Name: 単一細胞のゲノムの配列のための超高スループット マイクロ流体プラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学ぶ マイクロ流体デバイスを用いた単一細胞ゲノム配列解析の手法。数万個の細胞を個別に封入・バーコード化し、ゲノム異質性を保持しながら超高スループットなシーケンスデータを生成する革新的なワークフローです。

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この作品は全米科学財団のキャリア賞 (許可番号 DBI 1253293) を支えられ国立衛生研究所 (NIH) (許可番号 HG007233-01、R01-EB019453-01、1R21HG007233、DP2-AR068129-01、R01 HG008978);防衛先端研究プロジェクト庁生活ファウンドリ プログラム (契約番号 HR0011-12-C-0065 N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066)。

<ol><li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li>
<li>Ni, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+copy+number+variation+patterns+among+single+circulating+tumor+cells+of+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).</li>
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<li>Martínez, J. L., Baquero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+strategies+associated+with+bacterial+infection%3A+pathogenicity+epidemicity%2C+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+for+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers for single cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).</li>
<li>Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+microfluidics+for+digital+quantification+and+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing.</a> Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+clonal+origins+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+by+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+labeling+%28Hi-SCL%29+for+RNA-Seq+using+drop-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics.</a> PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).</li>
<li>Amini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotype-resolved+whole-genome+sequencing+by+contiguity-preserving+transposition+and+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing.</a> Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotyping+germline+and+cancer+genomes+with+high-throughput+linked-read+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).</li>
<li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nature Communications. 7, 11784(2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing+at+ultra-high-throughput+with+microfluidic+droplet+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).</li>
<li>Novak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiplex+gene+detection+and+sequencing+with+microfluidically+generated+agarose+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Internation+Edition%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions.</a> Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).</li>
<li>Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lysis+methods+for+the+extraction+of+bacterial+DNA+for+analysis+of+the+vaginal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota.</a> PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).</li>
<li>Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beating+Poisson+encapsulation+statistics+using+close-packed+ordering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2628(2009).</li>
<li>Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-based+optical+waveguides+with+live+cell+encapsulation+and+integrated+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Optic+Letters%22%5BJournal%5D)">Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics.</a> Optic Letters. 37 (9), 1472(2012).</li>
<li>Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemical-free+breaking+of+microfluidic+emulsions+with+a+hand-held+antistatic+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun.</a> Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).</li>
<li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li>
<li>Chao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+reveals+significant+changes+of+microbial+compositions+and+protective+functions+during+drinking+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 3 (1), 3550(2013).</li>
<li>Fierer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-biome+metagenomic+analyses+of+soil+microbial+communities+and+their+functional+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).</li>
<li>Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+metagenomic+sequences%3A+methods+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Classification of metagenomic sequences: methods and challenges.</a> Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+droplet+enrichment+for+targeted+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), e86(2015).</li>
<li>Clark, I. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+helix+in+a+haystack%3A+nucleic+acid+cytometry+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).</li>
</ol>

