1. 식품 샘플에서 DNA 추출
- 이전 파이프 또는 200-1,000L 조절 가능한 볼륨 마이크로파이프를 사용하여 구입한 PCR 믹스 매트릭스 500 μL을 2개의 스크류 캡 튜브에 추가합니다. 각 알리쿼트 사이의 파이펫을 위아래로 피펫하여 PCR 매트릭스를 고르게 혼합합니다.
- 나사 캡 튜브 "비 GMO"와 다른 "테스트"에 레이블을 지정합니다.
- 인증된 비GMO 식품의 0.5 g를 계량하여 박격포에 넣습니다.
- 증류수 2.5mL를 넣고 유봉으로 2분 동안 갈아서 슬러리를 만드시다.
- 증류수 2.5mL를 추가한 후 슬러리가 파이프에 충분히 부드러워질 때까지 유봉으로 계속 연마합니다.
- 50 μL의 PCR 프리믹스를 포함하는 나사 캡 튜브에 대한 파이펫 50 μL은 졸업된 파이프에 50 μL 마크를 사용하여 "비-GMO"라고 표시합니다. 요약 튜브.
- 테스트 식품 샘플을 준비하기 위해 1.3-1.6 단계를 반복합니다.
- "테스트"라고 표시된 나사 캡 튜브에 대한 지상 테스트 식품 슬러리의 파이프 50 μL. 요약 튜브.
- 비GMO 식품 및 테스트 식품 PCR 튜브를 1 분 동안 소용돌이시키고 95 °C 수조에 튜브를 5 분 동안 배치합니다. 소용돌이가 없는 경우 튜브를 여러 번 섞어 수조에 넣습니다.
- 원심분리기에 튜브를 5분 간 배치합니다. 단단한 펠릿은 튜브의 바닥에 형성되어야합니다. 펠릿이 5분 후에 형성되지 않으면, 펠릿이 형성될 때까지 2분 간격으로 원심분리기를 다시 한 번 분리합니다.
- 튜브는 PCR에 즉시 사용하거나 최대 1 주일 동안 냉장고에 저장할 수 있습니다.
2. PCR 반응 설정
- 번호 PCR 튜브 1-6 을 초기. 숫자는 표 1에나열된 다음 튜브 내용에 해당해야 합니다.
- 표지된 각 PCR 튜브를 마이크로튜브 홀더에 놓고 캡을 열어 놓습니다.
- 각 추가에 대한 신선한 팁을 사용하여 각 PCR 튜브에 표 1에 표시된 프라이머의 20 μL을 추가합니다. 캡 튜브.
- 각 튜브에 대한 신선한 팁을 사용하여 표 1에 표시된 DNA 샘플의 20 μL을 각 PCR 튜브에 추가하여 수퍼나탄에서만 파이펫을 피하고 튜브 바닥의 고체 펠릿을 피하십시오.
- 각 DNA 샘플이 해당 PCR 튜브로 파이펫화된 후 파이펫을 사용하여 DNA와 프라이머를 부드럽게 위아래로 피펫하여 혼합합니다. 요약 튜브.
- PCR 튜브를 열 사이클러에 배치하고 다음을 위한 사이클러를 프로그래밍합니다.
초기 자연: 2 분 동안 94 °C에서 1 사이클.
증폭: 94°C에서 1분(변성), 59°C1(아닐링), 2분 동안 72°C(확장).
최종 연장: 10 분 동안 72 °C에서 1 사이클.
보류: 4°C 무기한.
3. 아가로즈 젤 제제 3%
- 실험실 또는 마스킹 테이프를 사용하여 젤 트레이의 열린 끝을 단단히 테이프로 고정하십시오. 테이프가 트레이의 가장자리에 밀봉되어 용융 아가로즈가 누출되는 것을 방지합니다.
- 250mL 또는 더 큰 에를렌마이어 플라스크에 아가로즈 3 g의 무게를 내세요.
- 1x TAE 버퍼 100mL(농축액에서 구입 또는 준비)를 추가합니다.
