出芽酵母の複製寿命の測定

出芽酵母のCroce Visiは、老化の生物学を研究するために広く利用されてきました。本記事では、酵母母細胞の複製寿命を測定するための一般的なプロトコルを紹介します。こんにちは。私はワシントン大学生化学科のBrian Kennedy研究室のKristen Steffenです。

本日は、酵母母細胞の複製寿命を測定する手順をご紹介します。当研究室では、酵母細胞の寿命に影響を与える遺伝子を研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。

複製寿命実験および寿命解析用の酵母細胞の調製には、YEPD固体培地プレートを準備する必要があります。適切な無菌操作を用いて、これらのYEPDアガープレートを調製してください。寿命実験で解析する4〜5株につき、少なくとも2枚のプレートを準備してください。

これらのプレートは、寿命実験の少なくとも2日前に準備し、寿命アッセイを開始する前に乾燥させておく必要があります。プレートを注いでから4〜5日以内に実験を行わない場合は、乾燥を防ぐため、パラフィルムまたはプラスチックで包み、冷蔵インキュベーターに入れて保存してください。凍結保存ストックから酵母菌株を取り出し、単一コロニーが得られるようにストリークします。

YEPD寒天プレートに塗布します。プレートを等しい大きさのパイ状に分割することで、最大6株まで同一のYEPDプレートにストリークすることができます。細胞を30 °Cで2日間培養します。

インキュベーション後、細胞をインキュベーターから取り出し、単一のコロニーから新しいYEPDプレートに細胞をパッチします。この際、複製寿命試験をブラインドで行うため、解析対象の菌株をコーティングしておく必要があります。これにより、分取者が個々の菌株の正体を把握できないようにします。

次に、パッチ塗布したコート細胞を30 °Cで翌日の夕方までインキュベートします。細胞を取り出し、各コート株の細胞を新しいYEPDプレートに軽くパッチ塗布します。これらが、複製寿命の測定に使用する実験用プレートとなります。

解析用細胞は、YEPDプレートの左側に沿って垂直線上にパッチして配置します。1枚の新しいYEPDプレートに過剰な細胞を転写しないでください。細胞数が多すぎると、一晩の培養中に細胞が過剰に増殖し、複製寿命に影響を与えるため、1プレートあたり約3〜5パッチとするのが最適です。

各パッチから20個の細胞を用いて複製寿命解析を行うこととし、これで寿命実験の準備がすべて整いました。あとはベンチトップで一晩インキュベートするだけです。そして明日、酵母細胞をプレート上に配置し、複製寿命解析のための処女娘細胞を回収するためのマイクロダイセクションを開始します。

酵母に適したマイクロディセクション装置を備えた顕微鏡を使用します。最初のパッチ株から約50個の細胞を、プレート上のパッチした細胞から離れた位置に転移させます。顕微鏡ステージに目盛がある場合は、その目盛りを利用することで、その後の反復操作時に細胞を容易に見つけることができます。

細胞が針に付着してしまうことがあり、不適切なタイミングで脱落すると問題となる場合があります。針が清潔で細胞が付着していないことを確認するため、寒天表面に繰り返し接触させてください。その後、針を寒天表面に押し込み、寒天に穴を開けます。

この穴は、その後の解剖およびドッターによる細胞除去の繰り返し操作において、プレート上の位置を特定するためのマーカーとして機能します。穴の中に酵母細胞が入らないように注意してください。入ってしまうと、穴の直上で細胞が増殖し、コロニーを形成してしまいます。個々の酵母細胞を垂直に整列させ、細胞位置間に針の直径1〜3本分相当の間隔を空けて、20箇所の等間隔な位置に配置します。

数個の細胞ごとに、列の同じ位置に1個ではなく2個の細胞を隣り合わせに配置します。これにより、処女娘細胞の選別時に冗長性を確保できます。移殖した細胞のいずれかが列の10番目から11番目の位置の間で分裂しなかった場合は、アガーに7〜8個の穴を水平に並べて作成します。

これは、その後の解剖および娘細胞の除去において、プレート上の位置を確認するためのマーカーとして機能します。ここでも、酵母細胞が穴に入らないように注意してください。細胞が入ると増殖してコロニーを形成してしまいます。プレート上の各パッチに対してこの手順を繰り返し、同じ軸に沿って細胞を垂直に配列させていきます。

AERに穴を開ける際は、パッチ番号に合わせて穴の数を設定することが重要です。具体的には、最初のパッチには1つの穴を、2番目のパッチには2つの穴を開けます。各パッチに細胞を配列させた後、プレートにパラフィルムを貼り、30 °Cで約2時間インキュベートします。ここから先は、解剖操作を行う場合を除き、すべてのプレートにパラフィルムを貼付しておくようにしてください。