このワークフローに係る特許可能性がありますどのアダム ・ r ・ アバテのミッション バイオにライセンスは株主です。

SiC seq マイクロ ワークフローは、細菌細胞の数千から単一細胞のゲノム シーケンス データを生成します。マイクロジェル カプセル化細胞のゲノムに融着接続デジタル バーコード バーコード読み取り同じ細胞由来のグループに NGS データのインシリコデコンボリューションを可能にします。知られている組成物の微生物群集と制御実験はバーコード グループの純度を評価するために必要です。低純度のグループの大部分は細胞のカプセル化率が高すぎるまたはマイクロ流体処理手順中に発生した重要な液滴交差汚染があることを示します。ポアソン統計によると複数のカプセル化イベントをすべての非空の液滴の 5% 未満の速度を制限するすべての 10 滴の 1 の粒子の目標比率でバーコードとセルをカプセル化する必要があります。これより高い、カプセル化率 dropmaking プロセス中にカプセル化率の検証は非常に重要ですので指数関数的に、ダブレットの率を増加します。同じバーコード シーケンスを共有して別のセルからの読み取りは、区切られた bioinformatically をすることはできませんので、ユーザーは単一マイクロジェルの複数のセルをカプセル化特に警戒しなければなりません。ケースその 1 セル受信 2 異なるバーコード、バーコード シーケンスで数えるときに豊かさ指標が偏っているが、バーコード グループ純度は影響を受けません。
液滴クロスコンタミネーションも次善の合併の条件が原因で起こる可能性があります。成功した操作中にマイクロ合併デバイス (図 5) することができます制御用対 1 マイクロジェル 1 バーコード液滴と PCR 試薬の量。不適切な比率でのペアリング液滴の非理想的な流量になります: 1 バーコードはたとえば 2 microgels を組み合わせることができます。プロトコルに記載されているすべての流量は、見積もりをしてデバイスのジオメトリと液滴のサイズのわずかな変化によって調整する必要があります。高速録画機能カメラへのアクセスを持つユーザー (> 10,000 フレーム/秒) 正しい液滴合併先頭およびマイクロ操作の経過を確認してください。高速カメラへのアクセスのないユーザーは、マージされた出力の小さいボリュームを収集でき、顕微鏡液滴サイズを手動で測定します。液滴サイズを均一にする必要があります: 未反映バーコードまたはマイクロジェル滴の過剰は、還元率を小さく必要がありますを示します。
いくつかの一般的な注意事項は、それらの整合性を維持するために microgels および微小油滴中の処理にすべき。機械的に堅牢なのに Microgels は破壊と完全なゲル化を確保するための手順を洗浄する前に十分に冷却する必要があります。非球面 microgels が agarose がなかったことを示す固化する十分な時間を与えられました。Microgels を洗濯の際は、ダウン懸濁液を製品の損失を避けるために必要な速度で回転します。Agarose のゲルは密接に一致する水の屈折し、管22, ユーザーが吸引前にゲル-液晶境界を慎重に識別する必要がありますので見にくい場合があります。研究室手袋、チューブを静的な力23のビルドアップで合体に水に油滴が受けます。この理由から、読み込み素手液滴還元注射器とポンプのプライミングの前に帯電防止銃を持つすべての還元ラインを治療することをお勧めします。大規模な結合された液滴は、ゆっくりと注射器のエマルジョンを回転と手動で彼らのより大きい浮力のため上部に蓄積するより大きい低下を吸引によって削除できます。
SiC seq の単一細胞ゲノム配列を示す最初の技術 > 50,000 細菌細胞。このプラットフォームは、既存のアプローチに比べてスループットの重要な利点を提供していて、深く異種微生物サンプリングします。日には、マイクロ流体技術による単一細胞ゲノム microchambers9マイクロウェル24電池隔離および増幅が数十数百のセルのみの範囲において両者を採用しています。Wellplates5,6に単一のセルの並べ替え流専門マイクロ流体計測は必要ありませんが、同様に低いスループットを所有しています。環境から採取された土壌・水は一般のアルファ多様性を持つ > 種で 1,000 レベル25,26, SiC seq は有機体のはるかに大きな数をサンプルにその能力のおかげで非常に有利です。SiC seq ワークフローは、研究室文化、自然環境、またはホストの生活からのセル入力に適応可能です。セルのサンプル必要がありますのみ水性懸濁液でできる、無料の大きな粒子の (> 10 μ m) マイクロ カプセル化に適していること。たとえば、メソッドは、以前海水洗浄の一連を使用して、フィルター処理のカプセル化17前に細胞を前処理する手順のサンプルに適用されています。
SiC seq プロトコルは、各単一セルから比較的疎配列データ量を生成し、すべてのアプリケーションに適していない場合があります。呼び出すゲノムのde novoアセンブリまたは単一のヌクレオチドのバリアント (SNV) などいくつかのバイオインフォマティクス アルゴリズムには、効果的に動作する高いカバレッジの深さが必要があります。代わりに、バーコード グループことができますにあるクラスター化インシリコ分類合算方法27によって、読み取りのより大きなセットでアルゴリズムを適用することができます。SiC シーケンシャル ワークフローの比較的低い全体的なバーコード効率は、入力サンプルの可用性が低い場合に課題を提示可能性がありますも。SiC seq ポアソン分布のバーコードのカプセル化手順に依存している、したがって細胞の約 10% は分子バーコードを受け取るし、最後のライブラリの準備手順の間に増幅されます。これは他の点滴ベースのバーコード方式10に匹敵する、貴重な細胞サンプルを操作するユーザー シーケンスの適切なライブラリの利回りを達成する難しさがあります。、最終的に PCR のサイクル数を増やす必要があります。拡大のステップ。マイクロ流体の専門知識を持つユーザーのための別の潜在的なソリューション デジタル PCR のステップのためバーコード化効率をもたらす後正バーコード液滴をソートすることです > 8528。
SiC seq 技術の潜在的な将来の方向性は、哺乳類細胞、臨床的単一細胞研究の新しい道を舗装を使用するワークフローを適応されています。たとえば、1 つの癌の間でのコピー数変動の解析細胞 5 月癌病理学2の不均質性の役割の理解を深めます。また、subpopulations の対象となる単一セル配列またはセルの珍しい系統は、プローブし、利息29の dna 塩基配列を豊かに既存のメソッドと SiC seq の統合が有効にします。環境試料とには、知られている代謝経路内から遺伝子が対象指定および隣接する新規遺伝子領を識別する遺伝子と一緒にコンテンツ分析します。人間のホスト環境内で低価病原細菌サンプル隔離されかねないから密接に病原性の遺伝的起源の詳細を確認する単一細胞レベルでシーケンス処理します。