- 교반바가 있는 마그네틱 핫 플레이트를 사용하여 아가로즈가 버퍼에 완전히 녹고 용액이 끓어오르고 선명해질 때까지 비커를 가열합니다. 또는 전자 레인지는 비커를 오븐에 넣고 30 년대 간격으로 가열하여 볶음 봉을 사용하여 10 s를 혼합하고 혼합물이 끓고 투명해질 때까지 반복하여 사용할 수 있습니다.
- 50mL Erlenmeyer 플라스크를 250mL 플라스크의 개구부로 되돌리면 역류역할을 하여 아가로즈 용액이 증발하는 것을 방지합니다.
- 아가로즈 용액을 60°C로 식히고 30-50mL를 각 테이프젤 트레이에 붓도록 하십시오.
- 젤 빗을 첫 번째 노치에 넣어 젤 웰을 만듭니다.
- 테이프와 빗을 제거하기 전에 젤을 완전히 식힙니다. 젤은 약 10-20 분 준비되면 고체화되고 맑고 흐린 것으로 바뀝니다.
4. PCR 제품의 전기 전광
- 미리 만들어진 3% 아가로즈 젤을 젤 트레이에 놓거나 3% 아가로즈 젤을 캐스팅하는 데 사용된 젤 트레이를 사용한다.
- 음극 (검은) 끝에 가장 가까운 우물과 전기 전광 챔버에 젤 트레이를 밀어 넣습니다.
- 1x TAE 버퍼를 챔버에 붓고 겔 트레이 의 상단 위에 2mm의 버퍼를 가질 수 있습니다.
- 열 사이클러에서 PCR 튜브를 얻고 마이크로튜브 홀더에 배치합니다.
- 매번 신선한 파이펫 팁을 사용하여 구입 한 오렌지 G 로딩 염료 (LD)의 10 μL을 각 샘플에 추가하고 잘 섞습니다.
- 분자량 눈금자의 20 μl및 각 시료의 20 μL을 겔내로 적재(표2).
- 젤 전기 전도를 100 V에서 30 분 동안 실행하십시오.
- 챔버에서 젤 트레이를 제거하고 젤을 밀어 트레이에서 제거합니다. 염색 트레이에 젤을 놓습니다.
- 구입 한 DNA 젤 얼룩에 젤을 5 분 동안 담그고 조심스럽게 트레이를 흔들어 젤 전체에 얼룩을 분배합니다.
- 젤을 세척 용기에 옮기고 약 10s의 수돗물(40-55°C)으로 헹구는 다.
- 따뜻한 수돗물로 3배 씩 씻아 6분 간 부드럽게 흔들어 최상의 결과를 만들어 보입니다. 필요한 경우 원하는 대비에 도달할 때까지 따뜻한 물에 계속 유색하십시오.
| 튜브 번호 | 입문서 | DNA 샘플 |
| 1 | 20 μL 식물 프라이머 (녹색) | 20 μL 비 GMO 식품 제어 DNA |
| 2 | 20 μL GMO 프라이머(빨간색) | 20 μL 비 GMO 식품 제어 DNA |
| 3 | 20 μL 식물 프라이머 (녹색) | 20 μL 테스트 식품 DNA |
| 4 | 20 μL GMO 프라이머(빨간색) | 20 μL 테스트 식품 DNA |
| 5 | 20 μL 식물 프라이머 (녹색) | 20 μL GMO 양성 대조군 DNA |
| 6 | 20 μL GMO 프라이머(빨간색) | 20 μL GMO 양성 대조군 DNA |
표 1. 적절한 튜브 번호, 프라이머 및 DNA 샘플 목록입니다.
| 웰 1 | 식물 프라이머 20 μL을 가진 비 GMO 식품 제어 샘플 1. |
| 웰 2 | 샘플 2 GMO 프라이머 20 μL을 가진 비 GMO 식품 제어. |
| 음 3 | 식물 프라이머 20 μL로 음식을 시험하는 3 샘플 3. |
| 음 4 | 샘플 4 GMO 프라이머 20 μL로 음식을 테스트합니다. |
| 웰 5 | 식물 프라이머 20 μL을 가진 5 GMO 양성 DNA를 샘플링합니다. |
| 음 6 | GMO 프라이머 20 μL을 가진 6 GMO 양성 DNA. |
| 음 7 | PCR 분자량 눈금자 20 μL. |
| 웰 8 | 비워 둡니다. |
표 2. 분자량 눈금자의 20 μL 및 각 시료의 20 μL을 젤에 적재하는 적절한 순서입니다.
