫応答を誘導する革新的ながん免疫療法アプローチを理解できます。

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この作業は、NIH-NCI 胞子付与 1 P50 CA121974 (r. Edelson、m. Girardi) によって支持されました。NIH がんセンター支援 3 P30 CA16359-28S1 (r. Edelson, m. Girardi) をサポートしています。ハワード・ヒューズ医学研究所トレーニングフェローシップ (Vassall);NY 心財団 (r. Edelson、a. ベンチュラ、Vassall、h. Ezaldein) があります。R01 CA196660-01 からボーゼンベルクに部分的なサポートが提供されました。
著者は、彼のメンタリング、指導、そして実験的な洞察力についてロバート・ Tigelaar 博士に感謝しています。我々は、フラウンホーファー IBMT、特にトルステン・・ノール博士の同僚に感謝し、ECP に相当する TI チャンバーの開発と提供を行いました。ニコラス Theodosakis は、YUMM 実験の初期段階を親切に助けました。私たちは、ボランティアの献血、インガー・クリステンセン、および彼女の専門スタッフであるイェール ECP 治療センターで、自発的な献血支援に感謝しています。ウェンデル・ヤーブローかとナタリア Issaeva 博士は、SCC61 と SCC61 ・ E6/7 細胞株を優しく共有してくれました。プロジェクトの技術支援については、ジュリア・ルイス博士に FACS プロトコルのアドバイスを、メネット、g. Tokmoulina、c. コートエール FACS コアで感謝します。TI のプレート内の細胞の映画の画像は、フェリックス・リベラ-モリーナの助けを借りて取得されました, 博士, 細胞生物学とイェール映画イメージングセンターの学部, イェール医科大学.映画の制作は、イェール医科大学コミュニケーションズ事務所シニアビデオプロデューサーのアンドリュー・オズボーンによって監修されました。

<ol><li>Edelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+cutaneous+T-cell+lymphoma+by+extracorporeal+photochemotherapy.+Preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results.</a> The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).</li>
<li>Berger, C. L., Wang, N., Christensen, I., Longley, J., Heald, P., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+class+I-associated+tumor-specific+cutaneous+T-cell+lymphoma+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The immune response to class I-associated tumor-specific cutaneous T-cell lymphoma antigens.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 107 (3), 392-397 (1996).</li>
<li>Scarisbrick, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicentre+UK+study+of+GVHD+following+DLI%3A+rates+of+GVHD+are+high+but+mortality+from+GVHD+is+infrequent%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">A multicentre UK study of GVHD following DLI: rates of GVHD are high but mortality from GVHD is infrequent.</a> Bone Marrow Transplantation. 50 (1), 62-67 (2015).</li>
<li>Barten, M. J., Dieterlen, M. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+photopheresis+after+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal photopheresis after heart transplantation.</a> Immunotherapy. 6 (8), 927-944 (2014).</li>
<li>Heald, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+erythrodermic+cutaneous+T-cell+lymphoma+with+extracorporeal+photochemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Treatment of erythrodermic cutaneous T-cell lymphoma with extracorporeal photochemotherapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 27 (3), 427-433 (1992).</li>
<li>Ratcliffe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Institutes+of+Health+State+of+the+Science+Symposium+in+Therapeutic+Apheresis%3A+Scientific+Opportunities+in+Extracorporeal+Photopheresis%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+Medicine+Reviews%22%5BJournal%5D)">National Institutes of Health State of the Science Symposium in Therapeutic Apheresis: Scientific Opportunities in Extracorporeal Photopheresis.</a> Transfusion Medicine Reviews. 29 (1), 62-70 (2015).</li>
<li>Edelson, R., Wu, Y., Schneiderman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((American+council+on+ECP+%28ACE%29%3A+Why+now%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">American council on ECP (ACE): Why now?</a> Journal of Clinical Apheresis. , (2018).</li>
<li>Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+extracorporeal+photochemotherapy%3A+Efficient+induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+and+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into extracorporeal photochemotherapy: Efficient induction of monocyte-to-dendritic cell maturation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 322-329 (2014).</li>
<li>Gasparro, F. P., Dall’Amico, R., Goldminz, D., Simmons, E., Weingold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+aspects+of+extracorporeal+photochemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Yale+journal+of+biology+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular aspects of extracorporeal photochemotherapy.</a> The Yale journal of biology and medicine. 62 (6), 579(1989).</li>
<li>Bevilacqua, P. M., Edelson, R. L., Gasparro, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromotography+analysis+of+8-methoxypsoralen+monoadducts+and+crosslinks+in+lymphocytes+and+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromotography analysis of 8-methoxypsoralen monoadducts and crosslinks in lymphocytes and keratinocytes.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 97 (1), 151-155 (1991).</li>
<li>Ventura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+Photochemotherapy+Drives+Monocyte-to-Dendritic+Cell+Maturation+to+Induce+Anticancer+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal Photochemotherapy Drives Monocyte-to-Dendritic Cell Maturation to Induce Anticancer Immunity.</a> Cancer Research. 78 (14), 4045-4058 (2018).</li>
<li>Perez, M., Lobo, F. M., Yamane, Y., John, L., Berger, C. L., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+antiskin+allograft+immunity+induced+by+infusions+with+photoinactivated+effector+T+lymphocytes+%28PET+cells%29.+Is+in+vivo+cell+transferrable%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inhibition of antiskin allograft immunity induced by infusions with photoinactivated effector T lymphocytes (PET cells). Is in vivo cell transferrable?</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 636 (1), 95-112 (1991).</li>
<li>Girardi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transimmunization+for+cutaneous+T+cell+lymphoma%3A+A+phase+I+study%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Transimmunization for cutaneous T cell lymphoma: A phase I study.</a> Leukemia & Lymphoma. 47 (8), 1495-1503 (2006).</li>
<li>Durazzo, T. S., Tigelaar, R. E., Filler, R., Hayday, A., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation+by+extracorporeal+photochemotherapy%3A+Initiation+via+direct+platelet+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+and+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">Induction of monocyte-to-dendritic cell maturation by extracorporeal photochemotherapy: Initiation via direct platelet signaling.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 370-378 (2014).</li>
<li>Gonzalez, A. L., Berger, C. L., Remington, J., Girardi, M., Tigelaar, R. E., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-driven+monocyte+to+dendritic+cell+conversion+in+modified+extracorporeal+photochemotherapy%3A+ECP+activation+of+monocytes+by+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Integrin-driven monocyte to dendritic cell conversion in modified extracorporeal photochemotherapy: ECP activation of monocytes by fibronectin.</a> Clinical & Experimental Immunology. 175 (3), 449-457 (2014).</li>
<li>Kibbi, N., Sobolev, O., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+anti-tumor+CD8+T+cell+responses+by+experimental+ECP-induced+human+dendritic+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+and+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">Induction of anti-tumor CD8 T cell responses by experimental ECP-induced human dendritic antigen presenting cells.</a> Transfusion and Apheresis Science. 55 (1), 146-152 (2016).</li>
<li>Maeda, A., Schwarz, A., Bullinger, A., Morita, A., Peritt, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Extracorporeal+Photopheresis+Inhibits+the+Sensitization+and+Effector+Phases+of+Contact+Hypersensitivity+via+Two+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Generation+of+IL-10+and+Induction+of+Regulatory+T+Cells.+The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Experimental Extracorporeal Photopheresis Inhibits the Sensitization and Effector Phases of Contact Hypersensitivity via Two Mechanisms.</a> Generation of IL-10 and Induction of Regulatory T Cells. The Journal of Immunology. 181 (9), 5956-5962 (2008).</li>
<li>Meeth, K., Wang, J., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+YUMM+lines%3A+a+series+of+congenic+mouse+melanoma+cell+lines+with+defined+genetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. , (2016).</li>
<li>Gubanova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+SMG-1+in+HPV-Positive+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Due+to+Promoter+Hypermethylation+Correlates+with+Improved+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Downregulation of SMG-1 in HPV-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Due to Promoter Hypermethylation Correlates with Improved Survival.</a> Clinical Cancer Research. 18 (5), 1257-1267 (2012).</li>
<li>Berger, C. L., Perez, M., Laroche, L., Edelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Autoimmune+Disease+in+a+Murine+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+Induced+by+Exposure+to+Syngeneic+Photoinactivated+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Autoimmune Disease in a Murine Model of Systemic Lupus Erythematosus Induced by Exposure to Syngeneic Photoinactivated Lymphocytes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 94 (1), 52-57 (1990).</li>
<li>Spisek, R., Gasova, Z., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+state+of+dendritic+cells+during+the+extracorporeal+photopheresis+and+its+relevance+for+the+treatment+of+chronic+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Maturation state of dendritic cells during the extracorporeal photopheresis and its relevance for the treatment of chronic graft-versus-host disease.</a> Transfusion. 46 (1), 55-65 (2006).</li>
<li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+maturationally+synchronized+human+dendritic+cells%3A+contribution+to+the+clinical+efficacy+of+extracorporeal+photochemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy.</a> Blood. 116 (23), 4838-4847 (2010).</li>
</ol>