ゲノムは提供しています携帯電話 id および有機体の全体を含む関数の青写真の潜在性をコーディングします。ゲノムのレベルで細胞生物学の理解は、異種細胞集団内で観察される表現型の多様性を説明できます。この不均一性は生物学的システムに明らかで、人間の健康および病気の広範な影響。たとえば、腫瘍細胞の中で遺伝子コピー数変異は進化とガン1,2の普及にリンクされています。細菌感染症で、病原性諸島ゲノムのごく一部に存在は水平方向に転送することができ、抗生物質耐性菌3,4の増殖に 。単一細胞レベルのゲノムの研究に主な課題は、DNA は細胞の何千もを分析する必要性と同様にフル遺伝子型の多様性をサンプルの少量です。これらの理由から、実験的スループットの制限は、単一細胞研究、最も豊富なセルに向かって結果をバイアスの効果を妨げています。5,6、光ピンセット7、一括ゲル8、およびマイクロ9の埋込みを並べ替えの流れなど単一細胞分離技術は、細胞配列の何百もの処理が可能ただし、これはほとんどのサンプルの小さい一部分だけを表します。大幅により高いスループットの単一細胞ゲノムの配列決定法によりこれらのコミュニティ内での遺伝的多様性の役割の解明、細胞集団のより深くより完全なプロファイリングできるようになります。
液滴マイクロ細胞と何百万もピコリットル分原子炉の内で生物学的試薬の高速操作ができます。までに、技術は、異種組織10、11,12, からの細胞の中で発現パターンの研究に使用されている点滴深くシーケンス長い分子1314, ,15、および単一セル16の行為クロマチン免疫沈降シーケンス (チップ seq) 分析。確かに、微小油滴中、高スループット、区分された操作、単一細胞ゲノムで影響を受けやすいアプリケーションを作ることができます。この技術の開発は、しかし独自のユニークな技術課題を提示します。細胞の分離、精製と一様にサンプルの細胞集団に、最小限のバイアスを増幅する必要があります。さらに、哺乳類細胞における polyadenylated mRNA のコピーと異なり無い対等な分子モチーフで、ターゲット核酸の捕獲を促進する遺伝子。これらの理由から、単一細胞ゲノムは液滴のプラットフォームで実装することは困難されています。
この作品は、以前に報告した単一細胞マイクロ取り組み17単一の実験で細胞の数万人のゲノムを配列することができるの詳細なプロトコルを提供します。SiC seq と呼ばれるこの技術は、細菌細胞のミクロン スケール ゲルのカプセル化し個別に溶解し, tagmented, とを介して細胞のゲノム DNA に融着接続はユニークなオリゴヌクレオチド バーコードを含む液滴を吸収合併、シングル オーバー ラップ拡張子ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)。ゲルは、高分子量 DNA 立体包み込まれている、洗剤などにアクセスし、バーコード18前に DNA を浄化する溶菌酵素より小さい分子を許可する分離のコンテナーとして機能します。このプロトコルの処理 > バーコード ライブラリ シーケンスの準備ができて、時間の問題で 50,000 の単一細胞。次のシーケンスは、読み取り、読み取りの数百万から成る細胞インデックスを持つ各データセットの結果、単一セル バーコード順序に従ってデマルチプレクスされました。

<table><tbody><tr><td>3インチシリコンウェーハ、Pタイプ、バージンテストグレード</td><td>大学ウェーハ</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025 フォトレジスト</td><td>マイクロケム</td><td>17030192</td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>スペシャルティコーティングシステム</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>フォトマスク</td><td>CadArt Servcies</td><td>(カスタム)</td><td>マスクデザインの補足ファイルを見る</td></tr><tr><td>PGMEA開発者</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>484431</tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109827</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 シリコーンエラストマーキット</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>脱気室</td><td>Bel-Art</td><td>42025</td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm 生検パンチ</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド (75 mm x 50 mm)</td><td>Corning</td><td>294775X50</td><td></td></tr><tr><td>アクアペル(疎水性ガラス処理)</td><td>ピッツバーグガラスワーク</td>ス<td>47100</td><td></td></tr><tr><td>PE-2ポリエチレンチューブ科学</td><td>商品</td><td>B31695-PE / 2</td><td></td></tr><tr><td>1 mLシリンジ</td>BD <td></td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>27ゲージ針</td>BD <td></td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>新時代ポンプシステム</td><td>NE-501</td><td></td></tr>ノ<tr><td>ベックHFE-7500フッ素化油(HFE)</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>FC-40フッ素化油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>PEG-PFPE 界面活性剤</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant</td><td></td></tr><tr><td>スペースヒーター</td><td>Lasko&nbsp;</td><td>CD09250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>アガロース、低ゲル化温度</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>a9414</td><td></td></tr><tr><td>TE (10X)</td><td>Rockland</td><td>mb-007</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X, pH 7.4</td><td>E&K Scientific Products</td><td>EK-65083</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (密度勾配中)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>d1556</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533</td><td></td></tr><tr><td>Span 80 (ソルビタンモノオレエート)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s6760</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (ポリソルベート 20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p2287</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム IV型</td><td>MP Biomedicals</td><td>195303</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase (酵母溶解酵素)</td> <td>Zymo Research</td><td>e1004</td><td></td></tr><tr><td>Lysostaphin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7386</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7.5, 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Teknova</td><td>d9750</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸リチウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biosciences</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof (100%)</td> <td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I (nucleic acid stain)</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6k</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix)</td><td>ニューイングランドバイオサイエンス</td><td>m05365</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4464263</td><td></td></tr><tr><td>Warmstart 2.0 Bst ポリメラーゼ (等温ポリメラーゼ)</td><td>New England Biosciences</td><td>m0538m</td><td></td></tr><tr><td>NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Cold cathode fluorescent inverter</td><td>(custom)(</td><td>カスタム)</td><td></td></tr><tr><td>DC電源</td><td>Mastech</td><td>HY1503D</td><td></td></tr><tr><td>Zerostat 3 帯電防止ガン</td><td>Milty</td><td>5036694022153</td><td></td></tr><tr><td>3Dプリント遠心分離機シリンジホルダー</td><td>(カスタム)(</td><td>カスタム)</td><td>3Dプリントファイル用補足ファイルを参照</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean &コンセントレーター-5</td><td>ザイモリサーチ</td><td>D4003</td><td></td></tr></tbody></table>