출처: 마가렛 노동자와 킴벌리 프라이의 실험실 - 데폴 대학
식품의 유전자 변형은 건강과 환경 안전에 대한 논쟁적인 문제로 인해 논란의 여지가있는 문제였습니다. 이 실험은 식품 DNA가 유전적으로 식별되는 방법의 기술적 이해를 보여 주며, 식품 공급에서 유전자 변형 생물 (GMO)을 사용하는 안전성과 잠재적 위험에 대한 교육 된 의사 결정을 허용합니다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)은 식품에서 유전자 변형 DNA의 존재를 테스트하기 위해 식품 DNA를 증폭시키는 데 사용됩니다. 특정 DNA 밴드의 존재는 젤 전기 포이를 사용하여 추출 된 식품 DNA를 3 % 아가로즈 젤을 통해 당겨서 검출되며, 유전자 변형 DNA를 포함하는 DNA의 밴드를 분리 할 만큼 밀도가 높다. 몇몇 통제는 DNA가 시험 식품 (식물 프라이머)에서 성공적으로 추출되는지 확인하고, 유전자 변형 DNA (구입한 유전자 변형 DNA) 및 비 유전자 변형 DNA (인증된 비 GMO 음식 통제)의 알려진 예를 제공하기 위하여 전기 전구 절차에서 이용됩니다.
1. 식품 샘플에서 DNA 추출
- 이전 파이프 또는 200-1,000L 조절 가능한 볼륨 마이크로파이프를 사용하여 구입한 PCR 믹스 매트릭스 500 μL을 2개의 스크류 캡 튜브에 추가합니다. 각 알리쿼트 사이의 파이펫을 위아래로 피펫하여 PCR 매트릭스를 고르게 혼합합니다.
- 나사 캡 튜브 "비 GMO"와 다른 "테스트"에 레이블을 지정합니다.
- 인증된 비GMO 식품의 0.5 g를 계량하여 박격포에 넣습니다.
- 증류수 2.5mL를 넣고 유봉으로 2분 동안 갈아서 슬러리를 만드시다.
- 증류수 2.5mL를 추가한 후 슬러리가 파이프에 충분히 부드러워질 때까지 유봉으로 계속 연마합니다.
- 50 μL의 PCR 프리믹스를 포함하는 나사 캡 튜브에 대한 파이펫 50 μL은 졸업된 파이프에 50 μL 마크를 사용하여 "비-GMO"라고 표시합니다. 요약 튜브.
- 테스트 식품 샘플을 준비하기 위해 1.3-1.6 단계를 반복합니다.
- "테스트"라고 표시된 나사 캡 튜브에 대한 지상 테스트 식품 슬러리의 파이프 50 μL. 요약 튜브.
- 비GMO 식품 및 테스트 식품 PCR 튜브를 1 분 동안 소용돌이시키고 95 °C 수조에 튜브를 5 분 동안 배치합니다. 소용돌이가 없는 경우 튜브를 여러 번 섞어 수조에 넣습니다.
- 원심분리기에 튜브를 5분 간 배치합니다. 단단한 펠릿은 튜브의 바닥에 형성되어야합니다. 펠릿이 5분 후에 형성되지 않으면, 펠릿이 형성될 때까지 2분 간격으로 원심분리기를 다시 한 번 분리합니다.
- 튜브는 PCR에 즉시 사용하거나 최대 1 주일 동안 냉장고에 저장할 수 있습니다.
2. PCR 반응 설정
- 번호 PCR 튜브 1-6 을 초기. 숫자는 표 1에나열된 다음 튜브 내용에 해당해야 합니다.
- 표지된 각 PCR 튜브를 마이크로튜브 홀더에 놓고 캡을 열어 놓습니다.