エール大学は、エールのスタートアップ企業である Transimmune AG に認可されたリチャード・ Edelson 教授の樹状細胞研究に由来する特許を保有しています。リチャード・ Edelson とマイケル・ Girardi は Transimmune AG の科学コンサルタントであり、オルガソボレフは Transimmune AG の従業員です。Transimmune AG には、現在市販されている製品はありませんが、共同作業により、本稿で使用している Transimmune プレートを製造しています。これらの3人の著者は、将来的にこれらの発見の商業化から利益を得ることができる可能性があります。

初めて上述した小型化されたデバイスおよびプロトコルは、マウス実験システムにおける ECP のメカニズムの効率的な実験室調査を可能にし、そして小さなヒト血液サンプル中である。これは偉大な進歩です。例えば、それは我々が最初にマウスモデル11における固形腫瘍に対する transimmunization の有効性を実証することを可能にし、ヒト腫瘍学における同様の適用の将来の可能性を開く。
ここで説明する transimmunization デバイスとメソッドの開発に先立って、ECP のすべての側面を完全に調査することは不可能でした。マウスモデルにおいて、治療の8モップA態様はペトリ皿12,20内の細胞を処理することによって幾分複製することができたが、その方法をプレート通路に統合する能力はなかったが、これはECP の生理学的 DC 活性化14にとって極めて重要な動的血小板相互作用を提供する。人間の研究では、あるいは、フロー成分が完全に存在していたが、8モップAに選択的に特定の細胞成分を暴露する能力、またはそれからそれらを保護する機能は、21、22を欠いていた。これにより、ECP メカニズムの完全な理解と、イミュニティまたはトレランスの最適化が妨げられました。さらに、臨床 ECP 装置で作業するために必要な血液量が多く、科学的な調査を妨げる。ここで初めて説明した、小型化された ECP デバイスとプロトコルにより、効率的で、完全に柔軟性があり、チューニング可能なラボ ECP モデルが実現します。さらに、TI の版は顕微鏡によって版内の細胞の相互作用の実時間視覚化そして監視を可能にする。
インビボおよび ex インビボシステムの両方を使用してプロトコルの成功のために、処理された PBMC が機能 DCs に活性化することができる単球を含むことが重要である。この活性化が進行するためには、PBMC の画分が健康で生理学的な数、活性化可能なの血小板を含んでいること、および TI プレートの通過プロトコルが密接に従っていることを確実にすることも必要である。新たに活性化された DCs を特定の反応性に向けるためには、抗原を提供する必要があります。我々は、抗がん免疫に対する抗原送達の最も効率的な方法は、抗原含有8モップA露出腫瘍細胞を用いた新たに活性化された DCs の一晩の共インキュベーションであることを見出した。これは、Dc がそれらを選択することを可能にすることによって、腫瘍抗原の事前の知識を必要とせずに免疫原性抗がん反応を作成できるという追加の利点を有する。しかし、抗原が知られている場合には、遊離ペプチドを共インキュベーション中の抗原として使用すると、ex vivo システムでいくつかの成功がありました。免疫原性の適用のために、DCs 自身は露出の 8 モップから保護されるべきである。最後に、インビボ実験において、抗腫瘍免疫が可能である動物モデルで働くことが重要である。Transimmunization は、自然と適応免疫応答を開始するために体内で動作する活性化された、抗原特異的 Dc を作成することによって動作します。治療されたマウスにおける NK、CD4、または CD8 T 細胞の障害活動または欠如は、プロトコルの有効性5,11に影響を与える。
ここで説明するプロトコルは、マウス固体同系の腫瘍モデル用に最適化された原理証明ですが、多くの機会を明らかにしています。腫瘍学における ECP のメカニズムは単に解明されているだけであり、理解を改善する余地はまだまだある。より広義には、生理学的に活性化されたマウスおよびヒト DCs を生成し、抗原特異的免疫の方に選択的に誘導する能力は、癌を超えた多くの潜在的な用途を有する。同様のことを行うことができるが、その代わりに、ECP 自体の tolerizing の有効性によって示唆されるように、DCs を抗原特異的な耐性の方に向けることで、広範囲にわたる医学的影響もあります。この方法では、我々はツールを提供し、生理学的な DC 療法に興味を持っている人のための研究の生産性の道を開くことを願っています。

