単一細胞のゲノムの配列のための超高スループット マイクロ流体プラットフォーム

この実験の全体的な目標は、一連のマイクロ流体デバイスを使用して、数万の単一細胞からバーコード化されたゲノムシーケンシングデータを生成することです。この方法により、比類のないシングルセルシーケンシングスループットが達成されます。マイクロ流体工学を使用して、細胞を個別にカプセル化、溶解、およびバーコード化し、シーケンシング研究における従来のショックでは失われる基礎となるゲノムの不均一性を維持します。

この手法の主な利点は、ハイスループットであり、数万の細胞からシングルセルデータを生成できることです。このデモンストレーションでは微生物を使用していますが、マイクロ流体デバイスの寸法を少し変更することで、ワークフローをさまざまな細胞タイプで使用できるように適応させることができます。プロトコールを開始するには、1体積あたり3%の重量の1ミリリットルの低融点アガロースを1X Tris-EDTA(TE)バッファーに調製します。

アガロース溶液をシリンジが装填されるまで、摂氏90度のヒートブロックに保ちます。1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に細胞を再懸濁し、細胞を回転させます。上清を吸引し、細胞ペレットをPBSの体積密度勾配培地への17%容量の1ミリリットルに再懸濁し、シリンジがロードされるまで細胞を氷上に保ちます。

次に、3ミリリットルのシリンジに、重量あたり2%の重量PFPE-PEG界面活性剤を含むフッ素化油(HFE)をロードします。27ゲージの針をはめ込み、シリンジポンプに入れます。細胞懸濁液と溶融したアガロースを、どちらも27ゲージの針が適合する1ミリリットルのシリンジにロードし、シリンジポンプに入れます。

次に、スペースヒーターを高に設定し、加熱面をシリンジから10センチ離して配置します。シリンジで測定された温度が摂氏約80度であることを確認してください。チューブをデバイスに挿入する前に、ポンプをプライミングしてラインから空気を抜きます。

ポリエチレン(PE)チューブを使用して、シリンジ針をマイクロ流体デバイスの入口に接続します。チューブをコンセントに接続し、自由端を15ミリリットルのコレクションチューブに入れます。液滴後、収集チューブを摂氏4度で30分間置き、アガロースが完全にゲル化するようにします。

アガロース液滴の最上層を乱さないように注意しながら、20ゲージの針を取り付けた3ミリリットルのシリンジを使用して、収集チューブから下層のオイルを取り除きます。HFE中の1体積あたり10%の容量のPFOを1ミリリットル加えて、界面活性剤層からアガロース滴を分解します。溶液を1分間上下にピペットで動かし、均一で固まりのないエマルジョンを完全にコーティングします。

コニカルチューブを2, 000倍gで1分間回転させて、アガロースマイクロゲルを収集します。PFO/HFE上清を吸引し、マイクロゲルに界面活性剤層がなく、透明であることを確認します。マイクロゲルを洗浄した後、10マイクロリットルのゲルを1X核酸染色で染色することにより、400倍の倍率で顕微鏡下でマイクロゲル内の細胞カプセル化を確認します。

コフロードロップメーカーデバイスのセルインレットを小さなリードはんだで塞ぎます。チューブをデバイスに挿入する前に、ポンプをプライミングしてラインから空気を抜きます。チューブをコンセントに接続し、自由端を0.2ミリリットルのPCRチューブに入れます。

画面上の流量を使用して液滴製造を行います。各チューブに約50マイクロリットルの滴を入れて、滴をPCRチューブに集めます。液滴製造後、ゲルローディングピペットチップを使用してエマルジョンからHFEオイルの下層を慎重に除去し、重量あたり5%の重量PFPE-PEG界面活性剤を含むFC-40フッ素化オイルと交換します。

