マウスデフォルトモードネットワークの縦方向多モーダル電気生理学記録を可能にする大型再封閉可能な頭蓋窓の手術プロトコル

デフォルトモードネットワーク(DMN)は、認知機能やうつ病などの神経精神疾患に関与する、重要な大規模ネットワークです。動物モデルにおけるDMNの複雑な動態を研究することは、健康状態と病理状態の両方におけるその機能について貴重な洞察を提供します。しかし、覚醒中の行動するマウスの複数の深部かつ分散したノードであるDMNからの安定的かつ長期的かつ大規模な電気生理学的記録を行うことが大きな課題でした。

ここでは、Eero Castrenの研究室で開発された新しい2段階手術プロトコルを紹介します。この技術により、大きく耐久性があり再封可能な頭蓋窓が生成され、1,000以上の電極チャネルから同時に縦方向の繰り返し記録が可能になります。これは、表面レベルのマイクロコルティグラフィー(micro-ECoG)と2つのニューロピクセルプローブを組み合わせることで実現され、デフォルトモードネットワークへの前例のないアクセスを可能にします。

このビデオでは、動物の準備やヘッドプレートの埋め込みから慢性頭蓋窓の創設まで、この堅牢な外科手術のステップバイステップガイドを提供し、ネットワーク神経科学研究のための高品質で長期的なデータ取得を保証します。示されたすべての手順はフィンランドの国家実験委員会によって承認されており、科学目的で使用される動物保護に関する欧州指令に準拠しています。フェーズ1、動物の準備とヘッドプレートの埋め込み。

この手術を行うには、まず必要な手術用具や器具をすべて準備してください。マウスに4%イソフルランで麻酔し、麻酔は1.5〜2.5%で、酸素流量は毎分0.5リットルで維持します。頭頂部の毛を剃り、体内温度センサーを備えた制御された加熱パッドに動物を置き、処置中は体温を37度に維持します。

角膜乾燥を防ぐために炭酸の眼軟膏を塗布してください。マウスを立体視位フレームに固定し、頭蓋骨が平らに寝るようにし、術前鎮痛剤と抗炎症薬を皮下注射(カルプロフェン、ブプレノルフィン、デキサメタゾン)で投与します。剃った部分をポビドンヨウ素溶液で消毒し、リドカイン・エピネフリン溶液を頭皮の皮膚下に局所麻酔として注入します。

耳のラインに小さな横切開を入れ、徐々に大きくして頭蓋骨の表面を完全に露出させます。露出した頭蓋骨をアセトンで慎重に洗浄し、インプラントの強い接着を確保するまでアセトンで清潔にします。鈍い円形のメス刃を使って、アセトン洗浄で完全に解消できなかった残存する骨膜や結合組織の断片を取り除きます。

定位装置で、ブレグマに対して頭蓋骨に4ミリメートル×7.6ミリメートルの長方形の領域をマークします。長方形はブレグマから両側に2ミリメートル、前側に3ミリメートル、尾側に4.6ミリメートル伸びているべきです。次に、右半球の2つの頭蓋内プローブ挿入部位をマークします。

前端プローブ部位はブレグマから前方1.66ミリメートル、外側1.95ミリメートル、尾側プローブ部位はブレグマから後方2.2ミリメートル、外側1.9ミリメートルに位置する。次に、指定された窓域外のすべての露出した骨面に、ナンバー11の手術用刃を使って交差模様を彫り、約0.2〜0.4ミリメートルの浅くはっきりした溝を作って、約1×1 ミリメートル四方の均一なグリッドを形成します。綿棒の先に滅菌された30Gの針をはめ、針をV字型に曲げて細かい接着剤アプリケーターを作ります。

シアノアクリレート接着剤を使い捨てのプラスチック製の計量ボートに注ぎ、塗布器を接着剤の貯水槽に浸します。露出した骨や彫刻された骨の表面すべてに接着剤を塗り、各部位に最大1回の堆積物を塗布し、カバー範囲を徹底的に保ちつつ過剰に塗りすぎないようにします。接着剤を7分間乾かしてから進めます。

参照ソケットを埋め込む際は、目に見える浅い血管を避けるために、左小脳の位置よりもドリリング部位を選びます。ラウンドスチールバリを20,000発から25,000発毎分に5秒から10秒のバーストで穴に開け、穴がより透明になり淡いピンク色が見えるまで穴を開けます。金メッキのリファレンスソケットをパイロットホールに差し込み、シアノアクリレート接着剤で固定し、UV硬化可能なデンタルセメントで接合部を補強します。

