出芽酵母の複製寿命の測定

出芽酵母Croce Visiは、老化の生物学を研究するために広く使用されてきました。この記事では、酵母母細胞の複製寿命を測定するための一般的なプロトコルを紹介します。こんにちは、ワシントン大学生化学科のブライアン・ケネディ研究室のクリステン・ステフェンです。

今日は、酵母母細胞の複製寿命を測定する手順を紹介します。私たちの研究室では、この手順を用いて、酵母細胞の寿命に影響を与える遺伝子を研究しています。それでは始めましょう。

複製寿命実験や寿命解析のための酵母細胞の調製には、固体YEPDプレートを用意する必要があります。適切な滅菌技術を使用して、これらのYEPD寒天プレートを調製します。寿命実験で解析する4〜5株ごとに、少なくとも2枚のプレートを用意してください。

これらのプレートは、寿命実験の少なくとも2日前に調製し、寿命アッセイを開始する前に乾燥させる必要があります。プレートを注いでから4〜5日以内に実験が行われない場合は、プレートをパラフィルムまたはプラスチックで包み、乾燥を防ぐために冷蔵インキュベーターに置く必要があります。凍結ストックから酵母株を取り除き、単一のコロニーにストリークします。

YEPD寒天プレートに載せます。プレートを同じサイズのパイ型のくさびに分割することにより、同じYEPDプレート上に最大6つの株を簡単に縞模様にすることができます。細胞を摂氏30度で2日間インキュベートします。

インキュベーション後、インキュベーターから細胞を取り出し、単一のコロニーから細胞を新しいYEPDプレートにパッチします。このとき、解析する菌株をコーティングして、再現寿命実験がブラインドで実行されるようにする必要があります。ディセクタが個々の系統の正体を知らない場合。鎖。

次に、パッチを当てたコーティング細胞を摂氏30度で翌日の夕方までインキュベートします。細胞を取り出し、コーティングされた各菌株の細胞を新しいYEPDプレートに軽くパッチします。これらは、複製寿命に使用される実験プレートとして機能します。

解析セルは、YEPDプレートの左側にある垂直線に沿ってパッチする必要があります。1つの新鮮なYEPDプレートに多くの細胞を移しすぎないでください。これにより、一晩のインキュベーション中に細胞が厚く成長し、その複製寿命に影響を与えるため、プレートあたり約3〜5個のパッチが最適です。

複製寿命分析が各パッチの20個の細胞で実行されると仮定すると、寿命実験はすべて設定され、彼らがしなければならないのはベンチトップで一晩インキュベートすることだけです。そして明日、私たちはマイクロ解剖を開始することができます 酵母細胞をプレートに配置し、処女娘細胞を取得します。複製寿命解析用。

酵母に適したマイクロ解剖装置を備えた顕微鏡を使用してください。第1のパッチ株から約50個の細胞を、パッチされた細胞に対して遠位のプレート上の位置に移します。顕微鏡のステージがグレーディングされている場合、これらのグラデーションを使用して、その後の反復で細胞を見つけやすくすることができます。

細胞が針に引っかかってしまうことがあり、間違ったタイミングで出てくると問題になる可能性があります。針がきれいで細胞がないことを確認するには、寒天表面に繰り返し触れます。次に、針を寒天の表面に押し込んで、寒天に穴を開けます。

この穴は、その後の解剖とドッターセルの除去の反復中にプレート上での向きを示すマーカーとして機能します。穴に酵母細胞が入らないように注意してください、さもなければそれらは穴の真上に成長してコロニーを形成します。個々の酵母細胞を20の等間隔の位置に垂直に整列させ、各細胞位置の間に1〜3本の針径を挟みます。

数個のセルごとに、2 つのセルを 1 つではなく、行内の同じ位置に並べて配置します。これにより、バージンドーターセルの選択中に冗長性を確保できます。転送されたセルの1つがラインの10番目と11番目の位置の間で分割できない場合は、寒天に7〜8個の穴を水平に連続して作成します。

これは、その後の解剖やドーター細胞の除去時にプレート上での向きを示すマーカーとして機能します。繰り返しになりますが、穴に酵母細胞が入らないように注意してください。そうしないと、酵母細胞が成長してコロニーを形成します。プレート上の各パッチについてこの手順を繰り返し、同じ軸に沿って細胞を垂直に配列し続けます。

AERに穴を作成するときは、作成される穴の数がパッチ番号に対応しているため、最初のパッチには1つの穴があり、2番目のパッチには2つの穴があることを覚えておくことが重要です。各パッチに細胞を配列したら、プレートをパラフォーミングし、摂氏30度で約2時間インキュベートします。この時点から、解剖を受ける場合を除いて、すべてのプレートをパラフィルムする必要があることを忘れないでください。