体外光化学療法 (ECP) は、世界中の大学のセンターで広く運用されている確立免疫療法です。その使用は、独自の選択性、安全性、および ECP 療法の双方向の有効性によって駆動されています, ECP は、それがパートナーに見える生理学的免疫システム自体と共有する形質.ECP は、皮膚 T 細胞リンパ腫 (CTCL)1,2の悪性細胞に対して選択的に免疫し、移植、自己免疫、移植片対宿主病 (GvHD) の標的となる抗原に選択的に tolerizing する。3,4. ECP の免疫原性は、CTCL5の無傷の CD8 T 細胞コンパートメントに対する依存性によって強調されているが、特異性は ecp の非常に有利な有害反応プロファイルによって反映するのに対し、移植ではオフターゲット免疫抑制がないGvHD の設定は、非病原性 T 細胞クローンが悪性 T 細胞と共に失われる可能性がある CTCL において日和見感染感受性を増加させない。
ECP の臨床的重要性を考慮すると、そのメカニズムをよりよく理解することで、ECP による治療の範囲をより広い範囲のがんや免疫疾患に拡大し、国際的な関心を刺激しているという希望があります。2つの全国的に認可されたワークショップ、国立衛生研究所 (NIH) の最先端のシンポジウム6とアフェレーシスコンセンサス会議7のためのアメリカの社会は、加速することを目的として、ECP の抗癌性および tolerogenic 効果に対する主要な細胞貢献者の識別。
現在までに、ECP のメカニズムに対処しようとしている数多くのレポートにもかかわらず、2つの主要な障害が科学的進歩を妨げている。まず、実験室の設定での ECP メカニズムの調査は、ECP のセルラーおよびインビボ効果を完全に反映し、動物モデルに適用可能なミニチュア ECP デバイスの欠如によって制限されていました。第2に、臨床現場での ECP サンプルの詳細なラボ分析は、治療センターへのアクセスを必要とする ECP によって処理された患者の免疫細胞の利用が限定的であり、さらにそのタイミング患者の輸液、および reinfused 白血球の妥協のないセットのための倫理的な必要性。
ECP 研究の進行を阻害する障害を解決するために、私たちはセラピーの重要な要素を最も忠実に再現する小型 ECP 装置の開発に向けて準備をしました。標準 ECP 治療では、1 mm 厚の紫外光 (UVA) 透明のプラスチックプレート6,8を通して、患者の leukapheresis に富む白血球の通過を伴う。プレートにおいて、白血球は、methoxypsoralen (8-モップ) に曝露され、UVA 曝露時に一過性に反応性の形態 (8-モップa) に変換された活性化可能な剤であり、その二価を介した DNA 架橋が可能で、ピリミジン塩基上姉妹 DNA 鎖9,10処理された、8-モップA 処理した白血球を回収し、患者に静脈内に戻します。
ECP 自体は双方向の治療であるため、移植、自己免疫、および GvHD の設定において、がんや tolerizing で免疫化することで、モデル ECP の予防接種モード「transimmunization」と tolerogenic モード「transtolerization」と名付けられました。まず、transimmunization モダリティに焦点を当てました。最近報告された、スケーラブルなマウス・ツー・マン ECP 装置の小型化、transimmunization (TI) チャンバまたはプレート、および対応するプロトコルは、がん設定11におけるヒト ECP デバイスのセルラーおよび in vivo 効果の両方を再現する。
Transimmunization を可能な限り臨床的に関連性のあるものにするために、我々は皮下注射された同系マウス腫瘍が触知可能になった後に免疫療法を開始し、確立された癌におけるプロトコールの有効性を試験する。CTCL の ECP と同様に、黒色腫の YUMM 1.7 モデルの原理証明 transimmunization プロトコルは、腫瘍を持つ動物から末梢血単核細胞 (PBMC) を使用します。細胞は、流動下の TI 板を通過する。ミニチュア室での細胞の8モップ治療が可能であるが、それを別々に行うことが好ましく、所望の細胞型のみが8モップAに暴露されることを確実にする。初期の研究では、ECP の tolerogenic 効果は、8-モップa損傷を受けた抗原提示細胞12によって媒介され、免疫作用は標的腫瘍細胞11の8モップの損傷を必要とすることを示している。Transimmunization プロトコルでは、腫瘍細胞または免疫細胞のいずれかを、必要に応じて8モップAに選択的に曝露することができる。8モップA損傷腫瘍細胞および ECP 誘導樹状細胞 (DC) 間の接触時間を最大化することが臨床 ECP13の免疫治療能力を著しく増強することが示されているので、我々は一晩私たちのプロトコルへの共インキュベーションステップ。一晩インキュベートした後、処理された細胞を、腫瘍担持する動物に戻す。
このシステムは、確実に腫瘍の成長を減少させ、確立した同系の腫瘍11を有するマウスにおいて特異的な抗腫瘍免疫を開始し、ECP の臨床的抗腫瘍有効性のメカニズムを分析することを可能にした。いくつかの研究では、ECP 免疫が TI プレート14,15で ex vivo 血小板活性化によって開始されることを実証しました。活性化された血小板は、その後、単球対樹状細胞の成熟14に信号を出し、生理学的 DCs の生産に至る。新たに形成された単球由来 Dc は、8-モップA損傷腫瘍細胞から内在化抗原を架橋し、抗原特異的 T 細胞応答16を活性化することができる。提案されているように、以前12,17, しかし、初期の DCs の8モップA誘発ダメージは、対抗することができるか、または抗腫瘍効果を逆転することができます11, ECP 許容範囲への機械的なリンクを提供します.
TI プレートはまた、ヒト PBMC からの生理学的に活性化された DCs を製造するために使用される。マウスの研究と同様に、ヒトの TI 由来 Dc は、その生成のための血小板の存在下での表現型に依存しており、臨床 ECP プレートで生成されたこれらと同一であるように見え、かつ効率的に処理することが可能であり、ヒト T 細胞の活性化のためのヒト腫瘍抗原11,16をクロス提示する。
ECP 免疫療法のメカニズムを明らかにするにあたって、我々は、所望の抗原特異性の生理学的マウスおよびヒト樹状細胞を迅速に生成するための方法を明らかにし、それを機能的に変調することができる。革新的な TI デバイスとプロトコルは、ECP 研究と治療およびがん免疫療法の分野において、より広範に、そして免疫化または機能的な樹状細胞に関心のある他の分野において、非常に重要な潜在的重要性を持っています。tolerizing モダリティ。この文書が、このような研究分野に関心を持つ人々に必要なツールを提供することを願っています。

