生理学的免疫原性樹状細胞を生成するための新規プロトコル

PhDCと呼ばれ、生理学的樹状抗原提示細胞は、抗原特異的T細胞免疫および耐性を開始する免疫マスタースイッチである。この論文は、PhDCの臨床使用がそれらを産生するために使用される非生理学的サイトカイン法によって妨げられるPhDCの臨床使用のための効率的な方法を示す。

我々の方法は、ヒトおよびマウスにおける単球からDCへの変換の効率的な血小板シグナル伝達を介してその問題を克服する。これらのPhDCは、生体内で利用できないサイトカインの状態に依存せず、確立された癌を有するヒトおよびマウスの両方で強力な臨床的抗腫瘍T細胞応答を生成することができる。種非依存性血小板の単球-phDC成熟の開始は、広範な実験的応用性を有する。

PhDCは樹状細胞生理学の解剖を許可し、免疫原癌に対する治療抗癌免疫の誘導を促進し、パーソナライズされた抗菌ワクチン接種の約束を提供する。この実験系は新規であり、プラスチック室のコーティング、8-MOP/UVAによる腫瘍細胞処理、流動条件、単球の放出など、複数の側面が視覚的に最もよく表される。手順を実証することは、私の研究室の技術者であるイブ・ロビンソンです。

末梢血単核細胞を採取するために、まず、5〜10匹のマウスに4ミリリットルのリンパ球分離培地を持つ15ミリリットルのチューブを血を流す。その後、培地の上に腫瘍を持つマウスから採取した血液をゆっくりと重ねる。PBMCsを赤血球から分離するために、1,000〜1、500回Gで細胞を20分間回転させます。

遠心分離の終わりに、上のプラズマ層を収集し、0.5ミリリットルをバフィーコートの上に残し、後で使用するために摂氏4度で保存します。次に、PBSで満たされた清潔な15ミリリットルチューブにバフィーコート層を15ミリリットルに集め、標準的な組織培養遠心分離機で250回-Gで10分間回転してPBMCを回収する。遠心分離の終わりに、上清から慎重にピペットを取り出し、ペレットを再懸濁するためにチューブをフリックします。

次に、ACK赤血球のリシスバッファーを2ミリリットル加え、PBMCから残っている赤血球を除去します。PBMCを氷の上で10分間インキュベートします。チューブをPBSで15ミリリットルに充填し、標準的な組織培養遠心分離機で250倍Gで10分間スピンダウンしてPBMCを回収します。

上清から慎重にピペットを取り除き、ペレットを緩めるためにチューブをフリックします。300マイクロリットルのFBSでペレットを再懸濁します。1つの治療群につきYUMM1.7腫瘍細胞を調製するために、まずFBS中の腫瘍細胞ペレットを300マイクロリットル当たり250万細胞で再懸濁する。

組織培養フードライトが消灯すると、8-メトキシポラレンを添加して、1ミリリットル当たり100ナノグラムの最終濃度をYUMM1.7腫瘍細胞懸濁液に加えます。次に、細胞を混合し、ホイルで細胞容器を包み、摂氏37度で20分間インキュベートします。12ウェル組織培養プレートをプレコートするには、5匹のマウスの治療グループごとに1つのウェルにFBSを1ミリリットル加え、プレートを摂氏4度で20分間冷蔵します。

20分後、組織培養フードの下で、ウェルからFBSを取り除き、メトキシポラレン暴露腫瘍細胞をウェルあたり300マイクロリットル添加する。次に、細胞含有板を、1平方センチメートル当たり4ジュールの全照射のための予熱紫外線A光源に露出させる。各ウェルから8メトキシポラレン/UVA処理腫瘍細胞を収集するには、プレートとピペットを慎重に旋回して細胞の完全な回復を確実にします。

5匹のマウスの各治療群に対してトランス免疫プレート通過を行うために、適切なPBMCの300マイクロリットルと8-メトキシポラレン/UVA処理腫瘍細胞の300マイクロリットルを1.5ミリリットル円錐形チューブに組み合わせて細胞を混合する。次に、TIプレートの入口と出口のチューブクランプを開きます。10 ミリリットルのシリンジを使用して TI チューブを FBS で満たし、チューブがチューブ内の FBS を保持するように充填されるとクランプを閉じます。

シリンジを取り外します。P1000ピペットチップをTIプレートの取り入れ部にしっかりと入れます。プレートを45度の角度で保持し、PBMCと腫瘍細胞ミックスでゆっくりとプレートを充填し、気泡を避けます。

ピペットプランジャーを解放する前に、取り入れからピペットチップを取り外します。残りの細胞を1.5ミリリットルの円錐管に戻します。FBS充填チューブ、細胞充填TIプレート、および組織培養インキュベーターに残った細胞を含む1.5ミリリットルの円錐チューブを摂氏37度で1時間インキュベートします。

インキュベーション後、クランプを解放し、重力によってTIチューブを空にします。次に、プランジャーを押し下げたP1000ピペットチップをプレートポートに挿入して、TIプレートから細胞を取り除きます。プレートを45度の角度で保持し、P1000ピペットチップを充填します。