LED硬化ペンライトで1分間、デンタルセメントを固めます。次に、露出した前縁骨の先端に少量のUV硬化可能なデンタルセメントを塗布し、ヘッドプレートを頭蓋骨の下に置きます。これにより一方の端が基準ソケットの周囲に硬化した歯科セメントの足場に乗せられ、反対側の端は新しいロストラルセメントダブの上に置かれます。ヘッドプレートが中央に揃っていて水平になっていることを確認してください。

頭板の基部に歯科用セメントを塗布し、彫刻された骨と基準ソケットを円を描くようにして、将来の頭蓋窓の周囲に連続した密閉された囲いが形成されるまで、構造を強化します。最後に、LED硬化ペンライトで1分間デンタルセメントを硬化させました。セメントが完全に硬化したら、ネズミが麻酔から目覚めるのを待ちます。

第一段階は現在完成しました。次の段階に進む前に、ネズミが少なくとも48時間回復するのを待ちましょう。第2相、慢性頭蓋窓の創設。

第2段階は第1段階と同じ道具と薬剤が必要ですが、局所麻酔が異なります。さらに、この段階には無菌で薄いPDMS膜、冷たい人工脳脊髄液を氷上に保管し、エラストマーシリコーンシーラント、そしてカスタム3Dプリントの保護キャップが必要です。最初の手術から少なくとも48時間経過後、マウスをイソフルランで再麻酔し、立体定位フレームの温熱パッドに置き、リドカイン・エピネフリン局所麻酔以外の術前薬を第1段階と同様に投与します。

第1段階で示された長方形の輪郭に沿って歯科用ドリルで骨を薄くし、1分間に25,000発の弾数で、ドリル装置を骨面に対して90度の角度で持ち、長方形の縁に沿って1〜2回やや深めに切削溝を形成します。2つのプローブ挿入座標で、骨と歯科セメントに浅い溝を掘ります。これらの溝は骨皮弁除去後も持続的に見える視覚的ランドマークとして機能し、その後の電気生理学的セッションで頭蓋内プローブの再現性を再配置するために用いられます。

掘削中は氷のように冷たい無菌人工脳脊髄液を定期的に投与し、基底皮質への熱損傷を防ぎ出血を最小限に抑えましょう。骨が薄くなるにつれて、ドリル速度を徐々に毎分20,000発に下げていきます。長方形の周囲に沿って穴を開け続け、輪郭内の骨が約90%薄くなるまで続けます。

頭蓋骨を完全に貫通しないでください。細かい曲線の硬膜フックに切り替えましょう。細い骨の端の下に先端を慎重に差し込み、フックを窓の周囲に沿って滑らせて、骨のフラップを周囲の頭蓋骨や下の組織から慎重に外します。

硬膜フックで切断された骨フラップを後方から前方方向に慎重に持ち上げ、頭蓋骨表面から約35度上方へと移します。持ち上げられた縁を鉗子で掴み、プレートが完全に外れるまで左右に優しく揺らします。氷のように冷たいACSFを繰り返し洗浄して、露出した凝固した血液を優しく除去します。

出血が収まったら、硬膜の下に直接無菌プレキャストPDMS膜を一枚置きます。適切なサイズで調整すれば、窓を正確に覆い、硬膜に受動的に付着して脳にぴったりと固定します。開頭手術をシリコーンシーラントで密封してください。

デンタルセメントのエンクロージャーとヘッドプレートの内縁の間の隙間をすべて埋め、BDMS膜の縁を完全に囲み重ねます。録音セッション間の窓を保護するために、少量のシアノアクリレート接着剤を塗ったカスタム3Dプリントの保護キャップをヘッドプレートに取り付けます。マウスは回復の準備が整っており、インプラントの損傷を防ぐために個別のケージに移す必要があります。

手術が成功すれば、皮質の上に透明で透明な窓ができ、血管が目に見え、炎症や感染の兆候は最小限に抑えられます。この明瞭さは21日以上維持できるため、長期的な縦断的研究が可能です。慢性ウィンドウを通じて記録された生の電気生理学的信号は、縦断的なタイムラインを通じて高品質を維持しました。

ここでは、後部後脾格子から採取した代表的な広帯域マイクロECoG痕跡と、同時に表層皮質チャネルから採取した頭蓋内プローブの局所フィールド電位痕跡を、最初の記録日と21日後に並べて示しています。21日目の記録は、同じ動物の0日目記録と比較して信号振幅、スペクトル内容、運動やノイズのアーティファクトの消失を示し、PDMS膜とシリコーンシールの慢性的な存在、または繰り返しの硬膜穿刺が表層皮質層の表面や頭蓋内プローブ信号品質の検出可能な劣化をもたらしなかったことを裏付けています。この手法の主な検証は、時間をかけて安定的で高品質な多様態電気生理学データの取得です。