<table><tbody><tr><td>8-MOP (UVADEX 20ug/mL、10 mL)</td><td>Therakos、Inc</td><td>Rxのみ、NDC No. 64067-0216-01</td><td>プロトコルのステップ3および8-細胞ABのマウスおよび人間の8-MOP/UVAの処置</td></tr><tr><td>ABの血清</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>14-498E</td><td>プロトコルのステップ8.5 -人間のPBMC</td></tr><tr><td>ACKの赤血球の溶解の緩衝液</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>10-548E</td>の一晩の培養 - <td>マウスPBMCの準備</td></tr><tr><td>アクティブ</td>清掃<td>VetEquip</td><td>901820</td>プロトコルステップ1および7を備えた麻酔卓上V1システム-<td>マウスsc腫瘍の導入とTI投与</td></tr>ラボ<tr><td>で自</td><td>家マウス血漿</td>を準備しますn<td>/a</td><td>プロトコルステップ2.4ごとに準備し、&nbsp; 7.1で使用します-マウスTI治療投与</td></tr>ラボ<tr>で<td>自家マウス血清</td><td>を準備し</td><td>ますn / a</td><td>プロトコルのステップ5に従って準備し、ステップ6.1で使用-マウスPBMC</td></tr><tr><td>C57Bl/6Jマウス</td>の一晩の培養 <td>ジャクソンラボ</td><td>0000664</td><td>プロトコルステップ1、2、5および7 -マウス腫瘍注射、血液/血清収集、および治療リターン</td></tr><tr><td>頬出血ゴールデンロッドランセット、5ウム</td><td>Medipoint</td><td>9891620</td><td>プロトコルステップ2 -マウスPBMC準備</td></tr><tr><td>クリアRPMI</td><td>Gibco LifeTech</td><td>11835-030</td><td>プロトコルのステップ 6 そして 8 -</td></tr><tr><td></td><td>LifeTech</td><td>11330-032</td> プロトコルの<td>ステップ 1 そして 2 - YUMM1.7 細胞培養</td></tr><tr><td>EasyGrip ペトリ皿、35mm</td><td>ファルコン</td><td>351008</td><td>プロトコルのステップ 5 そして 8 - マウス/ヒト PBMC</td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5mL 円錐管</td>の一晩の培養 <td>DOT 科学</td>的な <td>1700-GMT</td><td>プロトコルのステップ 1-8</td></tr><tr><td>FBS (ウシ胎児血清、熱不活性化)</td> <td>SAFC Biosciences</td><td>12306C-500mL</td><td>プロトコル ステップ 1-4 - YUMM1.7 細胞培養、細胞の 8-MOP/UVA 処理、TI プレート</td></tr><tr><td>Hemavet 950FS 血液学カウンター</td><td>ドリュー サイエンティフィック</td><td>HV950FS</td><td>プロトコル ステップ 8.2 - ヒト血小板数ヘ</td></tr><tr><td>パリン 5,000U/mL</td><td>McKesson パッケージング サービス</td><td>949512</td><td>プロトコル ステップ 2 および 8 - マウスおよびヒト PBMC 準備</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Abbott Laboratories</td><td>5260-04-05</td><td>プロトコルのステップ1および7 - マウスSC腫瘍の導入およびTIの投与</td></tr><tr><td>リンパ球Mリンパ球単離媒体</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL5035</td><td>プロトコルステップ2 - マウスPBMCの準備</td></tr><tr><td></td><td>LifeTech</td><td>11140-050</td><td>プロトコルのステップ1および2 - YUMM1.7細胞培養</td></tr><tr><td>PBS(1x DPBS、(-)Ca+2、(-)Mg+2)</td><td>Gibco by LifeTech</td><td>14190-144</td><td>プロトコルのステップ 1-7</td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td><td>Gibco LifeTech</td><td>15140-122</td><td>プロトコルのステップ 1 および 2 - YUMM1.7 細胞培養</td></tr><tr><td>ポリプロピレン 15mL 円錐管</td><td>ファルコン</td><td>352097</td><td>プロトコルのステップ 1-8</td></tr><tr><td>プログラム可能な 2 チャンネル シリンジ ポンプ</td><td>New Era Pump Systems Inc</td><td>モデル NE-4000</td><td>プロトコルのステップ 4 および 8 - TI プレートの実行</td></tr><tr><td>レトロオービタル注射針、27G x 1/2</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td>プロトコル ステップ 7 - マウス TI 治療投与</td></tr><tr><td>シリンジ、10mL (LUER-LokTip)</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>プロトコル ステップ 4、8 を実行する - TI プレート</td></tr><tr><td>シリンジ、1mL (スリップ チップ)</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td>プロトコル ステップ 1、4、7、8</td></tr><tr><td>TI プレートとチューブ セット</td><td>Transimmune AG</td><td>市販されていません&nbsp;</td><td>R. Edelson教授またはTransimmuneに連絡して、共同でデバイスを入手してください。</td></tr><tr><td>TIプレートランニングプラットフォーム</td><td>Transimmune AG</td><td>は市販されていません&nbsp;</td><td>R. Edelson教授またはTransimmuneに連絡して、共同でデバイスを入手してください。</td></tr><tr><td>ティッシュ培養フラスコ、T75 (75 cm2)</td><td>ファルコン</td><td>353136</td><td>プロトコルのステップ1、2、6および8 - マウスおよび人間の細胞培養</td></tr><tr><td>ティッシュカルチャープレート、12ウェル</td><td>のファルコン</td><td>353043</td><td>プロトコルステップ3および8 -細胞のマウスおよびヒト8-MOP/UVAの処置</td></tr><tr><td>組織培養スクレーパー</td><td>ファルコン</td><td>353085</td><td>プロトコルステップ6および8 - マウス/ヒトPBMC</td></tr><tr><td>トリプシンEDTA 0.25% (1x)</td><td>の一晩の培養LifeTech</td><td>25200-056</td>プロトコル<td>ステップ1および2によるGibco - YUMM1.7細胞培養</td></tr><tr><td>腫瘍注射針、25G x 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td>プロトコルステップ1 - マウス皮下腫瘍導入</td></tr><tr><td>UVA照射器</td><td>ジョンソン・エンド・ジョンソン</td><td>は市販されていません&nbsp;</td><td>この装置は、J&によって特別に開発されました。J R. Edelson教授の研究室。研究室では、いくつかの機械が共同で利用可能です。ご利用については、R. Edelson教授にお問い合わせください。代替のUVA照射器は市販されていますが、当社では試験を行っていません。</td></tr><tr><td>Invitrogen EVOS FL Auto 2 イメージングシステム</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>蛍光イメージング装置</td></tr></tbody></table>

