マイクロ流体ベースのハイスループット循環腫瘍細胞選別およびシングルセルシーケンシング技術

私たちは高性能CTC分離および分析手法の開発に注力し、液体生検による精密腫瘍学の進歩を目指しています。現在の商用CTCアイソレーションプラットフォームは、スループットと効率が低いです。また、下流の解析プラットフォームとも互換性がなく、生物学的情報の回復が制限されています。

本研究では、マイクロ流体CTC分離プラットフォームを用いて検出率を大幅に向上させています。また、より深い液体生検解析のために希少細胞単細胞シーケンシングチップを適用します。まず、洗浄・再懸濁したストレプタビジン修飾磁気ビーズ25マイクロリットルを、ビオチニル化EpCAM抗体1マイクログラム入りのチューブにピペットします。

混合液を室温で培養し、1分間に20回転させて40分間培養し、免疫磁気ビーズを準備します。磁気トラックを使ってビーズを上清液から分離します。上清液を除去した後、ビーズを25マイクロリットルの分離バッファーに再懸浮させます。

磁気ビーズ懸流液を1〜2秒以内にピペットで20マイクロリットル抽出し、気泡が入らないようにします。すぐにチップを垂直に磁石に置き、ビーズを5分間静止させます。血液サンプル4ミリリットルを注射器に集め、気泡を除去します。

チップの入口と出口を液体で密封して気泡を除去し、サンプルの入口と出口チューブをチップに挿入します。シリンジポンプを使い、1.5ミリリットル毎時の流量でサンプルを注入します。サンプルをロードした後、60マイクロリットルのDPBSをHBチップに毎時0.2ミリリットルの流量で注入し、結合していない細胞を洗い流します。

磁石を外し、5%BSAを1.5ミリリットル手動で注入してチップを洗浄し、捕獲した腫瘍細胞を解放します。エタノールで10%MPTS溶液を準備します。すぐに20マイクロリットルの溶液をHBチップに注入し、室温で1時間培養します。

HBチップを無水エタノールで一度洗い流し、その後100度で1時間乾燥させます。次に、0.5ミリグラム/ミリリットル濃度のGMBS溶液をエタノールで準備します。チップを37度まで冷却した後、GMBS溶液を導入して培養します。

HBチップを二重蒸留水で2回洗い流し、その後DPBSで2回洗い流します。すぐに1ミリリットルあたり15マイクログラムのストレプトアビジンをHBチップに加え、室温で1時間または4度の温度で一晩培養します。培養後、HBチップをDPBS生理食塩水で2回洗い流します。

次に、0.2%BSAと20マイクログラム/ミリリットルのビオチニル化CD45抗体をDPBSに加え、最終体積に調整してCD45抗体バッファーを準備します。白血球の陰性選択のために、CD45抗体バッファー20マイクロリットルをHBチップに注入します。室温で1時間の培養後、DPBSでチップを洗い流します。

3%BSAと0.05%Tween 20を含むブロッキング溶液をHBチップに加えます。準備済みのサンプルをシリンジに吸引し、気泡が存在しないことを確認します。次にチップの入口と出口を液体で密封し、入口と出口のチューブをチップに接続します。

シリンジポンプを使い、毎時0.6ミリリットルの流量でサンプルを注入します。チップ出口から精製された腫瘍細胞を採取し、カウントと単一細胞シーケンスを行います。0.5%F-68溶液のピペット200マイクロリットをDPBSで製製し、チップ入口に注入します。

チップを持ちながら水浴超音波検査を行います。微細孔質領域に気泡が見えたら、2つの井戸から気泡を除去するために30秒間超音波検査を続けます。次に、60,000個のデュアルウェルを含むチップに200マイクロリットルの腫瘍細胞懸濁液を注入します。

チップ内のセルサスペンションを優しく上下にピペットで上下に2回動かします。その後、再び脱色シェーカーにかけて5分間、未捕獲の細胞を再懸浮させて再び沈殿させます。次に、200マイクロリットルのDPBSと0.5%F-68溶液を入口から加え、出口から吸引します。

バーコード入りのビーズサスペンションを再サスペンションした後、すぐにチップ入口に200マイクロリットルのサスペンションを注入し、10回転毎分で20秒間振る。ビーズサスペンションを優しく2回ピペットで拭き取り、シェーカーに戻します。次にバーコード入りのビーズ懸濁液を出口から取り出し、20×トリス-EDTA溶液と50ミリモラージチオスレイトール溶液を200マイクロリットルピペットで移液します。

液体を出口から引き抜く。細胞分解とMRNA捕捉のために、チップ入口に200マイクロリットルの細胞溶解バッファーをゆっくりと追加します。すぐに200マイクロリットルのミネラルオイルを加えて二重井戸を密閉します。

チップ出口から廃棄物リザーバーに流れ込む溶液を除去してください。その後、チップを横に置き、室温で5分間置きます。ゆっくりと6Xシエン酸ナトリウム溶液を200マイクロリットル加えます。

廃液を取り除き、チップ出口から残った溶液を吸引します。ゆっくりと6Xシエン酸ナトリウムを200マイクロリットル加えてチップを充填します。チップの表面近くに磁石を置き、入口から出口までゆっくり動かしてバーコード入りビーズを集めます。

6X塩水クエン酸ナトリウムを含む遠心分離機チューブに溶液とビーズを速く吸引します。バーコード入りビーズを6Xシエン酸塩ナトリウム200マイクロリットルで3回洗浄し、その後逆転写バッファーで1回洗浄します。磁場下では免疫磁気ビーズの均一分布が観察され、磁気除去後の残留ビーズが最小限であることが成功した放出が確認されました。

CTC分離チップは、1ミリリットルおよび10ミリリットルのサンプルから腫瘍細胞を効率的に捕捉しました。精製チップの追加により腫瘍細胞の純度はさらに向上しました。末梢血液サンプルでLNCaP細胞がほとんど検出されなかった場合、CTCの選別システムは高い捕捉効率と純度を維持しました。

シングルセルのバーコーディングチップは85.6%セルと95.7%のバーコードビーズ占有率を達成し、ペアリング率は81.9%となりました。ロードセル数を増やすことで、捕捉効率を損なうことなくマイクロウェル占有率が向上しました。統合CTC分離および単一細胞シーケンシングのワークフローにより、非常に純度の高い腫瘍細胞が生成され、元の腫瘍細胞比率を正確に保持しました。TSNE解析により、PC3、LNCaP、Jurkatの細胞はそれぞれ独自のマーカー発現を持つ3つのクラスターに明確に分けられました。

ジュルカット細胞クラスターはTRBC1、IGLL1、CD1E、CD3Dの強い発現により同定され、T細胞活性化のための経路富集によって確認されました。PC3およびLNCaPクラスターは、マイクロセミノタンパク質発現が高い遺伝子、LNCaPがNEDD4発現を示す差異発現遺伝子によって区別されました。