- 각 추가에 대한 신선한 팁을 사용하여 각 PCR 튜브에 표 1에 표시된 프라이머의 20 μL을 추가합니다. 캡 튜브.
- 각 튜브에 대한 신선한 팁을 사용하여 표 1에 표시된 DNA 샘플의 20 μL을 각 PCR 튜브에 추가하여 수퍼나탄에서만 파이펫을 피하고 튜브 바닥의 고체 펠릿을 피하십시오.
- 각 DNA 샘플이 해당 PCR 튜브로 파이펫화된 후 파이펫을 사용하여 DNA와 프라이머를 부드럽게 위아래로 피펫하여 혼합합니다. 요약 튜브.
- PCR 튜브를 열 사이클러에 배치하고 다음을 위한 사이클러를 프로그래밍합니다.
초기 자연: 2 분 동안 94 °C에서 1 사이클.
증폭: 94°C에서 1분(변성), 59°C1(아닐링), 2분 동안 72°C(확장).
최종 연장: 10 분 동안 72 °C에서 1 사이클.
보류: 4°C 무기한.
3. 아가로즈 젤 제제 3%
- 실험실 또는 마스킹 테이프를 사용하여 젤 트레이의 열린 끝을 단단히 테이프로 고정하십시오. 테이프가 트레이의 가장자리에 밀봉되어 용융 아가로즈가 누출되는 것을 방지합니다.
- 250mL 또는 더 큰 에를렌마이어 플라스크에 아가로즈 3 g의 무게를 내세요.
- 1x TAE 버퍼 100mL(농축액에서 구입 또는 준비)를 추가합니다.
- 교반바가 있는 마그네틱 핫 플레이트를 사용하여 아가로즈가 버퍼에 완전히 녹고 용액이 끓어오르고 선명해질 때까지 비커를 가열합니다. 또는 전자 레인지는 비커를 오븐에 넣고 30 년대 간격으로 가열하여 볶음 봉을 사용하여 10 s를 혼합하고 혼합물이 끓고 투명해질 때까지 반복하여 사용할 수 있습니다.
- 50mL Erlenmeyer 플라스크를 250mL 플라스크의 개구부로 되돌리면 역류역할을 하여 아가로즈 용액이 증발하는 것을 방지합니다.
- 아가로즈 용액을 60°C로 식히고 30-50mL를 각 테이프젤 트레이에 붓도록 하십시오.
- 젤 빗을 첫 번째 노치에 넣어 젤 웰을 만듭니다.
- 테이프와 빗을 제거하기 전에 젤을 완전히 식힙니다. 젤은 약 10-20 분 준비되면 고체화되고 맑고 흐린 것으로 바뀝니다.
4. PCR 제품의 전기 전광
- 미리 만들어진 3% 아가로즈 젤을 젤 트레이에 놓거나 3% 아가로즈 젤을 캐스팅하는 데 사용된 젤 트레이를 사용한다.
- 음극 (검은) 끝에 가장 가까운 우물과 전기 전광 챔버에 젤 트레이를 밀어 넣습니다.
- 1x TAE 버퍼를 챔버에 붓고 겔 트레이 의 상단 위에 2mm의 버퍼를 가질 수 있습니다.
- 열 사이클러에서 PCR 튜브를 얻고 마이크로튜브 홀더에 배치합니다.
- 매번 신선한 파이펫 팁을 사용하여 구입 한 오렌지 G 로딩 염료 (LD)의 10 μL을 각 샘플에 추가하고 잘 섞습니다.
- 분자량 눈금자의 20 μl및 각 시료의 20 μL을 겔내로 적재(표2).
- 젤 전기 전도를 100 V에서 30 분 동안 실행하십시오.
- 챔버에서 젤 트레이를 제거하고 젤을 밀어 트레이에서 제거합니다. 염색 트레이에 젤을 놓습니다.
- 구입 한 DNA 젤 얼룩에 젤을 5 분 동안 담그고 조심스럽게 트레이를 흔들어 젤 전체에 얼룩을 분배합니다.