生理学的免疫原性樹状細胞を生成するための新規プロトコル

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

体外光化学療法 (ECP) は、皮膚 T 細胞リンパ腫 (CTCL) のために広く使用されている癌免疫療法であり、世界中の350以上の大学センターで手術を行う。ECP の臨床効果と模範的な安全プロファイルが広範に使用されていますが、研究所の ECP モデルがないこともあり、根本的なメカニズムの解明は依然として課題でした。この障害を克服し、ECP 研究のためのシンプルでユーザーフレンドリーなプラットフォームを作成するために、私たちは、マウスモデルと小さな人間の血液サンプルの両方での作業に適した、臨床 ECP 白血球処理装置のスケールダウンバージョンを開発しました。この装置は、Transimmunization (TI) チャンバ、またはプレートと呼ばれます。一連の画期的な実験において、小型化されたデバイスは、いくつかの同系マウス腫瘍モデルにおいて治療的抗癌免疫を定期的に開始する細胞ワクチンを製造するために用いられた。実験系から個々の因子を除去し、生体内抗腫瘍応答への寄与を把握することにより、ECP による免疫化の鍵となる機械的要因を解明しました。まとめて、我々の結果は、ECP による抗腫瘍効果が樹状細胞 (DC) によって開始され、TI プレート内の血小板との血液単球相互作用により生理的に発生し、そのアポトーシス細胞の腫瘍細胞からの抗原を装填したことを明らかにした。死は、photoactivatable DNA 架橋剤 8-methoxypsoralen および UVA 光 (8 モップA) への暴露によって細かく滴定される。マウスに戻ると、この細胞ワクチンは、特異的かつ譲渡可能な抗腫瘍 T 細胞免疫をもたらす。我々は、TI チャンバがヒトの血液処理にも適していることを確認し、活性化状態および臨床 ECP 室から導出されたプロファイルに完全に匹敵するヒト DCs を生産する。ここで提示されたプロトコルは、マウスおよびヒトにおける ECP 研究、8-モップAでのアポトーシス腫瘍細胞の制御生成、および様々な用途のための生理学的ヒトおよびマウス単球由来の DCs の迅速な生産を目的としている。

