形状の形態計測解析:ゼブラフィッシュにおける頭蓋顔面形状定量化のための解析ソフトウェアツールボックス
February 27th, 2026
本研究は、ゼブラフィッシュ幼生の顔面構造変化を測定するために、無料ソフトウェア(tpsDigs2、MorphoJ、PAST)を用いて頭蓋顔面軟骨の形状を定量化するプロトコルを説明しています。
私たちの研究は形態計測ソフトウェアを用いて、エタノールとbmp7aが相互作用してゼブラフィッシュの微細な頭蓋顔異常を引き起こすかどうかを定量化しています。線形指標では微妙な変化を見逃します。この方法では、ランドマークを使って形状の変化を定量化しつつ、サイズの違いを制御します。
まずはtpsDigs2ソフトウェアを開きます。「入力ソース」をクリックし、次に「ファイル」をクリックし、保存したTPSメモ帳ファイルを選択します。オプションをクリックすると画像ツールのオプションが可視化されます。
基準長を100マイクロメートルに設定し、セットスケールを押してください。「OK」をクリックしてスケールパラメータを確認し、画像ツールのウィンドウを終了します。次に、エイムシンボルをクリックし、メッケル軟骨の間の正中関節に最初のランドマークを配置します。
2つ目のランドマークはメッケル軟骨と口蓋四分軟骨の間の両側関節に位置します。セラトヒアル軟骨の間の正中関節に第3ランドマークを、口蓋四分骨とセラトヒアル軟骨の間の両側関節に第4ランドマークを配置します。次に、5つ目のランドマークを下顎軟骨の遠位端に配置し、すべての画像でランドマークを同じ順序で配置します。
ランドマークを設置した後、ファイルをクリックしてドロップダウンメニューを開きます。「セーブデータ」を選択し、上書きして更新したファイルを保存します。tpsDigs2ソフトウェアを終了します。
MorphoJソフトウェアを起動してください。「ファイル」をクリックし、「新しいデータセットを作成」を選択し、データセットに名前を割り当てます。TPSをクリックして、新たに追加されたデータポイントを含むメモ帳ファイルを選択します。
その後、データセットを作成します。Project Treeでデータセットをクリックします。プレリミナリーを選択し、次に新しいプロクルステスを適合させます。
主軸でアラインを選択し、「プロクルステスフィットを実行する」をクリックしてください。「予備」で「共分散行列の生成」を選択してプロクルステス座標を取得します。指示があれば関数を実行します。
次に「ワイヤーフレームを作成」または「編集」を選択し、画像上のポイントをリンクします。リンクポイントをクリックして画像を受け入れるか作成し、必要に応じて分類器を編集してください。MorphoJを開いたままスプレッドシートプログラムを開いてください。
GENOTYPE、TREATMENT、GENOTYPE TREATMENTなどの分類情報を入力し、ファイルをCSVファイルとして保存します。MorphoJで「ファイル」をクリックし、「分類器変数のインポート」を選択してCSVファイルをインポートします。プロジェクトツリーに戻り、データセットをクリックしてください。
予備情報の中で「編集分類器」を選択して、すべての画像が含まれていることを確認します。Project TreeでCovMatrixを選択し、ページ上部のVariationをクリックします。主成分分析を選択して主成分スコアを計算してください。
PCスコアをクリックすると生成されたグラフが表示されます。グラフを右クリックし、「信頼省略」を選択して、希望する分類器を追加します。カラーデータポイントを選択し、色を割り当て、OKをクリックして変更を適用してください。
予備項目の中で、画面下部にある形状グラフの「セットオプション」を選択してください。ワイヤーフレームグラフを選択し、ターゲットの形状、開始形状、数字の色を修正してください。変異を選択し、次にプロクルステスの方差分析(ANOVA)を選びます。
プロクルステスのANOVA結果を、以前作成したスプレッドシートファイルにエクスポートします。MorphoJで、プロジェクトツリーの元のデータセットを選択します。「比較」をクリックし、次に「正準変量解析」をクリックしてください。
分類変数GENOTYPE TREATMENTを選択し、関数を実行します。結果をエクスポートするには、「結果」タブをクリックし、結果ページを右クリックしてください。「ファイルにエクスポート」を選択し、結果を保存します。
プロジェクトツリーで「標準的変動解析」を選択し、その後スコアを選択します。ファイルをクリックし、「データセットエクスポート」を選択し、データタイプとGENOTYPE TREATMENTを選択してください。CVAスコアをTXTファイルとして保存してください。
