軸索損傷モデル用マイクロ流体チップの構築とマルチオミクス解析の実現

軸索損傷後のニューロンの代謝機構の解明を目的として、マルチオミクス解析を可能にする大型マイクロ流体チップを開発しました。主にマイクロ流体技術、代謝フラックス解析、トランスクリプトミクスを活用し、軸索損傷・再生におけるニューロンの代謝機構の研究を進めています。発達疾患の異なる皮質ニューロン間には代謝の違いがあり、若いニューロンは外傷後に代謝リモデリングを受けることがわかりました。

当社のプロトコルの主な利点は、正確なマルチオミクスと数百万の細胞のサイズを可能にする、大規模なマイクロ流体プラットフォームの設計と運用標準にあります。まず、PDMSベースと硬化剤を遠心分離管に移します。混合物の入った遠心分離管を遠心撹拌ミキサーに入れます。

2, 000 Gで4分間2回遠心分離して混合し、脱気します。脱気したPDMSを13〜15グラムをマイクロ流体金型に注ぎ、金型の底が完全に覆われていることを確認します。次に、金型を真空デシケーターに入れ、真空ポンプを使用して5〜10分間空気を排出し、PDMSから気泡を完全に除去します。

ゴム球を使用して、PDMSの表面を軽くたたき、残っている表面の気泡を壊します。型を対流式オーブンに移し、摂氏80度で100分間焼き、ポリジメチルシロキサンを硬化させます。PDMSが完全に硬化したら、メスの先端をPDMSの端の下にそっとスライドさせ、慎重に持ち上げて型から分離します。

直径2.0〜2.5ミリメートルの生検パンチを使用して、培地の注入と細胞ローディングのためにPDMSに穴を開けます。PDMSの表面の不純物を粘着テープで取り除き、清潔なガラス皿に入れ、アルミホイルで包んで保管します。実験の前に、マイクロ流体デバイスを摂氏121度、101キロパスカルで5分間オートクレーブして、無菌性を確保します。

従来のマイクロ流体デバイス用のカバースリップを35ミリメートルの培養皿に入れます。1ミリリットルあたり0.1ミリグラムのポリ-D-リジン溶液を2ミリリットルの皿に加えます。皿を摂氏37度で6時間または一晩インキュベートします。

インキュベーション後、ポリ-D-リジン溶液を慎重に回収し、再利用または適切に廃棄します。次に、2ミリリットルの滅菌超純水を皿に加えます。時計回りに50回回転させ、続いて反時計回りに50回回転させます。

滅菌ピペットチップに接続された真空ポンプを使用して水を吸引し、廃棄物を液体廃棄物容器に収集します。すべての洗浄が完了したら、使用前にカバースリップをバイオセーフティキャビネット内で自然乾燥させます。滅菌の細い先端鉗子を使用して、オートクレーブ滅菌したマイクロ流体チップをマイクロチャネルを下に向けてガラス表面の中央に置きます。

200 マイクロリットルのピペット チップを使用してチップをガラス表面にそっと押し付け、完全に密着します。次に、油性マーカーを使用して左側のチャンバーにドットを付け、体細胞コンパートメントを指定します。10マイクロリットルのピペットで10マイクロリットルのニューロン懸濁液を吸引し、次に懸濁液をマークされた体細胞コンパートメントの上のローディングポートにゆっくりと分注します。

左チャンバーの下部リザーバーへの適切な流体の流れを確認します。培養皿を摂氏37度、二酸化炭素5%に設定した加湿インキュベーターに20分間移します。インキュベーション後、皿を20倍顕微鏡下に置き、マイクロチャネルを通る体細胞コンパートメントから軸索コンパートメントへの培地の大量を確認します。

次に、150マイクロリットルのニューロン基底培地を軸索コンパートメントの上部ポートにピペットで移します。同様に、150マイクロリットルの完全なニューロン培地を体細胞コンパートメントの上部ポートに追加します。次に、20ミリリットルの超純水を150ミリメートルの培養皿に注ぎ、湿度チャンバーを作成します。