我々は最近、マウスツーマンスケーラブルミニチュア ECP デバイス、TI プレート (図 1a) を開発し、対応する治療プロトコルを設計しました。デバイスとプロトコルは、「transimmunization」と呼ばれる、それを免疫化するためのキーセルラーおよび in vivo の機能を再現します。
原理証明ネズミ transimmunization プロトコル11 (図 1b) は、腫瘍担持するマウスからの末梢血単核細胞 (PBMC) の体外 TI プレート通路から、アポトーシス 8-モップ A –露出された腫瘍細胞。特に、TI の部屋は透明であり、標準的な顕微鏡のスライドのフォーマットに一致させるために大きさ、議定書のあらゆるポイントの TI の版内の細胞の相互作用の容易な視覚化を可能にする (ビデオ 1)。TI −プレート活性化免疫細胞を、8モップA露出アポトーシス腫瘍細胞と共に一晩インキュベートし、腫瘍細胞の取り込み、処理、および DCs への腫瘍抗原の伝達を促進する。翌日、共インキュベートされた細胞混合物は、腫瘍担持する動物の血流に戻される。コントロール動物は同一の血液採取手順を経て、腫瘍増殖に lymphodepletion の影響を正常化するが、代わりに PBS 再注入を受ける。全ての動物における腫瘍増殖は、実験を通して監視される。
YUMM 1.7 同系マウス黒色腫モデル18を用いた研究では、transimmunization プロトコルを週2回、3週間にわたって繰り返し、各動物において合計6つの治療を行った (図 1b)。治療は、治療された全ての動物 (&gt; 100) において忍容性を示し、2年間にわたって行われた9回の独立した実験において認められるように、治療動物対対照家畜における YUMM 1.7 腫瘍増殖の減少を一貫して示すものであった (図2a、B)。この結果は、実施された全ての実験にわたる transimmunization および対照動物における累積腫瘍増殖データを示す (図 2a)、並びに1つの実験内の個々の動物に対する代表的な腫瘍成長曲線を、センスを提供するシステムの変動性のことです (図 2b)。
我々は、プロトコルの成功が、処置された PBMC における単球の存在、PBMC 画分における血小板の存在、および TI プレート通過ステップに決定的に依存することを発見した。プレート継代が省略されると、または血小板または単球が PBMC 画分から枯渇した場合に、治療効果が観察されなくなる (図 3a)。この治療はまた、アポトーシス腫瘍細胞の存在を必要とする。免疫細胞または抗原源のいずれかが存在しない場合、または抗原が一致しない場合、たとえば YUMM 1.7 の腫瘍を持つマウスが MC38 大腸癌細胞を用いて治療される場合には、効果がない (図 3b)。免疫化の結果についても、8モップAへの PBMC 曝露を避けることが重要です。8-モップa曝露 PBMC だけでなく、abrogate、またはおそらく逆であっても、抗腫瘍免疫 (図 3c) は、同様の数の 8-モップa露出と 8-モップの実験のように、未暴露細胞の免疫能を阻害するだけでなく、保護された PBMC を、観察できない抗腫瘍効果で使用した (図 3c)。
ヒト PBMC を用いて、TI チャンバおよび transimmunization プロトコルは、DC への単球活性化をもたらし、臨床 ECP プレートによって達成されたものから細胞表面および細胞内活性化マーカーによって区別できない (表 1)。マウス研究のように、DC 活性化 (図 4a) および transimmunization 生成された DCs が抗原を処理して存在する能力 (図 4b、C) は、PBMC における血小板の存在、および TI プレートの継代において決定的に依存する。Transimmunization 活性化されたヒト DCs は、ペプチド抗原 (図 4b) のいずれか、または 8-モップA 露出したヒト腫瘍細胞全体からの抗原を効果的に処理および交差させることができ、インビトロでヒト抗原特異的 T 細胞株を活性化するアッセイ (図 4c) は、TI および血小板依存的な方法で (図4b、C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig1.jpg"> 図 1: Transimmunization (TI) チャンバとプロトコル回路図。(A) transimmunization 処理室 (TI 板) の図及び仕様。(B) transimmunization 処理実験ワークフローの概略説明。簡単に言えば、同系腫瘍細胞を用いて動物を皮下 (s.c.) に接種する。触知可能な腫瘍を有する動物は、採血によって週2回、血液からの PBMC の単離、PBMC が 8-モップ/UVA 処理された腫瘍細胞の存在下での自家血小板被覆 TI 板を通過する、PBMC および腫瘍細胞共インキュベーション一晩、同じ腫瘍担動物に静脈内に細胞を再注入する。腫瘍体積は実験全体を通して測定される。この図は11から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig1large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig2.jpg"> 図 2: Transimmunization は yumm 1.7 黒色腫の同系腫瘍の増殖を制御する。(A) yumm 1.7 腫瘍体積を 1 x 105 yumm 1.7 腫瘍細胞に接種した C57BL/6 マウスについてプロットし、6つの transimmunization 処置 (黒線)、または6つの対照処置 (灰色線) のいずれかを受けた。データは、2年間にわたって実施された9つの独立した実験に累積する。(B) 1 つの代表 yumm 1.7 transimmunizaton 実験から、個々のマウスの腫瘍の成長を示す各ラインを含むデータ。(AおよびB)全ての実験においてマウスの「PBS 制御」は、実験動物と同じスケジュールで採血したが、6個の滅菌 PBS 再注入を受けた。誤差バーは、Sidak の多重比較検定を使用して各時点で計算された SEM、p 値を表します。* *, p = 0.0013;, p &lt; 0.0001.この図は11から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig2large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig3.jpg"> 図 3: Transimmunization は、TI プレート通過された PBMC 画分で単球および血小板を必要とするが、また 8-モップの抗原一致腫瘍細胞の治療と PBMC のスペアリングを8つのモップで要求する。(A) yumm 1.7 腫瘍体積を 1 * 105 yumm 1.7 腫瘍細胞に接種した C57BL/6 マウスについてプロットし、6つの transimmunization 処置 (実線の黒色線)、6つの制御処置 (実線の灰色の線)、または6つの TI 処置を受けた単球または血小板がプレート継代工程前に PBMC から枯渇したところ (CD11b および a − CD41 枯渇キットを用いてそれぞれ)、またはプレート通路が省略された (点線)。(B) 腫瘍体積が 1 x 105 yumm 1.7 腫瘍細胞で接種された C57BL/6 マウスのためにプロットされ、6つの transimmunization 処置 (実線黒色線) のいずれかを受け、6つの制御処置 (実線の灰色の線)、PBMC 単独 (破線)、8−モップa処理された yumm 1.7 細胞は、または 8-モップA処理 MC38 腫瘍細胞 (点線) を使用して TI。(C) 経時的腫瘍体積 1 x 105 yumm 1.7 腫瘍細胞を接種した C57BL/6 マウスについてプロットし、6つの Transimmunization 処置 (実線の黒線)、6つの制御処置 (実線の灰色の線)、6つの TI 処置を受けるPBMC をプレート継代の直前に 8-モップaに均一に曝露し、プレート継代直後に pbmc を 8-モップaに均一に曝露した6つの TI 治療、またはプレート継代後の TI 細胞を混合した6つの治療法で1:18モップ照射に均一に暴露された PBMC の同数 (点線) である。(A、 B 、 C)全ての実験においてマウスの「PBS 制御」は、実験動物と同じスケジュールで採血したが、6個の滅菌 PBS 再注入を受けた。データは代表的な実験のために提供される。バーは、Sidak の多重比較検定を使用して各時点で計算された SEM、P 値を表します。*, p &lt; 0.05;* *, p &lt; 0.01;, p &lt; 0.001;, p &lt; 0.0001;NS = 相違点は重要ではありません。この図は11から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig3large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig4.jpg"> 図 4: TI チャンバを有する TI プロトコルは、ヒト PBMC における DC 成熟、ユニークな活性化プロファイル、および T 細胞活性化能力を急速に誘導し、プレート継代および血小板に依存する。 CD11c+細胞における指定されたマーカーの FACS 分析は、新たに孤立したヒト PBMC のうちのいずれか (「対照」)、TI プロトコール (「ti」) で処理された pbmc、または、プレート継代が省略した場合の ti 処置 pbmc を用いて、血小板を枯渇させるCD41 ビーズキットをプレート通路前に、または上記の両方が実施した。データは3人の血液ドナーと6回の独立した実験を要約する。バーは平均値を表し、誤差バーは対応する t 検定を使用して計算された各比較の SEM P 値を表します。*, p &lt; 0.05;* *、p &lt; 0.01。パネルは11から変更されました。B.血小板含有または血小板減少した TI 処置されたヒト PBMC を、無関係な (SIINFEKL) ペプチドと共に一晩共インキュベートした、または、頭頸部扁平上皮癌に関連した HPV に対して長いペプチドと共に用いられる。PBMC を、その後、E7 ペプチドに特異的に反応性のヒト CD8 T 細胞株を刺激するために使用した。T 細胞刺激は培養5日後の IFNg 生産により測定した。(C) 血小板含有または血小板減少した TI 処置されたヒト PBMC を、8-モップA処置を受けた頭頸部扁平上皮癌細胞株 SCC61 で一晩共インキュベートした (SCC61 hpv E6/7) か、発現していない (SCC61 hpv) 抗原性 HPV E6 および E7 タンパク質19.PBMC を、その後、E7 ペプチドに特異的に反応性のヒト CD8 T 細胞株を刺激するために使用した。T 細胞刺激は培養5日後の IFNg 生産により測定した。(BおよびC)データは、それぞれに3つの反復を含む代表的な実験を示す。バーは平均値を表し、誤差バーは Sidak の多重比較検定を使用して計算された各比較の SEM P 値を表します。, p &lt; 0.001;, p &lt; 0.0001.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>マーカー</td>