PASTソフトウェア用にファイルを準備するには、保存したCVAスコアをテキストエディタで開いてください。左上隅のidという用語をLabelに置き換え、編集したファイルを保存します。PASTソフトを開き、ファイルをクリックし、編集したCVAスコアファイルを選択します。
インポートウィンドウで。名前、行と列のデータ、区切りはタブを選択し、インポートをクリックします。「表示」タブで「列属性」を選択してください。
ドロップダウンメニューの「Type」の横で、分類器変数を含む最初の列に「Group」を割り当てます。主成分または標準的変量データの列をハイライトしてください。多変量を選んでから検定を選択し、主成分と標準変量変量の変量データに対して多変量正規性検定を別々に実行します。
上位左上のグレーの空セルをクリックして、データ全体を選択してください。多変量を選択し、次に「Tests」を選び、変異の多変量解析を選択して解析を行います。MANOVAの結果を、以前作成したスプレッドシートファイルにエクスポートします。
各遺伝子型および処理群の幼虫ごとに内臓頭蓋の画像を取得しました。内臓頭蓋の軟骨は代表的な画像でラベル付けされ、各画像にランドマークを配置してランドマークラベル付きデータセットを作成しました。主成分1は全体の形状変動の約34%、主成分2は全体の形状変動の約20%を占めました。
各主成分は、すべての内臓頭蓋の平均形状に対して特定の内臓頭蓋形状の変化を示しました。主成分解析プロットでは、遺伝子型群と処理群間で平均が重複し、明確なクラスタリングは見られませんでした。エタノール処理済み野生型幼虫は、サンプルサイズが少なかったため平均の95%信頼度楕円を示しました。
標準変量1は、マゼンタのワイヤーフレームにおけるセラトヒアル接合部の微妙な短縮または延長を表し、平均的な黒いワイヤーフレームに対して示していました。標準変量2は、内臓頭蓋の片側、メッケル口蓋四分状骨と口蓋四分状セラトヒアルの関節でのみ内側にずれました。エタノール処理済み野生型幼虫は、平均値の95%信頼度楕円が他のすべてのグループと重なり合う大きな傾向を示しました。
変異の多変量解析により、遺伝子型と治療の全体的な効果が有意であることが明らかになりました。サンプルの固定が最大の課題です。傾いた幼虫は測定の誤差を引き起こし、結果に影響を与えることがあります。
このプロトコルは異なる解剖学的構造に適応し、3Dデータを解析し、線形測定を生成し、実験サンプルサイズの決定を支援します。今後の研究では、他の遺伝子型・エタノール感受性を調査し、サンプルサイズを拡大し、この多用途なツールボックスをさまざまな解剖構造に応用する予定です。
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Overview
This article presents a detailed morphometric protocol for analyzing subtle craniofacial shape changes in zebrafish larvae following ethanol exposure, with a focus on gene-ethanol interactions. The approach leverages landmark-based geometric morphometrics and multivariate statistical analyses to quantify and compare facial skeletal variation, addressing challenges in assessing fetal alcohol spectrum disorders (FASD) phenotypes.
Key Study Components
Area of Science
- Developmental biology
- Genetics
- Morphometrics
- Toxicology
Background
- FASD encompasses a range of physical, cognitive, and behavioral disabilities caused by prenatal ethanol exposure.
- Facial skeletal abnormalities are a hallmark of FASD, but their analysis is complicated by genetic variability and subtle shape changes.