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループット マイクロ流体プラットフォーム

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

シーケンス テクノロジーは、生物学的システムの一括から細胞多様性の役割の進化の理解への応答の単一セルの解像度へのパラダイム シフトを受けています。ただし、大規模な集団の単一セル配列をゲノム配列のための処理の制限によって妨げられています。本稿で単一細胞のゲノム液滴マイクロ流体を使用して、分離、増幅、単一細胞のゲノム解読 (SiC seq) とバーコードの手法について述べる。Microgels の電池を封止材により区分された精製と DNA の tagmentation マイクロ合併効率的にユニークな単一セル オリゴヌクレオチド バーコードを各ゲノムのペア間を許可する > シーケンスする 50,000 の単一細胞ごとに実行します。シーケンス データはバーコードで読み取り単一細胞由来のグループを生成する反多重送信します。単一セルの配列の高スループットと低バイアス方法として SiC seq は多様な細胞集団を対象としたゲノム研究の広い範囲を可能になります。

SiC seq 実験ワークフローでは、3 の PDMS マイクロ流体デバイス作製ソフト ・ リソグラフィー プロシージャ (図 1) を使用して含まれています。共同流 dropmaker (図 3 a) は、25 μ m の単一細胞意識付いている genomic DNA の分類のためのデジタル バーコード液滴を生成します。バーコード オリゴヌクレオチドは、PCR 増幅 (表 2、プライマー バー) のハンドルが並ぶ 15 bp 縮退シーケンスで構成されます。バーコードは、単一分子カプセル化を達成するためのフェムトモル濃度に希釈が、全て滴が 0 または 1 のいずれかのバーコード断片を受け取る。バーコードを含んでいる小滴が増幅され、二本鎖バーコード amplicons の多くのコピーを降伏します。核酸染色を使用して、成功の増幅を確認しバーコード フラグメント (図 4 b) のカプセル化率を定量化できます。Microgels は、細菌の細胞懸濁液と等しい流速 (図 2 a) で溶融 agarose のゲル流によって生成されます。共同流れ dropmaking プロセスは効果的に 2 の要因によって水溶液を希釈、agarose が目的の最終濃度 2 倍で用意しています。Agarose が冷えると、液滴の球の体積を占める 25 μ m 径マイクロジェルに固化します。
一連の洗浄および換散の手順は、microgels (図 2 b) における高分子量の DNA を浄化します。エマルションを破壊後水性洗浄トレースを下流の酵素治療を阻害することができる有機溶剤を希釈する大ボリュームで実行されます。洗浄 microgels は、細胞カプセル化率 (図 4 a) を確認するには顕微鏡の下で観察されます。幅広い溶菌活性を持つ酵素は、細菌や真核微生物19の細胞壁を消化するマイクロジェル サスペンションに追加されます。プロティナーゼ K と洗剤第 2 処置は蛋白質が低下し、可溶性細胞の残骸。
浄化された DNA の Tagmentation は水滴 microgels18の間の小さな tagmented DNA のフラグメントの拡散から生じる潜在的なクロス汚染を避けるために行われます。液滴封止のデバイス (図 3 b) 個人的各マイクロジェル同時にも"タグ付けしながら"それとプリロードされたオリゴヌクレオチド20二本鎖 DNA のフラグメント バッファーと tagmentation 酵素。Microgels は、いくつかダブレット21 (図 4) のすべてのドロップの 1 マイクロジェルに近づいているカプセル化率を達成するため、密充填粒子として水滴に読み込まれます。
マイクロ流体ワークフロー (図 2) の最後のステップでは、デバイスは 1 滴、バーコード、1 マイクロジェル含むドロップ制御段階で増幅ミックスを組み合わせることダブル合併操作を行います。まず、PCR 試薬を含む液滴がペアになって、黄色 (図 5) に示すように地域でバーコード ドロップを吸収合併します。マイクロ流路中で塩水の電極は、液滴の合併をトリガーする高電界勾配を生成します。同様の方法で最初のマージされた液滴はマイクロジェル液滴とペアになって、赤で示した地域で 2 番目の時間を吸収合併します。水滴は、収集され、熱循環シングル重複の拡張 (SOE) PCR のチップをオフ。バーコードと tagmented のゲノム DNA の重複の相補的な両端は融合とのみ正しくバーコード構造の指数関数的増幅を許可します。
シーケンス データの読み取り品質によって最初フィルターし、15 bp 単一セル バーコード順序に従って読み取りをグループ化して解析されます。有効と見なされるバーコードのグループ、それは読み取り; の最小数を含める必要があります。この閾値はシーケンス データの有用な量のセルに分析を制限し、データセットから PCR 変異バーコード「孤児」を削除します。このサンプルを実行すると、最小値はグループごとの 7.5 kbps に設定 (150 50 読み取り各 bp)。グループ サイズ対バーコード数のヒストグラムは、しきい値のサイズ (図 6 a) のすぐ上にある有効なバーコード グループの重要な部分を示しています。
微生物群集の組成は知られている制御実験、純度および相対的な豊かさの指標を使用して SiC seq の実行の品質を評価します。ここでは、3 グラム陰性細菌、5 グラム陽性菌および 2 酵母から成る合成 10 細胞社会を分析します。指定されたバーコード グループの純度は、グループに読み取りの合計数で割った値グループで最も一般的なゲノムへのマッピングの読み取りの数として定義されます。バーコード グループの大半はある純度 0.95 (図 6 b) より大きいです。細胞の種類の相対的な豊かさは、raw 読み取りをカウントすることによって、グループは、そのメンバーの読み取り (図 6) の合意に対応する携帯型を割り当て、バーコード グループを数えることによって計算されます。読み取りやバーコード グループの豊富な細胞集団がその特定の種が過度に小規模または大規模なバーコード グループに含まれていないサンプルされていることを示す、ほぼ等しい割合で追跡します。ほとんどまたはまったくドロップ アウト領域 (図 7) の全体のゲノム全体にわたる高いカバレッジを示します単一種からすべてのバーコード グループの集計範囲をプロットします。正規化された範囲値、平均値を中心としたほとんどの値の頻度分布とカバレッジの均一性を確認できます (図 7、挿入)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig1.jpg"> 図 1: フォトリソグラフィによるマイクロ流体デバイスの作製します。(A) マスター スピン コーティング シリコン ・ ウエハに SU 8 フォトレジスト層によって単一機能の高さと金型を作製します。フォトレジストは、フォトリソグラフィー マスクと紫外光、架橋露出 SU 8 模造されました。最後に、uncrosslinked SU 8 開発者風呂に溶解しています。結果の型を使用して、完全なマイクロ流体デバイスを生成するスライド ガラスに接合された PDMS をキャストします。(B) 二重層デバイスの製造は同様にスピン コーティングと露出の手順で開始します。これらの手順を繰り返します 2 層デバイスを作成します。<a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig2.jpg"> 図 2:SiC seq のワークフローの概要。(A) A 菌懸濁液は microgels 内の単一セルをカプセル化する dropmaker デバイスで溶融 agarose が付いて共同流れた。(B)、microgels は細菌のゲノム DNA を浄化する洗浄のシリーズにさらされます。溶菌酵素消化のグラム陽性菌や酵母、細胞壁と洗剤可溶性細胞の残骸。Microgels は、再交差汚染を減らすために tagmentation の液滴にカプセル化。