35 mmの培養皿を大きな皿の中に入れ、培養システム全体をインキュベーターに移し、必要な時間維持します。大規模なマイクロ流体デバイスの配置には、幅10センチメートルのペトリ皿を使用します。各方法には異なる軸索損傷プロトコルが必要なため、実験のニーズに基づいてフルチャネルまたはインターバルチャネルシーディングのいずれかを選択します。

播種が完了したら、ニューロンの成長を維持するために、5ミリリットルの完全ニューロン培地をペトリ皿に加えます。後で使用するために、適量のニューロン基礎培地を新しい15ミリリットル遠心分離管に移します。皮質ニューロンを含むマイクロ流体デバイスをクリーンベンチに置きます。

糸くずの出ない紙を使用して、35 mmの培養皿の底を乾燥させ、200マイクロリットルのピペットを使用して、マイクロ流体デバイスの2つの右側の穴から培地を吸引します。次に、真空ポンプチューブを無菌でフィルター不要の200マイクロリットルのピペットチップに接続します。毎分60リットルの吸引速度で真空ポンプをオンにし、軸索末端チャンバーの下部穴とチャンバーの間の接続点に先端を向けて古い媒体を吸引し、負圧による軸索破損を引き起こします。

ピペットチップを交換し、150マイクロリットルのニューロン基礎培地を引き出し、右側のチャンバーの下部の穴からゆっくりと加えます。添加と吸引を4回行った後、新鮮な完全ニューロン培地に交換し、次に細胞体側の穴から古い培地を吸引し、必要に応じて薬物を含む新鮮な完全ニューロン培地を追加します。マイクロ流体装置を培養皿と一緒に150mmの培養皿に入れ、24時間など必要な時間培養を続けます。

手動軸索損傷の場合は、ニューロンを大規模なマイクロ流体デバイスのすべてのチャンバーにシードします。デバイスを摂氏37度で、5%二酸化炭素を含む加湿インキュベーターで3日間インキュベートします。in vitroで7日目に、マイクロ流体デバイスを含む培養皿をインキュベーターから取り出し、無菌ステージに置きます。

倍率20倍の顕微鏡を用意し、75%エタノールで作業領域を滅菌します。10マイクロリットルの滅菌フィルター付きピペットチップを持ち、顕微鏡の誘導下で元のマイクロチャネル内の軸索束を識別します。ピペットチップを使用して、各軸索束に沿って縦方向のスクラッチを実行します。

軸索の破損を顕微鏡でリアルタイムに観察します。標準的なマイクロ流体デバイスのマイクロチャネルは、軸索の成長を許可しますが、体細胞の成長は許可しません。神経密度は軸索損傷後に有意差を示さず、観察可能なニューロン死がないことを示しています。

マルチオミクス解析のために、3次元拡張可能な設計の大型マイクロ流体デバイスを開発しました。パンチングなしのPDMSレプリカと穴あきPDMSのレプリカは、10センチメートルの皿またはプリント基板にしっかりと接着されました。ピペットチップの引っ掻き傷によって引き起こされる軸索損傷は、損傷前の無傷の軸索とは対照的に、形態が破壊された軸索を明らかに切断しました。

軸索の再生は損傷後6時間と24時間の両方で観察されましたが、損傷していない軸索は安定したままでした。神経タンパク質濃度は、ベースラインの1420.4マイクログラム/ミリリットルから、損傷後6時間で1748.9マイクログラム/ミリリットル、1823.7マイクログラム/ミリリットルに有意に上昇しました。対照群と軸索損傷群からのRNA収量はほぼ同じでした。

RNA配列決定により、595の損傷特異的遺伝子と609の対照特異的遺伝子が明らかになり、17, 471の遺伝子がグループ間で共有されました。KEGG経路解析により、損傷後の酸化的リン酸化、活性酸素種応答、オートファジー、およびTCAサイクル経路の有意なアップレギュレーションが特定されました。