- Zebrafish are an effective model due to genetic similarity to humans, external fertilization, conserved craniofacial structures, and transparent larvae.
- Traditional linear measurements may miss subtle or complex shape changes, necessitating advanced morphometric approaches.
Purpose of Study
- To quantify subtle craniofacial defects resulting from ethanol and bmp7a gene interactions in zebrafish.
- To develop and demonstrate a reproducible workflow for landmark-based morphometric analysis of craniofacial shape.
- To enable pairwise and multivariate comparisons of facial morphology across genotypes and treatments.
Methods Used
- Landmark placement on viscerocranial cartilage images using tpsDigs2 software.
- Procrustes alignment, principal component analysis (PCA), and canonical variate analysis (CVA) using MorphoJ.
- Multivariate normality and MANOVA tests using PAST software.
- Statistical visualization and export of results for further analysis.
Main Results
- Principal component 1 and 2 accounted for 34% and 20% of total shape variation, respectively.
- PCA plots showed overlapping means among genotype and treatment groups, with no distinct clustering.
- Canonical variate analysis revealed subtle, localized shape changes in the viscerocranium, such as shortening/lengthening of the ceratohyal joint and medial shifts at specific cartilage joints.
- MANOVA indicated a significant overall effect of genotype and treatment on craniofacial shape.
Conclusions
- The morphometric protocol enables detection of subtle craniofacial shape changes that linear measures may miss.
- Consistent sample mounting is critical to avoid measurement artifacts.
- This workflow is adaptable to other anatomical structures and can be extended to 3D data and larger sample sizes in future studies.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative morphometric analysis of craniofacial shape in zebrafish enables high-resolution detection of subtle phenotypic effects from gene-environment interactions, such as those relevant to fetal alcohol spectrum disorders. This workflow enhances predictive confidence in early-stage target validation and supports mechanistic de-risking for developmental toxicity studies. The approach is positioned to inform portfolio decisions where phenotypic screening and translational continuity are critical.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene-environment interactions affecting craniofacial development.
- Supports functional target validation by quantifying subtle morphological phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking through multivariate statistical analysis of shape variation.
- Improves predictive confidence for developmental toxicity endpoints.
Screening & Assay Development
- Prepares validated zebrafish models for downstream phenotypic screening workflows.
- Standardizes landmark-based morphometric assays for reproducibility and scalability.
- Generates quantitative outputs suitable for comparative compound evaluation.
- Enables robust assay development for gene-environment interaction studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns zebrafish craniofacial phenotypes with disease-relevant endpoints in FASD research.
- Supports translational biomarker identification through quantitative shape metrics.
- Provides continuity from early discovery to preclinical validation of developmental toxicity.
- De-risks advancement decisions by clarifying subtle phenotypic effects.
Pipeline & Workflow Integration
This morphometric workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and phenotypic screening in zebrafish models.
- Discovery Biology: Quantifies gene-environment effects on craniofacial development for hypothesis-driven studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative shape data for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides principal component, canonical variate, and MANOVA outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges zebrafish phenotypes to human-relevant developmental endpoints.
- Enterprise Reuse: Toolbox is adaptable to other anatomical structures and scalable for broader R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental toxicity studies.
- Operational Value: Standardizes morphometric analysis for reproducibility and cross-study comparability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in early-stage portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene-environment interaction targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in morphometric analysis and zebrafish developmental biology.
- Needs access to imaging, landmarking, and statistical analysis software (tpsDigs2, MorphoJ, PAST).
- Demands rigorous sample mounting and orientation for reproducible results.
- Adaptable to 3D data and other anatomical structures with protocol modifications.
- Sample size and mounting consistency are critical for statistical power and accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:24
Adding Landmarks to Zebrafish Larvae Viscerocranium Images Using tpsDigs2 Software
1:48
Using MorphoJ to Analyze Cranofacial Shape by Procrustes ANOVA
4:26
Canonical Variate Analysis of the Dataset and MANOVA in PAST Software
6:43
Results
8:30
Conclusion