次に、熱サイクルをプログラムします。チューブをデバイスに挿入する前に、ポンプをプライミングしてラインから空気を抜きます。HFE、タグメンテーションミックス、およびマイクロゲルを含むシリンジを、PEチューブを使用してマイクロ流体デバイスインレットに接続します。

チューブの一部をコンセントに接続し、プランジャーを1ミリリットルのラインに引いた状態で、フリーエンドを空の1ミリリットルシリンジに入れます。次に、マイクロゲルのカプセル化率を光学顕微鏡で400倍の倍率で確認します。タグメンテーションエマルジョンの入ったシリンジに針をはめ込み、ヒートブロックまたはオーブンで55°Cの1時間直立させてゲノムDNAを断片化します。

FC-40オイル画分を重量PFPE-PEGあたりのHFE 2%重量に交換して、合併用のバーコード液滴を準備します。滴を1ミリリットルのシリンジに慎重に移し、針で取り付け、シリンジポンプに入れます。インキュベートしてタグ付けしたマイクロゲル液滴シリンジをシリンジポンプにロードします。

次に、PEチューブを使用して、3つの塩化ナトリウムシリンジを2つの電極入口と1つの堀入口に接続します。チューブをデバイスに挿入する前に、ポンプをプライミングしてラインから空気を抜きます。ポンプに取り付けられた3つのHFEシリンジを、PEチューブのピースを使用して2つのスペーサーオイルインレットとドロップメイキングオイルインレットに接続します。

次に、チューブをシリンジ針に接続する前に、すべての液滴再注入チューブを帯電防止ガンで撃ちます。PCR ミックスシリンジ、マイクロゲルドロップシリンジ、バーコードドロップシリンジを PE チューブでそれぞれのインレットに接続します。電極シリンジの針をワニ口クリップを使用して冷陰極蛍光インバーターに接続します。

インバータのDC電源を2ボルトに設定します。ダブルマージャー装置を推奨流量で運転します。各チューブに約50マイクロリットルのエマルジョンを入れたPCRチューブに滴を集めます。

サーマルサイクルの前に、ゲルローディングピペットチップを使用してエマルジョンからHFEオイルの下層を慎重に除去し、重量あたり5%の重量PFPE-PEG界面活性剤を含むFC-40フッ素化オイルと交換します。次に、サイクルをプログラムします。熱サイクル液滴からDNAを回収するには、液滴を微量遠心チューブにプールし、20マイクロリットルのPFOを使用してエマルジョンを切断します。

それらを10秒間渦巻きにして混ぜます。チューブを回転させます。ピペットを使用してチューブから上部の水性層を慎重に取り除き、新しい微量遠心チューブに移します。

油相を廃棄します。次に、ライブラリの調製、シーケンシング、および解析のステップに進みます。バーコード数とグループサイズのヒストグラムは、有効なバーコードグループのかなりの部分が、PCR 変異孤児を除外したグループあたり 7.5 キロベースペアのしきい値サイズをわずかに上回っていることを示しています。

3つのグラム陰性菌、5つのグラム陽性菌、および2つの酵母からなる合成10細胞群からの細胞タイプの相対存在量は、生の読み取りとバーコードグループをカウントすることによって計算されました。すべてのバーコードグループから読み取られたB.subtilisの円形カバレッジマップは、観察可能なドロップアウト領域がなく、平均カバレッジが5.55倍であったSiC-seqリードの均一性を示しています。カバレッジの均一性は、正規化されたカバレッジ値の度数分布で検証されました。

この手順を試行する際は、液滴 10 個ごとに約 1 個のバーコードまたはセルのカプセル化速度を維持することが重要です。これにより、シングルセルデータを畳み込む可能性のある二重カプセル化イベントの可能性が制限されます。このビデオを見れば、シングルセルシーケンシングデータの生成に使用されるマイクロ流体デバイスのセットアップ方法と操作方法について十分に理解できるはずです。

一度習得すれば、このテクニックは8時間または4時間の日2日で実行できます。