(C) マイクロ合併を組み合わせたデジタル PCR バーコード、tagmented マイクロジェル ゲノム、率で増幅ミックス &gt; 1 kHz。オフチップ SOE PCR 継手 tagmented ゲノム上に一意の単一セルのバーコードとバーコードの構成要素を選択的に増幅完全に。<a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig3.jpg"> 図 3:Dropmaking、マイクロジェルの再封止用マイクロ流体デバイス。(A) このパネル共同流 dropmaker (機能の高さの 25 μ m) を示しています。25 μ x 25 μ m ジャンクション 25 μ m の液滴を生成する同じ流量でデバイスに細胞溶解アガロースを紹介します。デジタル バーコード dropmaking 携帯入口が差し込まれている、アガロース入口に PCR ミックスを導入します。(B) このパネルは、マイクロジェル再封止のデバイス (機能の高さの 25 μ m) を示しています。Microgels は稠密順序を維持し、25 μ x 30 μ m ジャンクションで再封止の前に tagmentation ミックスの量を受け取る漏斗状の口に流れ込みます。<a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig4.jpg"> 図 4: Microgels と液滴の顕微鏡写真です。(A) このパネル洗浄酵素溶解前に 25 μ m の microgels を示しています。細菌は、カプセル化率の定量化のため蛍光染色します。ポアソン統計を読み込むセルが 10 で 1 滴の割合でカプセル化されたまたは複数カプセル化イベントの頻度を最小限に抑える以下であることを指示します。(B) このパネルは核酸染色処理 25 μ m デジタル バーコード液滴の蛍光顕微鏡像を示しています。増幅バーコードの断片を含んでいる小滴は、強い蛍光信号を生成します。(C) このパネルは、50 μ m の水滴にカプセル化再 microgels を示しています。カプセル化に関しましてはいくつかダブレット 1 ドロップ 1 ゲル、microgels の近いパッキングが可能です。<a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig5.jpg"> 図 5: 単一細胞のゲノム バーコード二重合併マイクロ流体デバイス。2 段階合併操作高スループットで tagmented ゲノム バーコード液滴をペアします。PCR ミックスの液滴は最初生成され、塩水電極を用いた黄色で示されている地域でバーコードの水滴を吸収合併します。次に、マイクロジェルを含む液滴を導入し、赤で示した地域で 2 番目の時間を吸収合併します。オイルの入り江還元液滴間の間隔の正確な制御を可能にします。バーコード還元チャンバーとそのスペーサーの油は、青の網かけ、短い 25 μ m レイヤーに配置されます。他のすべてのデバイスの機能は、全体の高さの 45 μ m 厚い層に属しています。<a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig6.jpg"> 図 6: 10 セル合成微生物群集のバーコード グループ メトリック。(A) このパネルは、バーコードの配布グループのサイズを示します。指定したサイズのグループの数は、グループのサイズが増加するにつれて指数的に減少します。グループごとの 7.5 kbps の最小しきい値解析に十分な情報量を持つグループを制限し、PCR 変異シーケンス「孤児」を削除します(B) このパネルは、バーコードの配布グループ純度を示しています。大半 (&gt; 90%) のグループは非常に高純度 (&gt; 95%)。(C) このパネルは、読み取りとバーコードのグループ レベルで計算された 10 種の相対的な豊かさを示しています。類似結果のバーコード グループ サイズが種を越えた一貫性のあることを示すがカウントは 2。<a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig7.jpg"> 図 7: のゲノムのカバレッジを集計枯草菌バーコード グループ。枯草菌へのマッピングのすべてのバーコード グループからの読み取り (N = 9,398) がプールされて、集計分析しました。円形カバレッジ マップは、SiC シーケンシャル ・ リード数、ない観察可能なドロップ アウト領域のカバレッジの均一性を示しています。まわりを点線を示します平均カバレッジ (5.55 x)。相対被度周波数のはめ込みヒストグラムは、基地の大部分がゲノム全体の平均に近い深さで覆われていることを示しています、破線で表されます。<a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>デバイス</td>
			<td>第 1 層の高さ (μ m)</td>
			<td>第 1 レイヤーの回転速度 (rpm)</td>
			<td>第 2 レイヤーの高さ (μ m)</td>
			<td>第 2 レイヤーの回転速度 (rpm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>共同流れ dropmaker</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>ゲル再エンキャプスレータ</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>ダブルの合併</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>20</td>
			<td>5000</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: マイクロ流体デバイス作製パラメーター 。次の表は、(SU 8 3025、製造元の仕様に基づいて) フォトレジスト スピン コーティングのための彼らの必要な速度の SiC シーケンシャル ワークフローで使用されるマイクロ流体デバイスの一覧を示します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ラベル</td>
			<td colspan="5">シーケンス (5' &gt; 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>バー</td>
			<td colspan="5">GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA_BAR</td>
			<td colspan="5">CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>P7_BAR</td>
			<td colspan="5">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>P5_DNA</td>
			<td colspan="5">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>I7_READ</td>
			<td colspan="5">GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: プライマー シーケンスします。
補足ファイル 1:<a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_1-SiC-seq_device_masks.dwg" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足ファイル 2:<a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_2-centrifuge_syringe_holder_1mL.dwg" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