- 젤을 세척 용기에 옮기고 약 10s의 수돗물(40-55°C)으로 헹구는 다.
- 따뜻한 수돗물로 3배 씩 씻아 6분 간 부드럽게 흔들어 최상의 결과를 만들어 보입니다. 필요한 경우 원하는 대비에 도달할 때까지 따뜻한 물에 계속 유색하십시오.
| 튜브 번호 | 입문서 | DNA 샘플 |
| 1 | 20 μL 식물 프라이머 (녹색) | 20 μL 비 GMO 식품 제어 DNA |
| 2 | 20 μL GMO 프라이머(빨간색) | 20 μL 비 GMO 식품 제어 DNA |
| 3 | 20 μL 식물 프라이머 (녹색) | 20 μL 테스트 식품 DNA |
| 4 | 20 μL GMO 프라이머(빨간색) | 20 μL 테스트 식품 DNA |
| 5 | 20 μL 식물 프라이머 (녹색) | 20 μL GMO 양성 대조군 DNA |
| 6 | 20 μL GMO 프라이머(빨간색) | 20 μL GMO 양성 대조군 DNA |
표 1. 적절한 튜브 번호, 프라이머 및 DNA 샘플 목록입니다.
| 웰 1 | 식물 프라이머 20 μL을 가진 비 GMO 식품 제어 샘플 1. |
| 웰 2 | 샘플 2 GMO 프라이머 20 μL을 가진 비 GMO 식품 제어. |
| 음 3 | 식물 프라이머 20 μL로 음식을 시험하는 3 샘플 3. |
| 음 4 | 샘플 4 GMO 프라이머 20 μL로 음식을 테스트합니다. |
| 웰 5 | 식물 프라이머 20 μL을 가진 5 GMO 양성 DNA를 샘플링합니다. |
| 음 6 | GMO 프라이머 20 μL을 가진 6 GMO 양성 DNA. |
| 음 7 | PCR 분자량 눈금자 20 μL. |
| 웰 8 | 비워 둡니다. |
표 2. 분자량 눈금자의 20 μL 및 각 시료의 20 μL을 젤에 적재하는 적절한 순서입니다.
유전자 변형 식품은 DNA가 특이적으로 변형된 성분을 함유한 제품입니다. 이러한 변형의 존재는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)이라는 기술을 사용하여 검출할 수 있습니다.
식품의 유전자 변형은 건강과 환경 안전에 대한 논쟁으로 인해 논란의 여지가 있는 문제였습니다. 관심 식품 샘플에서 유전적으로 변형된 DNA를 검출할 수 있는 능력은 식품 공급에 유전자 변형 유기체(GMO)를 사용하는 것의 안전성 및 잠재적 위험에 대해 교육받은 의사 결정을 가능하게 합니다.
중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)은 식품 DNA를 증폭하여 유전자 변형 염기서열의 유무를 확인하는 데 사용됩니다. 그런 다음 겔 전기영동은 아가로스 겔 매트릭스를 통해 증폭된 DNA를 끌어당기고 변형되거나 변형되지 않은 마커에 해당하는 다양한 크기의 DNA 밴드를 분리합니다. 그런 다음 GMO를 함유하거나 변형이 없는 것으로 알려진 식품의 대조군과 비교합니다.
이 비디오는 식품 샘플에서 유전자 변형 DNA를 검출하는 원리, 유전자 변형 과정에 사용되는 DNA를 추출하고 마커를 증폭하는 방법, 식품 샘플에서 GMO의 존재 여부를 확인하는 방법을 보여줍니다.
중합효소 연쇄 반응은 유전자 변형 식품에 삽입된 DNA 염기서열을 식별합니다. DNA는 비교적 안정적인 분자이므로 증폭에 적합한 생존 가능한 DNA 단편은 옥수수 칩이나 야채 햄버거와 같은 고도로 가공된 제품에서도 분리할 수 있습니다. 삽입된 유전자의 발현을 조절하기 위해 소수의 조절 DNA 염기서열이 사용되므로 이러한 염기서열은 대부분의 GM 작물에 존재합니다. 이 절차는 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 유전자인 35S 프로모터 유전자와 노팔린 합성효소 종결 유전자를 식별합니다. 35S 염기서열은 강력한 프로모터이며, 삽입된 유전자에 부착되면 지속적이고 높은 수준의 발현을 유도합니다. nopaline synthase terminator는 원하는 종말점에서 삽입된 유전자의 transcription을 중지하기 위해 포함됩니다.