乾燥を防ぐため、各プレートについてこの手順を繰り返します。実験において、寿命解析を行う際は、各細胞が必ず処女娘細胞として開始するようにすることが重要です。

まず、プレートをインキュベーターから取り出し、アレイ細胞の大部分が細胞分裂を起こしていることを確認します。ここでは、以前に整列させた細胞がありますが、インキュベーター内で2時間経過した後、細胞が分裂し始めていることがわかります。ここで、大きな方の母細胞と、それに付着している処女娘細胞が確認できます。この処女娘細胞を、寿命測定の開始細胞として使用します。

細胞分裂を完了させるためにさらに時間が必要な場合は、プレートをインキュベーターに戻してください。最初のアレイ細胞から開始します。針を付着した細胞の上にそっと置き、娘細胞を母細胞から分離させます。

ニードルを細胞の上に置いた状態で、顕微鏡ベースの側面を軽く叩くと効果的な場合があります。次に、切り離した娘細胞を、母細胞および追加の娘細胞があった垂直方向の細胞列に配置し、それらは一時的に脇へ移動させます。これらの手順を、アレイ内の各細胞について繰り返します。

細胞分裂が起こらなかった場合は、テスト細胞の隣にある予備細胞から娘細胞を1つ採取してください。完了後、寿命測定プレート上の各パッチに対して、垂直に並んだ20個の娘細胞が確保されているはずです。すべての母細胞と余分な娘細胞をまとめて、パッチ付近にある「墓場（graveyard）」と呼ばれる領域に移動させてください。

マイクロコロニーの形成や局所的な栄養分枯渇を防ぐため、寿命解析を行う細胞から不要な細胞を遠ざけておくことが重要です。細胞を分離させた後、プレートを30 °Cで約2時間インキュベートします。実験に使用する各プレートについて、これらの手順を繰り返します。

個々の細胞の複製能を測定するために、寿命データシートを準備する必要があります。寿命データシートは、各行が個々の母細胞に対応し、各列が年齢（世代）に対応する単純なグリッド形式で作成できます。解析する株数に応じて、各データシートに適切にラベルを付けてください。

まず、プレートをインキュベーターから取り出し、アレイ細胞の大部分が少なくとも1回の細胞分裂を経ていることを確認します。細胞分裂が完了するまでさらに時間が必要な場合は、プレートをインキュベーターに戻してください。最初のプレートの最初のアレイ細胞から順に、親細胞と娘細胞を視覚的に観察し、細胞分裂が何回行われたかを確認します。

一般的に、細胞配置の特徴的なパターンに基づいて、親細胞がいくつの娘細胞を産生したかを判断することは容易です。この例では、そこに2つの細胞があり、それらが同じ大きさで、かつどちらも親細胞より小さいため、産生された細胞数を非常に簡単に確認できます。親細胞によって産生された娘細胞の数を、寿命スコアシートの適切な欄に記録してください。

次に、前述の方法に従い、ニードルを用いて娘細胞を母細胞から切り離します。ニードルを付着した細胞の上にそっと置き、ニードルを細胞に当てたまま顕微鏡のベース側面を軽く叩きます。母細胞は垂直線上の位置に保持し、娘細胞を一時的に脇へ移動させます。これらの手順をアレイ内の各細胞に対して繰り返します。

最後に、除去したすべての娘細胞を回収し、元のパッチ付近に設けた墓場（グラビアード）へと移動させます。プレートをパラフィルムで密封し、30 °Cで2〜3時間インキュベートします。娘細胞の除去とインキュベートを繰り返します。

実験における各プレートの手順です。すべての母細胞が分裂を停止するまで、この全工程を繰り返します。母細胞が老化するにつれて細胞周期の進行が遅くなるため、以降の齢（age point）の間隔では、プレートをより長い時間インキュベートすることが望ましくなります。また、プレートを4 °Cで一晩保存することも可能です。

複製寿命実験によって得られる生データは、各年齢時点で各母細胞によって産生された娘細胞数に対応する数値のリストです。ここに示す通りです。スコアシートの各行を合計することで、各母細胞の複製寿命が得られます。

同一実験群の他の細胞からのデータを統合して、生存曲線を生成し、統計計算を行うことができます。曲線は概ねゴンペルツ・メイクハム（Gompertz-Makeham）動力学と一致し、初期の死亡率は低く、その後生存率が比較的急速に低下し、高齢になると曲線が平坦化するというシグモイド形状を示すはずです。以上で、酵母の複製寿命実験の実施方法について説明しました。

この手順を行う際は、細胞が低温下にない限り分裂し続けることを覚えておくことが重要です。そのため、翌朝に計数すべき娘細胞が過剰にならないよう、プレートを4°Cで一晩保存してください。以上で完了です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。