単一セル配列は生物学的システムにおける遺伝的異質性を明らかに、現在の技術は群集組成と機能の深いプロファイリングに必要なスループットを欠けています。ここでは、配列のためのマイクロ流体ワークフローについて述べる > 多様なから 50,000 の単一細胞ゲノム細胞群。

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

この実験の全体的な目標は、一連のマイクロ流体デバイスを使用して、数万の単一細胞からバーコード化されたゲノムシーケンシングデータを生成することです。この方法により、比類のないシングルセルシーケンシングスループットが達成されます。マイクロ流体工学を使用して、細胞を個別にカプセル化、溶解、およびバーコード化し、シーケンシング研究における従来のショックでは失われる基礎となるゲノムの不均一性を維持します。この手法の主な利点は、ハイスループットであり、数万の細胞からシングルセルデータを生成できることです。このデモンストレーションでは微生物を使用していますが、マイクロ流体デバイスの寸法を少し変更することで、ワークフローをさまざまな細胞タイプで使用できるように適応させることができます。プロトコールを開始するには、1体積あたり3%の重量の1ミリリットルの低融点アガロースを1X Tris-EDTA(TE)バッファーに調製します。アガロース溶液をシリンジが装填されるまで、摂氏90度のヒートブロックに保ちます。1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に細胞を再懸濁し、細胞を回転させます。上清を吸引し、細胞ペレットをPBSの体積密度勾配培地への17%容量の1ミリリットルに再懸濁し、シリンジがロードされるまで細胞を氷上に保ちます。次に、3ミリリットルのシリンジに、重量あたり2%の重量PFPE-PEG界面活性剤を含むフッ素化油(HFE)をロードします。27ゲージの針をはめ込み、シリンジポンプに入れます。細胞懸濁液と溶融したアガロースを、どちらも27ゲージの針が適合する1ミリリットルのシリンジにロードし、シリンジポンプに入れます。次に、スペースヒーターを高に設定し、加熱面をシリンジから10センチ離して配置します。シリンジで測定された温度が摂氏約80度であることを確認してください。チューブをデバイスに挿入する前に、ポンプをプライミングしてラインから空気を抜きます。ポリエチレン(PE)チューブを使用して、シリンジ針をマイクロ流体デバイスの入口に接続します。チューブをコンセントに接続し、自由端を15ミリリットルのコレクションチューブに入れます。液滴後、収集チューブを摂氏4度で30分間置き、アガロースが完全にゲル化するようにします。アガロース液滴の最上層を乱さないように注意しながら、20ゲージの針を取り付けた3ミリリットルのシリンジを使用して、収集チューブから下層のオイルを取り除きます。HFE中の1体積あたり10%の容量のPFOを1ミリリットル加えて、界面活性剤層からアガロース滴を分解します。溶液を1分間上下にピペットで動かし、均一で固まりのないエマルジョンを完全にコーティングします。コニカルチューブを2, 000倍gで1分間回転させて、アガロースマイクロゲルを収集します。PFO/HFE上清を吸引し、マイクロゲルに界面活性剤層がなく、透明であることを確認します。マイクロゲルを洗浄した後、10マイクロリットルのゲルを1X核酸染色で染色することにより、400倍の倍率で顕微鏡下でマイクロゲル内の細胞カプセル化を確認します。コフロードロップメーカーデバイスのセルインレットを小さなリードはんだで塞ぎます。チューブをデバイスに挿入する前に、ポンプをプライミングしてラインから空気を抜きます。チューブをコンセントに接続し、自由端を0.2ミリリットルのPCRチューブに入れます。画面上の流量を使用して液滴製造を行います。各チューブに約50マイクロリットルの滴を入れて、滴をPCRチューブに集めます。液滴製造後、ゲルローディングピペットチップを使用してエマルジョンからHFEオイルの下層を慎重に除去し、重量あたり5%の重量PFPE-PEG界面活性剤を含むFC-40フッ素化オイルと交換します。次に、熱サイクルをプログラムします。チューブをデバイスに挿入する前に、ポンプをプライミングしてラインから空気を抜きます。