PCR은 PCR 반응 튜브의 온도를 엄격하게 제어하는 기계인 열 순환기에서 반복적인 가열 및 냉각 주기를 포함합니다. 샘플을 94로 가열합니까? C는 DNA 가닥을 변성시키고 분리시킵니다. 45에서 65 사이로 급속 냉각? C는 프라이머가 분리된 DNA 가닥에 어닐링할 수 있도록 합니다. 마지막으로 72로 재가열합니까? C는 Taq 중합효소가 프라이머를 확장하고 타겟 영역을 완전히 복제할 수 있도록 합니다.
구입한 식물 프라이머는 각 샘플에 첨가되며 식물 DNA가 포함된 샘플에서 증폭됩니다. 35S 및 NOS에 대한 GMO 양성 템플릿은 GMO에 대한 양성 대조군을 제공하는 데 사용됩니다. 유전자 변형 성분 무함유 인증을 받은 항체는 음성 대조군으로 사용됩니다. 이러한 대조 반응 중 하나라도 예상치 못한 대역을 보이면 테스트 샘플의 결과를 신뢰할 수 없습니다.
증폭된 DNA는 전기영동에 의해 아가로스 겔을 통과합니다. PCR 산물은 염료와 혼합되어 웰에 적재됩니다. DNA는 음전하를 띠고 있으며, 챔버의 음극 끝단에서 겔에 로드되면 전류가 가해지면 양극 말단으로 이동합니다. 더 큰 DNA 단편은 겔 매트릭스를 통해 쉽게 이동할 수 없으므로 음극에 더 가깝게 머무르는 반면, 더 작은 염기서열은 양극 말단으로 이동하여 서로 다른 크기의 DNA를 별개의 밴드로 분리합니다.
전기영동 후 겔 염색은 분리된 DNA 밴드를 시각화하는 데 도움이 됩니다.
이제 GMO 검출의 원리와 GMO 식별을 위한 PCR 및 전기영동 사용의 원리에 익숙해졌으므로 실험실에서 이를 어떻게 수행할 수 있는지 살펴보겠습니다.
관심 식품이 식별되면 분석을 시작할 수 있습니다. DNA를 추출하려면 두 개의 깨끗한 스크류캡 튜브를 가지고 이들 각각에 500 ? 구매한 DNA 분리 시약의 L, 시약을 고르게 혼합하기 위해 분취액 사이에 혼합물을 위아래로 피펫팅해야 합니다. 튜브 중 하나에는 "non-GMO", 다른 하나는 "Test"라고 라벨을 붙입니다.
다음으로, 유전자 변형 성분이 없는 인증 식품 0.5g의 무게를 달아 깨끗한 절구에 넣습니다. 증류수 2.5mL를 넣고 절굿공이로 2분간 갈아서 슬러리를 만든다. 2.5mL의 증류수를 더 넣고 피펫을 낳을 수 있을 만큼 부드러워질 때까지 슬러리를 계속 분쇄합니다.
피펫 50 ? 알려진 non-GMO 슬러리의 L을 DNA 분리 시약을 포함하는 "non-GMO" 표지된 스크류캡 튜브로. 이제 50을 더하시겠습니까? 테스트 식품의 Lamp"Test"라고 표시된 스크류캡 튜브에 슬러리. 식품 샘플과 DNA 시약이 들어있는 두 개의 튜브를 1분 동안 소용돌이치십시오. 다음으로, 튜브를 95도의 수조에 넣으십시오. C 5분 동안 마지막으로 튜브를 원심분리기에 5분 동안 놓습니다. 검사 결과, 튜브 바닥에 고체 펠릿이 형성되어야 합니다. 5분 후에도 펠릿이 형성되지 않으면 펠릿이 형성될 때까지 2분 간격으로 다시 원심분리합니다. 이제 샘플을 PCR에 즉시 사용하거나 최대 1주일 동안 냉장고에 보관할 수 있습니다.