			<td>パラメーター</td>
			<td>未処理</td>
			<td>TI プロトコルを使用した ECP プレート</td>
			<td>Ti プロトコルを使用した TI プレート</td>
			<td>p 値 ECP 対 TI</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>100.1 ±42.4</td>
			<td>439.8 ±152.5</td>
			<td>417.7 ±152.2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD80</td>
			<td>Δ</td>
			<td>3.9 ±1.1</td>
			<td>22.3 ±7.2</td>
			<td>24.5 ±7.2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD83</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>0.3 ±0.2</td>
			<td>53.3 ±9.7</td>
			<td>51.4 ±17.4</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD86</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10.8 ±1.7</td>
			<td>103.9 ±23.4</td>
			<td>87.1 ±17.6</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>PLAUR</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>54.5 ±12</td>
			<td>721.4 ±183.6</td>
			<td>528.7 ±135.5</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>ICAM1</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>12.2 ±1.6</td>
			<td>179.6 ±28.5</td>
			<td>192.5 ±25.4</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITGB5</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>53.6 ±25.7</td>
			<td>97.1 ±31.6</td>
			<td>103.8 ±32.8</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CCL2 (MCP-1)</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0.6 ±0.5</td>
			<td>70.1 ±6.7</td>
			<td>55.2 ±8.9</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CXCL5</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0.7 ±0.4</td>
			<td>39.1 ±7.2</td>
			<td>41.5 ±4.7</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CXCL16</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0.3 ±0.2</td>
			<td>28.0 ±8.8</td>
			<td>35.3 ±11.7</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD105 (endoglin)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>3.6 ±0.3</td>
			<td>124.3 ±25.4</td>
			<td>141.8 ±33.2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD112 (nectin 2)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10.9 ±1.8</td>
			<td>47.3 ±5.2</td>
			<td>50.9 ±9.2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD120a (TNFR-1)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10.1 ±2.6</td>
			<td>2.2 ±1.4</td>
			<td>1.8 ±1.1</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD137L (4-1BBL)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>2.9 ±1.5</td>
			<td>1.0 ±0.4</td>
			<td>1.2 ±0.6</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: ti チャンバを有する ti プロトコルは、臨床 ECP 室と ti プロトコルによって誘導されたものと同等の DC 成熟を迅速に誘導する。新たに分離した PBMC (「未処理」) のいずれかの中の生きたヒト CD11c + 細胞における対応する IgG コントロールからの示されたマーカーの変化の FACS 分析は、PBMC が TI プロトコルに続く臨床 ECP プレートを通過した (「TI プロトコルを用いた ECP プレート」)一晩インキュベート、または TI プロトコル (「TI プレート・プロトコル」) で処理した PBMC を分析し、次の一晩インキュベートを分析した。HLA-DR のような、細胞集団全体が変化したマーカーについては、データは平均蛍光強度の変化 (MFI) として表される。CCL2 のようなマーカーを発現する細胞のサブセットのみのマーカーの場合、live CD11c + PBMC のパーセントマーカー陽性細胞の差は代わりに表される。データは3人の血液ドナーと6回の独立した実験を要約する。各マーカーのデータは、平均値 (SEM) の aver ±標準誤差として表される。対の t 検定を使用して計算された各比較の P 値。NS = 相違点は重要ではありません。テーブルは11から変更されました。
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59370/59370mov1.jpg"> ビデオ 1: TI プレート内の血小板および免疫細胞相互作用の生細胞イメージング PBMC を上述のプロトコルセクション2に記載したように調製し、セクション4に記載されているように transimmunization プレートに曝露し、ステップ4.2.3 における静的なインキュベーション期間を除いて、1時間から30分に短縮した。TI プロトコルの間、標準の顕微鏡スライドと同じ大きさの TI プレートを、蛍光画像化システムのスライド保持段階に嵌合し、その中の細胞を、プレート充填時に40倍の倍率と37° c で画像化した (4.2.2)、プレートインキュベーション (4.2.3)、プレートフロー (4.3.5) のステージがあります。連続画像を取得し、「自動スキャンルーチン」ソフトウェアを使用して制作された映画。ビデオの下のキャプションは、セルが撮影されているプロトコルのステージを示しています。ビデオ内の矢印と円 (関連するキャプション付き) は、対象のセルと領域を示します。10μ m のスケールバーは、ビデオ全体の右下隅に存在します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/Video1.mp4" target="_blank">この動画を見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。</a>