HFE、タグメンテーションミックス、およびマイクロゲルを含むシリンジを、PEチューブを使用してマイクロ流体デバイスインレットに接続します。チューブの一部をコンセントに接続し、プランジャーを1ミリリットルのラインに引いた状態で、フリーエンドを空の1ミリリットルシリンジに入れます。次に、マイクロゲルのカプセル化率を光学顕微鏡で400倍の倍率で確認します。タグメンテーションエマルジョンの入ったシリンジに針をはめ込み、ヒートブロックまたはオーブンで55°Cの1時間直立させてゲノムDNAを断片化します。FC-40オイル画分を重量PFPE-PEGあたりのHFE 2%重量に交換して、合併用のバーコード液滴を準備します。滴を1ミリリットルのシリンジに慎重に移し、針で取り付け、シリンジポンプに入れます。インキュベートしてタグ付けしたマイクロゲル液滴シリンジをシリンジポンプにロードします。次に、PEチューブを使用して、3つの塩化ナトリウムシリンジを2つの電極入口と1つの堀入口に接続します。チューブをデバイスに挿入する前に、ポンプをプライミングしてラインから空気を抜きます。ポンプに取り付けられた3つのHFEシリンジを、PEチューブのピースを使用して2つのスペーサーオイルインレットとドロップメイキングオイルインレットに接続します。次に、チューブをシリンジ針に接続する前に、すべての液滴再注入チューブを帯電防止ガンで撃ちます。PCR ミックスシリンジ、マイクロゲルドロップシリンジ、バーコードドロップシリンジを PE チューブでそれぞれのインレットに接続します。電極シリンジの針をワニ口クリップを使用して冷陰極蛍光インバーターに接続します。インバータのDC電源を2ボルトに設定します。ダブルマージャー装置を推奨流量で運転します。各チューブに約50マイクロリットルのエマルジョンを入れたPCRチューブに滴を集めます。サーマルサイクルの前に、ゲルローディングピペットチップを使用してエマルジョンからHFEオイルの下層を慎重に除去し、重量あたり5%の重量PFPE-PEG界面活性剤を含むFC-40フッ素化オイルと交換します。次に、サイクルをプログラムします。熱サイクル液滴からDNAを回収するには、液滴を微量遠心チューブにプールし、20マイクロリットルのPFOを使用してエマルジョンを切断します。それらを10秒間渦巻きにして混ぜます。チューブを回転させます。ピペットを使用してチューブから上部の水性層を慎重に取り除き、新しい微量遠心チューブに移します。油相を廃棄します。次に、ライブラリの調製、シーケンシング、および解析のステップに進みます。バーコード数とグループサイズのヒストグラムは、有効なバーコードグループのかなりの部分が、PCR 変異孤児を除外したグループあたり 7.5 キロベースペアのしきい値サイズをわずかに上回っていることを示しています。3つのグラム陰性菌、5つのグラム陽性菌、および2つの酵母からなる合成10細胞群からの細胞タイプの相対存在量は、生の読み取りとバーコードグループをカウントすることによって計算されました。すべてのバーコードグループから読み取られたB.subtilisの円形カバレッジマップは、観察可能なドロップアウト領域がなく、平均カバレッジが5.55倍であったSiC-seqリードの均一性を示しています。カバレッジの均一性は、正規化されたカバレッジ値の度数分布で検証されました。この手順を試行する際は、液滴 10 個ごとに約 1 個のバーコードまたはセルのカプセル化速度を維持することが重要です。これにより、シングルセルデータを畳み込む可能性のある二重カプセル化イベントの可能性が制限されます。このビデオを見れば、シングルセルシーケンシングデータの生成に使用されるマイクロ流体デバイスのセットアップ方法と操作方法について十分に理解できるはずです。一度習得すれば、このテクニックは8時間または4時間の日2日で実行できます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ここでは、サンプルの限られた量を扱う場合は特に、マイクロRNA（miRNA）の発現レベルのコストと時間効果のハイスループットスクリーニングのツールと​​してのマイクロ流体プラットフォームとの組み合わせで最適化された多重逆転写定量PCR（定量RT -...

ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR

我々は、タンパク質配列の発現のためのマイクロ流体アプローチを提示する。デバイスは、マイクロメカニカルバルブで制御される反応室の数千から構成されています。マイクロ流体デバイスは、マイクロアレイプリント遺伝子ライブラリーに釣り合わせられる。これらの遺伝子は、その後、実験的な使用のための準備ができたタンパク質配列で、その結果、チップ上に転写され、翻訳されています。...

マイクロ流体プラットフォームを使用した高スループットのタンパク質発現ジェネレータ

我々は、マイクロスケール細胞刺激実験のために自動細胞培養と尋問プラットフォームを開発した。プラットフォームは、栽培と細胞の小集団を刺激し、分子解析のための溶解物の回収で、シンプルで汎用性の高い、かつ正確なコントロールを提供しています。プラットフォームはよく貴重な細胞および/または試薬を使用した研究に適しています。...

マイクロスケール細胞刺激のための実験のための多目的自動化プラットフォーム

この記事では、単一細胞解析のためのマイクロ流体チップを提示する。これは、蛍光アッセイまたはイムノアッセイによって細胞内タンパク質、酵素、補因子、およびセカンドメッセンジャーの定量化を可能にする。...

単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

このプロトコルは、マイクロ流体デバイスを使用して自動化された小容量(0.15–1.5...

マイクロ流体精密小容量サンプル処理のためのプラットフォームとアコースティックマイクロデバイスで区切り生物学的粒子サイズのためのその使用

ここでは、高効率のシングルセルの単離と長期のクローン培養を可能にする新しいマイクロウェル設計コンセプトを利用したマイクロ流体プラットフォームを使用して、単一細胞を分離および培養するためのプロトコルを紹介します。...

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

ナノポアシーケンシングは、遠隔地でのコスト効率の高いシーケンシングと、リソースの乏しい設定を可能にする新しいテクノロジーです。ここでは、このような条件に適合する全血からの mRNAs...

ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

PDMSベースの多層、マイクロ流体デバイスの製造プロセスは、インビトロ転写および翻訳(IVTT)反応を長期間にわたって行うことを可能にする。さらに、これらの反応を長期間自動化および維持するために必要なハードウェアとソフトウェアの包括的な概要を提供します。...

長期無細胞遺伝子発現の伝導のための多層マイクロ流体プラットフォーム

成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。...

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

1500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプの配列、オンサイトミキシングモジュラスから構成される複雑な寿命機械の高スループット研究のためのマイクロ流体システムを発表します。マイクロ流体チップは、生体内の非常に複雑で動的な微小環境条件の解析を可能にします。...

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

マイクロ流体ベースのハイスループット循環腫瘍細胞選別およびシングルセルシーケンシング技術

学ぶ マイクロ流体デバイスを用いた単一細胞ゲノム配列解析の手法。数万個の細胞を個別に封入・バーコード化し、ゲノム異質性を保持しながら超高スループットなシーケンスデータを生成する革新的なワークフローです。

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループットマイクロ流体プラットフォーム

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単一細胞のゲノムの配列のための超高スループット マイクロ流体プラットフォーム

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