먼저 6개의 PCR 튜브를 엽니다. 이 숫자는 표에 나열된 튜브 내용물에 해당합니다. 라벨이 부착된 각 PCR 튜브를 캡을 연 상태로 마이크로튜브 홀더에 넣습니다.
각 추가에 대해 새로운 팁을 사용하여 20을 더하십시오. 표에 표시된 L 프라이머를 각 PCR 튜브에 연결합니다. 다음으로 20을 더합니다. 표에 표시된 DNA 샘플의 L을 각 PCR 튜브에 넣는다. 피펫을 위아래로 섞습니다. 펠릿 샘플의 경우 상층액에서만 피펫팅하고 튜브 바닥의 고체 펠릿을 피하십시오. 마지막으로 PCR 튜브를 열 순환기에 넣고 표에 표시된 가열 및 냉각 단계를 순환하도록 프로그래밍합니다.
3% 아가로스 겔을 웰이 음극 말단에 가장 가까운 전기영동 챔버에 놓습니다. TAE 버퍼를 챔버에 추가하여 젤 트레이 위 2mm를 덮습니다. 써모사이클러에서 PCR 튜브를 모아 마이크로튜브 홀더에 넣습니다. 매번 새로운 피펫 팁을 사용하여 10을 추가하십시오. 구입한 DNA의 L을 각 샘플에 염료를 적재하고 잘 섞습니다.
매번 새로운 팁을 사용하여 아가로스 젤의 웰에 20을 로드합니다. 1개의 우물로 분자량 통치자의 L, 및 20 ? L의 Lamp이 표에 표시된 대로 후속 우물로. 전기영동 챔버를 100V에서 30분 동안 작동하도록 설정합니다.
겔 작동이 완료되면 겔 챔버의 플러그를 조심스럽게 뽑고 트레이를 제거한 다음 겔을 염색 트레이에 밀어 넣습니다. 구입한 100x 젤 얼룩에 젤을 5분 동안 담그고 트레이를 부드럽게 흔들어 얼룩을 분산시킵니다. 얼룩이 생기면 젤을 세척 용기에 옮기고 약 10초 동안 수돗물로 헹굽니다. 따뜻한 수돗물에 3회씩 3회씩 부드럽게 흔들어 씻으면 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 필요한 경우 원하는 대비에 도달할 때까지 따뜻한 물에서 계속 탈염합니다.
레인 4에 200bp 밴드의 유무는 테스트 식품에 GMO가 포함되어 있는지 여부를 나타냅니다. 식물 프라이머는 샘플에서 식물 DNA가 성공적으로 추출되었는지 여부를 결정합니다. non-GMO 식품 통제는 위양성 결과가 발생할 경우 이를 나타내는 지표입니다. non-GMO 식품 대조군이 양성으로 나오면 PCR이 어느 시점에서 오염되었음을 의미합니다. GMO 양성 템플릿 컨트롤은 거짓 부정을 나타내는 지표입니다. GMO 양성 템플릿 컨트롤이 증폭되지 않으면 PCR 반응에 문제가 있는 것이며 테스트 식품의 GMO 음성 결과를 신뢰할 수 없습니다.
젤을 흰색 또는 노란색 종이에 올려 DNA 띠를 강조하기 위해 대비되는 배경을 제공하거나 UV 라이트 박스를 사용하여 대비를 높일 수 있습니다.
유전자 변형 성분에 대해 식품 또는 제품을 테스트하는 능력은 여러 과학 또는 규제 응용 분야와 관련이 있습니다.