乾燥を防ぐために、この手順をプレートごとに繰り返します。実験で。寿命解析では、各セルが処女娘細胞として開始することを確認することが重要です。

これを行うには、最初にインキュベーターからプレートを取り外し、アレイ細胞のほとんどが細胞分裂を起こしたことを確認します。ここにあるのは、以前に整列した細胞で、インキュベーターで2時間後には分裂し始めていることがわかります。そして今、私たちは母細胞を持っています、その体に付着している大きい方、処女娘細胞、そしてその処女娘細胞は寿命を始めるために使用される細胞です。

細胞分裂が完了するまでにさらに時間が必要な場合は、プレートをインキュベーターに戻します。最初の配列セルから開始します。針を使用して、付着した細胞の上に針をそっと置くことにより、娘細胞を母細胞から分離します。

針が細胞に載っている間に顕微鏡ベースの側面を軽くたたいてみるのが役立つ場合があります。次に、分離したドーターセルをセルの垂直線に配置し、マザーセルと追加のドーターセルを置き換え、それらを一時的に脇に移動します。配列セルごとにこれらの手順を繰り返します。

セルの分割に失敗した場合は、テストセルの隣にある冗長セルの 1 つから娘セルを取り出します。終了すると、各パッチに 20 個のドーター セルがライフスパン プレート上に垂直に整列されます。すべての母細胞と余分な娘細胞を山に集め、墓地と呼ばれるパッチの近くのエリアに戻します。

マイクロコロニーの形成や局所的な栄養素の枯渇を防ぐために、寿命分析を受けている細胞から不要な細胞を遠ざけることが重要です。細胞が分離されたら、プレートからパラを動かし、摂氏30度で約2時間インキュベートします。実験の各プレートについて、これらのステップを繰り返します。

個々のセルの複製容量を測定するには、寿命データシートを準備する必要があります。ライフスパンデータシートは、各行が個々の母細胞に対応し、各列が経過時間に対応する単純なグリッドにすることができます。各データシートには、解析する菌株の数に応じたラベルを貼ってください。

まず、インキュベーターからプレートを取り出し、ほとんどのアレイ細胞が少なくとも1回の細胞分裂を起こしたことを確認します。細胞分裂が完了するまでにさらに時間が必要な場合は、プレートをインキュベーターに戻します。最初のプレート上の最初のアレイセルから始めて、母と娘、細胞または細胞を視覚的に観察して、発生した細胞分裂の数を決定します。

一般に、細胞配置の特徴的なパターンに基づいて、母親が産生した娘細胞の数を簡単に判断できます。これは、そこに2つあり、それらは同じサイズで、どちらも母親よりも小さいため、どれだけの細胞を生成したかを確認するのは非常に簡単です。母細胞によって生成された娘細胞の数を、寿命スコアシートの適切なボックスに記録します。

次に、針を付着した細胞の上にそっと置き、針が細胞に載っている間に顕微鏡ベースの側面を軽くたたいて、前述のように針を使用して母細胞から娘細胞を分離します。母細胞を垂直線の位置に保ち、娘細胞を一時的に脇に移動します。配列セルごとにこれらの手順を繰り返します。

最後に、捨てられた娘細胞をすべて集めて、元のパッチの近くにある墓地に移動します。プレートをパラフィルムし、摂氏30度で2〜3時間インキュベートします。娘細胞の廃棄とインキュベーションを繰り返します。

実験の各プレートのステップ。すべての母細胞の分裂が止まるまで、この手順全体を繰り返します。母細胞が老化すると、細胞周期の進行が遅くなり、その後、年齢のポイント間でプレートを長期間インキュベートすることが望ましいことに留意してください。

複製寿命実験によって生成された生データは、各年齢の時点で各母細胞によって生成された娘細胞に対応する数値のリストです。ここに示すように。スコアシートの各行を合計することにより、各母細胞の複製寿命が得られます。

同じ実験群の他の細胞からのデータをプールして、生存曲線を生成し、統計計算を実行することができます。この曲線は、Gomperts Mac amの動力学とほぼ一致しており、シグモイド形状を示し、早期死亡率が低く、その後、生存率が比較的急速に低下し、後の年齢で曲線が平坦化します。ここまで、酵母の複製寿命実験を行う方法をお見せしました。

この手順を実行するときは、細胞が寒さにないときはいつでも分裂し続けることを覚えておくことが重要です。したがって、プレートを一晩中4度に置いて、朝に数えるのに娘細胞が多すぎないようにすることを忘れないでください。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。