再封可能なウィンドウにより、同じ神経集団から数週間にわたってプローブを繰り返し挿入して記録できます。アルファバンド全体で、尾側高密度頭蓋内電極プローブ沿いのチャネルから計算された位相ロック値行列は、ベースラインから治療後21日目までの安定した機能構造を示しています。これは、同じ個々のニューロンを正式に追跡するのではなく、同じ皮質位置への再現可能な再挿入を示しています。

シャンクの微小な挿入移動は同じ単位請求を否定しますが、アルファバンド相互作用の層状構造と局所構造は保持されており、慢性ウィンドウが同じ機能回路の縦方向サンプリングを可能にします。慢性ウィンドウが同じ深部構造の再生可能な層流ターゲット化をセッション間で直接検証するため、プローブのLFPチャネルから電流源密度またはCSDマップを計算しました。刺激誘発CSDプロファイルは、前辺縁皮質および前帯状体を含む予想される層流源のシグネチャーがセッション間に保存されていることを示しています。

2つのセッション間の層流パワープロファイルのオーバーレイはセッション間で非常に類似しており、ピアソン相関は0.81です。二次運動皮質で観察される違いは、記録間の運動の違いによるものと考えられます。CSDプロッティングは解剖学的情報を含んでいるため、死後の組織染色とは無関係に、各プローブが現在どの脳領域を採取しているかをセッション中に非終端的に読み取り出すことができます。

表面微小ECoGのセッション間の再現性は、頭蓋内CSDの表示値とは独立して定量化されます。0日目と21日目にマイクロECoGグリッドから計算された帯域制限空間電力マップを重ね合わせ、前方と尾側のサブグリッドについて2つのマップのピクセルごとの相関を別々に計算します。サブグリッドプロファイルの相関は依然として高く、2セッションの空間バーコードはアレイの前側半分と尾側半分の両方で同じ皮質電源ホットスポットを目に見え共局しています。

半透明グリッドを通して見える正弦波状のアライメントキューと、プローブ挿入座標に刻印された骨溝が、21日間の縦度区間におけるマイクロECoGの位置をミリ単位で再現性として支持しています。技術のさらなる検証のため、開頭手術約4週間後、死後の脳スライスでGFAPおよびIBA1の免疫組織化学的染色が行われました。GFAPはアストロサイトによって発現し、脳損傷や炎症などの反応性グリオーシスで上方調節されます。

一方、IBA1はミクログリアによって発現し、神経炎症過程でより活性化されます。検証コホートは、全ての2段階手術を実施し、術後0日目、21日目、22日目に頭蓋窓を3回再開した動物で構成されました。しかし、このコホートでは微小ECoGの挿入や頭蓋内プローブ挿入は行われませんでした。

この窓は、電気生理学的記録の時と同様にセッション間に再び閉鎖されていました。したがって、このコホートは慢性的なウィンドウおよび繰り返し硬膜曝露の炎症寄与をプローブ誘発性組織損傷から分離しています。手術なしの対照群と手術を受けた車両群の間で、いずれのマーカーにも有意な差は認められませんでした。

これらの代表的な顕微鏡写真では、窓の直接下部に反応性グリオーシスや微小膠細胞活性化の質的証拠は示されていません。しかし、プローブ軌道の隣接部およびプローブ挿入部の半球で微粒膠細胞およびアストロサイト活性化がわずかに増加し、これは頭蓋内プローブの挿入速度が速すぎたことが原因と考えられます。手術が成功すれば、炎症を最小限に抑えた透明で透明な皮質の窓が開けられます。

慢性治療期間の後には、脳の腫れが起こることがあります。これは注意深い経過観察と必要に応じて追加の鎮痛剤投与によって管理可能です。記録の場合は、キャップとシーラントを外し、マイクロECoGグリッドとニューロピクセルプローブを設置し、起きている動物からデータ取得を開始するだけです。

まとめると、この二段階の手術プロトコルは、マウスにおいて大きく慢性的な頭蓋窓を作るための信頼性が高く非常に効果的な方法を提供します。この手法の主な利点は、硬膜への損傷が最小限であり、表面マイクロECoGグリッドと複数の深部脳ニューロピクセルプローブを同時に配置する際に極めて重要な曝露時間です。この手法により、DMNやその他の大規模回路におけるネットワーク全体の電気生理ダイナミクスの前例のない縦断的研究が可能になります。

複雑な行動の神経基盤や脳障害の病態生理学に関するより深い研究への扉を開き、最終的には新規治療法の開発に寄与します。