유전자 변형 작물의 형질전환 DNA가 야생 작물 개체군의 게놈에 유입될 수 있다는 몇 가지 증거가 있습니다. 예를 들어, 꽃가루 매개자는 유전자 변형 공급원의 꽃가루로 야생형 식물에 비료를 주어 이러한 전달을 촉진할 수 있습니다. 이렇게 삽입된 유전자의 확산이 생태계 전체에 미치는 영향은 잘 알려져 있지 않기 때문에 이는 우려되는 점이다. 야생 개체군에 대한 PCR 검사는 유전자 삽입물의 잠재적 확산 또는 성공적인 봉쇄에 대한 데이터를 제공할 수 있습니다.
라벨링이 없거나 유전자 변형 성분에 대한 잘못된 라벨링은 소비자의 관심사가 될 수 있습니다. 이는 소비자의 소비 선호 또는 GM 과정에서 알레르기 항원의 잠재적 도입 때문일 수 있지만 후자는 논란의 여지가 있습니다. 일부 국가에서는 유전자 변형 성분을 식품 포장재에 표시해야 합니다. 이러한 국가의 규제 위원회는 PCR 검사를 사용하여 식품 표시의 정확성을 확인할 수 있습니다.
작물에 도입된 유전자 변형이 살충제 내성을 부여하는 경우, 일부 연구에서는 "슈퍼 잡초"의 생산에 대한 우려를 제기했습니다. 본질적으로, 이들은 도입 또는 교잡과 같은 메커니즘을 통해 살충제에 대한 내성을 얻는 변형 대상이 아닌 초기 변형 대상이 아닌 모든 식물일 수 있습니다. 그러면 이러한 식물은 더 성공적으로 퍼질 수 있으며 삽입물이 없는 식물보다 제어하기가 더 어려울 수 있습니다. 유전자 변형을 위한 PCR 검사는 이러한 확산이 문제가 될 수 있는지 확인하기 위해 이러한 잠재적 개체군을 강조하고 추적하는 데 도움이 될 수 있습니다.
당신은 방금 GMO 식품 테스트에 대한 JoVE의 소개를 시청했습니다. 이제 PCR을 사용하여 유전자 변형 식품을 식별하는 원리, 식품에서 DNA를 추출 및 증폭하는 방법, 식품 샘플이 유전자 변형되었는지 확인하는 방법을 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!
탈색 후, 젤은 35S 프로모터 및 NOS 종기 유전자에 대한 DNA 밴드가 겔상에 공지된 위치에 존재하는지 확인하기 위해 시험 식품레인(표 3)을보고 분석될 수 있다. 젤을 UV 라이트 박스에 놓아 대비를 증가시키는 데 도움이 될 수있습니다(도 1). 대안적으로, 젤은 DNA 밴드를 강조하기 위해 대조되는 배경을 제공하기 위해 흰색 또는 노란색 용지에 배치될 수있다(도 2).
그림 1. DNA의 분리 된 밴드를 보여주는 스테디닝 젤. 자외선 상자에 아가로즈 젤 전기 포에 이어 아가로즈 젤.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)은 DNA를 증폭시키는 데 사용되어 광범위한 DNA 실험실 테스트를 허용합니다. PCR로 지금 가능한 시험의 한 지역은 음식 작물의 유전 수정에 사용된 DNA 순서의 존재 또는 부재를 위해 시험해서 GMO를 확인하는 것입니다. 전형적으로, 작물은해충(그림 3),질병, 가뭄조건(도 4)등과 같은 이상적인 수율에 대한 자연적인 억제에 대한 이점을 부여하기 위해 유전자 변형됩니다. 이점은 작물 식물의 자신의 DNA에 다른 종의 유전 물질을 삽입하여 얻을 수 있기 때문에, 잠재적 인 인간의 건강과 환경 위험은 GMO의 사용으로 확인되었습니다. 한 가지 환경 적 관심사는 유전자 변형 된 DNA가 수분 과정을 통해 의도치 않게 교환되는 능력이며, 이는 비 GMO로 판매될 작물의 게놈에 들어가는 유전자 변형 DNA로 이어질 수 있습니다.
Chapters in this video
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Overview
1:41
Principles of Identifying Genetically Modified Foods using PCR
4:44
Extraction of DNA from Food Samples
6:35
Setting up PCR
7:30
Electrophoresis of PCR Products
9:07
Results
10:10
Applications
12:15
Summary
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