元の1.5ミリリットルの円錐管に細胞を戻します。TIプレートを実行するには、出口チューブをプレートに接続し、TIプレートをプレート実行システムに固定します。次に、1ミリリットルのシリンジを使用して、1.5ミリリットル円錐管からPBMCおよび腫瘍細胞ミックスの600マイクロリットルを引き出す。

クランプを開いた後、注射器を入口チューブに取り付け、流体がチューブの端に到達するまでゆっくりと充填します。TIプレートに入口チューブの自由端を取り付け、残りのボリュームを静かに積み込みます。終了したら、入り口クランプを閉じます。

1ミリリットルのシリンジを取り外し、入り口チューブをシリンジポンプに接続します。セルコレクション用のクリーンな1.5ミリリットル円錐管に出口チューブを固定します。シリンジポンプの流量を毎分0.09ミリリットルに調整します。

TIプレートを走るプラットホームを使用して、シリンジポンプ側に向かってTIプレートを約30度傾けます。入口チューブのクランプを慎重に解放します。TIプレートの充填方法を注意深く観察し、シリンジポンプを開始します。

TIプレートが完全に充填されたら、空にして反対方向に約30度傾けます。液体中のすべての細胞が1.5ミリリットルの円錐コレクションチューブ内にある場合は、ポンプを停止します。TIプレートを洗浄するには、入口チューブをシリンジポンプから取り外し、600マイクロリットルのFBSで満たされた1ミリリットルのシリンジに接続します。

FBS が完全にロードされるまで埋めます。次に、シリンジを取り外し、チューブをシリンジポンプに取り付けます。シリンジポンプの流量を毎分0.49ミリリットルに調整します。

入り口クランプを放し、TIプレートを実行し、同じ1.5ミリリットルの円錐管に洗浄を集める。TIプレートをフリックまたはタップして、プレートが空になると接着細胞を取り外し、溶出するのを助けます。TIプレートのセットアップからコレクション1.5ミリリットルの円錐管を取り外します。

250回Gでベンチトップマイクロフュージでコレクションチューブを8分間回転させ、上清を捨てます。PBMCの一晩の共培養を抗原と共に行うために、まずPBMCと腫瘍細胞ペレットを15%自家マウス血清を補った2ミリリットルの透明RPMIで再懸濁する。次いで、35ミリメートルの非組織培養処理無菌皿中の細胞をプレートし、標準的な組織培養条件下で一晩インキュベートする。

翌日、組織培養スクレーパーで、皿の底から接着細胞を慎重に取り外します。スクレイピングしながら皿を回転させて、セルの収集を確実にします。15ミリリットルのチューブに細胞を収集します。

皿にPBSの2ミリリットルを加え、掻き取りステップを繰り返し、細胞を同じチューブに集めます。35ミリメートルの皿をPBSの1ミリリットルで洗いすり、同じチューブにすすいを加えます。標準的な組織培養遠心分離機で250回回転し、細胞を採取する。

上清から慎重にピペットを取り除き、チューブをフリックしてペレットを再中断します。この療法は、2年間に行われた9つの独立した実験の累積腫瘍増殖データで観察された100以上の治療対照マウスにおけるYUMM1.7腫瘍増殖の減少を示した。1つの実験の中で個々の動物のための代表的な腫瘍の成長曲線は、システムのばらつきの感覚を提供する。

単球または血小板のいずれかがPBMC画分から枯渇した場合、またはプレート通過が省略された場合、治療効果は認められなくなる。この治療は、免疫細胞または抗原源のいずれにも存在しない場合、またはMC38大腸癌細胞を用いて治療されたYUMM1.7腫瘍のような不一致抗原の存在下で効果がない。免疫の結果のために, 8-メトキシポラレンへの PBMC 暴露を避けることも重要です。.

ヒトCD11c+細胞における対応するIgGコントロールからの示されたマーカーの変化のFACS分析は、新たに単離されたPBMC、TI処理PBMC、プレート通過なしのTI処理PBMC、プレート通過前の血小板の枯渇、または上記の両方の間で、DC活性化がPBMC中の血小板の存在に依存することを示した。TI活性化ヒトDCは、ペプチド抗原、または8-メトキシポラレン暴露ヒト腫瘍細胞全体からの抗原を効果的に処理し、クロス存在させ、TIおよび血小板依存的な方法でインビトロアッセイでヒト抗原特異的T細胞株を活性化することができる。T細胞応答の特異性は、処理された抗原の供給源に依存する。

抗癌免疫を誘導する場合、各癌細胞株のアポトーシスは、免疫原性を最大化するために滴定されなければならない。誘導免疫は抗原の免疫に特異的となるため、各システムの詳細な解剖が可能となる。各実験癌または臨床癌、および各抗菌反応は、一意に有益なものとなる。

個々のヒト癌は、腫瘍特異的抗原の独自の配列を有する。PhDCは、事前に検査室を特定することなく、腫瘍抗原の必要な分類と提示を行います。8-MOPとUVA光は発がん性物質です。

8-MOP を取り扱う場合や UVA 光源を使用する場合は、適切な保護具を使用し、安全手順に従ってください。