Transimmunization (TI) デバイスまたはプレートと関連するプロトコルは、実験的な設定で、体外光化学療法 (ECP) の主要な機能を再現するために開発されており、生理活性、チューナブル樹状の生産を可能にします癌免疫療法のための細胞 (DCs)。

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

PhDCと呼ばれ、生理学的樹状抗原提示細胞は、抗原特異的T細胞免疫および耐性を開始する免疫マスタースイッチである。この論文は、PhDCの臨床使用がそれらを産生するために使用される非生理学的サイトカイン法によって妨げられるPhDCの臨床使用のための効率的な方法を示す。我々の方法は、ヒトおよびマウスにおける単球からDCへの変換の効率的な血小板シグナル伝達を介してその問題を克服する。これらのPhDCは、生体内で利用できないサイトカインの状態に依存せず、確立された癌を有するヒトおよびマウスの両方で強力な臨床的抗腫瘍T細胞応答を生成することができる。種非依存性血小板の単球-phDC成熟の開始は、広範な実験的応用性を有する。PhDCは樹状細胞生理学の解剖を許可し、免疫原癌に対する治療抗癌免疫の誘導を促進し、パーソナライズされた抗菌ワクチン接種の約束を提供する。この実験系は新規であり、プラスチック室のコーティング、8-MOP/UVAによる腫瘍細胞処理、流動条件、単球の放出など、複数の側面が視覚的に最もよく表される。手順を実証することは、私の研究室の技術者であるイブ・ロビンソンです。末梢血単核細胞を採取するために、まず、5〜10匹のマウスに4ミリリットルのリンパ球分離培地を持つ15ミリリットルのチューブを血を流す。その後、培地の上に腫瘍を持つマウスから採取した血液をゆっくりと重ねる。PBMCsを赤血球から分離するために、1,000〜1、500回Gで細胞を20分間回転させます。遠心分離の終わりに、上のプラズマ層を収集し、0.5ミリリットルをバフィーコートの上に残し、後で使用するために摂氏4度で保存します。次に、PBSで満たされた清潔な15ミリリットルチューブにバフィーコート層を15ミリリットルに集め、標準的な組織培養遠心分離機で250回-Gで10分間回転してPBMCを回収する。遠心分離の終わりに、上清から慎重にピペットを取り出し、ペレットを再懸濁するためにチューブをフリックします。次に、ACK赤血球のリシスバッファーを2ミリリットル加え、PBMCから残っている赤血球を除去します。PBMCを氷の上で10分間インキュベートします。チューブをPBSで15ミリリットルに充填し、標準的な組織培養遠心分離機で250倍Gで10分間スピンダウンしてPBMCを回収します。上清から慎重にピペットを取り除き、ペレットを緩めるためにチューブをフリックします。300マイクロリットルのFBSでペレットを再懸濁します。1つの治療群につきYUMM1.7腫瘍細胞を調製するために、まずFBS中の腫瘍細胞ペレットを300マイクロリットル当たり250万細胞で再懸濁する。組織培養フードライトが消灯すると、8-メトキシポラレンを添加して、1ミリリットル当たり100ナノグラムの最終濃度をYUMM1.7腫瘍細胞懸濁液に加えます。次に、細胞を混合し、ホイルで細胞容器を包み、摂氏37度で20分間インキュベートします。12ウェル組織培養プレートをプレコートするには、5匹のマウスの治療グループごとに1つのウェルにFBSを1ミリリットル加え、プレートを摂氏4度で20分間冷蔵します。20分後、組織培養フードの下で、ウェルからFBSを取り除き、メトキシポラレン暴露腫瘍細胞をウェルあたり300マイクロリットル添加する。次に、細胞含有板を、1平方センチメートル当たり4ジュールの全照射のための予熱紫外線A光源に露出させる。各ウェルから8メトキシポラレン/UVA処理腫瘍細胞を収集するには、プレートとピペットを慎重に旋回して細胞の完全な回復を確実にします。5匹のマウスの各治療群に対してトランス免疫プレート通過を行うために、適切なPBMCの300マイクロリットルと8-メトキシポラレン/UVA処理腫瘍細胞の300マイクロリットルを1.5ミリリットル円錐形チューブに組み合わせて細胞を混合する。次に、TIプレートの入口と出口のチューブクランプを開きます。10 ミリリットルのシリンジを使用して TI チューブを FBS で満たし、チューブがチューブ内の FBS を保持するように充填されるとクランプを閉じます。シリンジを取り外します。P1000ピペットチップをTIプレートの取り入れ部にしっかりと入れます。プレートを45度の角度で保持し、PBMCと腫瘍細胞ミックスでゆっくりとプレートを充填し、気泡を避けます。ピペットプランジャーを解放する前に、取り入れからピペットチップを取り外します。残りの細胞を1.5ミリリットルの円錐管に戻します。FBS充填チューブ、細胞充填TIプレート、および組織培養インキュベーターに残った細胞を含む1.5ミリリットルの円錐チューブを摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、クランプを解放し、重力によってTIチューブを空にします。次に、プランジャーを押し下げたP1000ピペットチップをプレートポートに挿入して、TIプレートから細胞を取り除きます。プレートを45度の角度で保持し、P1000ピペットチップを充填します。元の1.5ミリリットルの円錐管に細胞を戻します。TIプレートを実行するには、出口チューブをプレートに接続し、TIプレートをプレート実行システムに固定します。次に、1ミリリットルのシリンジを使用して、1.5ミリリットル円錐管からPBMCおよび腫瘍細胞ミックスの600マイクロリットルを引き出す。クランプを開いた後、注射器を入口チューブに取り付け、流体がチューブの端に到達するまでゆっくりと充填します。TIプレートに入口チューブの自由端を取り付け、残りのボリュームを静かに積み込みます。終了したら、入り口クランプを閉じます。1ミリリットルのシリンジを取り外し、入り口チューブをシリンジポンプに接続します。セルコレクション用のクリーンな1.5ミリリットル円錐管に出口チューブを固定します。シリンジポンプの流量を毎分0.09ミリリットルに調整します。TIプレートを走るプラットホームを使用して、シリンジポンプ側に向かってTIプレートを約30度傾けます。入口チューブのクランプを慎重に解放します。TIプレートの充填方法を注意深く観察し、シリンジポンプを開始します。TIプレートが完全に充填されたら、空にして反対方向に約30度傾けます。液体中のすべての細胞が1.5ミリリットルの円錐コレクションチューブ内にある場合は、ポンプを停止します。TIプレートを洗浄するには、入口チューブをシリンジポンプから取り外し、600マイクロリットルのFBSで満たされた1ミリリットルのシリンジに接続します。FBS が完全にロードされるまで埋めます。次に、シリンジを取り外し、チューブをシリンジポンプに取り付けます。シリンジポンプの流量を毎分0.49ミリリットルに調整します。入り口クランプを放し、TIプレートを実行し、同じ1.5ミリリットルの円錐管に洗浄を集める。TIプレートをフリックまたはタップして、プレートが空になると接着細胞を取り外し、溶出するのを助けます。TIプレートのセットアップからコレクション1.5ミリリットルの円錐管を取り外します。250回Gでベンチトップマイクロフュージでコレクションチューブを8分間回転させ、上清を捨てます。PBMCの一晩の共培養を抗原と共に行うために、まずPBMCと腫瘍細胞ペレットを15%自家マウス血清を補った2ミリリットルの透明RPMIで再懸濁する。次いで、35ミリメートルの非組織培養処理無菌皿中の細胞をプレートし、標準的な組織培養条件下で一晩インキュベートする。翌日、組織培養スクレーパーで、皿の底から接着細胞を慎重に取り外します。スクレイピングしながら皿を回転させて、セルの収集を確実にします。15ミリリットルのチューブに細胞を収集します。皿にPBSの2ミリリットルを加え、掻き取りステップを繰り返し、細胞を同じチューブに集めます。35ミリメートルの皿をPBSの1ミリリットルで洗いすり、同じチューブにすすいを加えます。標準的な組織培養遠心分離機で250回回転し、細胞を採取する。上清から慎重にピペットを取り除き、チューブをフリックしてペレットを再中断します。この療法は、2年間に行われた9つの独立した実験の累積腫瘍増殖データで観察された100以上の治療対照マウスにおけるYUMM1.7腫瘍増殖の減少を示した。1つの実験の中で個々の動物のための代表的な腫瘍の成長曲線は、システムのばらつきの感覚を提供する。単球または血小板のいずれかがPBMC画分から枯渇した場合、またはプレート通過が省略された場合、治療効果は認められなくなる。この治療は、免疫細胞または抗原源のいずれにも存在しない場合、またはMC38大腸癌細胞を用いて治療されたYUMM1.7腫瘍のような不一致抗原の存在下で効果がない。免疫の結果のために, 8-メトキシポラレンへの PBMC 暴露を避けることも重要です。.ヒトCD11c+細胞における対応するIgGコントロールからの示されたマーカーの変化のFACS分析は、新たに単離されたPBMC、TI処理PBMC、プレート通過なしのTI処理PBMC、プレート通過前の血小板の枯渇、または上記の両方の間で、DC活性化がPBMC中の血小板の存在に依存することを示した。TI活性化ヒトDCは、ペプチド抗原、または8-メトキシポラレン暴露ヒト腫瘍細胞全体からの抗原を効果的に処理し、クロス存在させ、TIおよび血小板依存的な方法でインビトロアッセイでヒト抗原特異的T細胞株を活性化することができる。T細胞応答の特異性は、処理された抗原の供給源に依存する。抗癌免疫を誘導する場合、各癌細胞株のアポトーシスは、免疫原性を最大化するために滴定されなければならない。誘導免疫は抗原の免疫に特異的となるため、各システムの詳細な解剖が可能となる。各実験癌または臨床癌、および各抗菌反応は、一意に有益なものとなる。個々のヒト癌は、腫瘍特異的抗原の独自の配列を有する。PhDCは、事前に検査室を特定することなく、腫瘍抗原の必要な分類と提示を行います。8-MOPとUVA光は発がん性物質です。8-MOP を取り扱う場合や UVA 光源を使用する場合は、適切な保護具を使用し、安全手順に従ってください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶ、生理学的免疫原性樹状細胞（PhDC）を生成する新規プロトコル。血小板シグナル伝達を利用した単球から樹状細胞への変換法により、抗腫瘍免疫応答を誘導する革新的ながん免疫療法アプローチを理解できます。

生理学的免疫原性樹状細胞を生成するための新規プロトコル

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