고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 고정상과의 다양한 상호 작용을 기반으로 액체 혼합물의 구성 요소를 분리하는 매우 다재다능한 기술입니다.

HPLC는 컬럼 크로마토그래피를 개조한 것입니다. 컬럼 크로마토그래피에서 컬럼은 고정상(stationary phase)이라고 하는 마이크로 스케일 비드로 충전됩니다. 고정상 비드는 비드와 액체 또는 이동상에 위치한 혼합물의 구성 요소 사이의 상호 작용을 유도하는 화학 그룹으로 기능화됩니다. 혼합물이 컬럼을 통해 흐를 때 성분은 고정상과 다르게 상호 작용합니다.

HPLC에서 컬럼 크로마토그래피는 기존 컬럼 크로마토그래피보다 더 높은 유속과 더 높은 압력에서 수행됩니다. 이를 통해 표면적 대 부피 비율이 더 큰 더 작은 고정상(stationary phase) 비드를 사용할 수 있으며, 이는 이동상에서 고정상과 성분의 상호 작용을 크게 증가시킵니다.

이 비디오는 다양한 다이어트 소다의 성분을 분리하는 방법을 시연하여 HPLC 작동의 기초를 소개합니다.

실험실에서 사용되는 HPLC에는 분석용 HPLC와 분취용의 두 가지 유형이 있습니다. 분석용 HPLC에서 기기는 소량의 성분을 식별하는 데 사용되며 분석된 샘플은 폐기물로 폐기됩니다. 분취용 HPLC에서 기기는 혼합물을 정제하는 데 사용되며 원하는 양의 각 성분이 분획으로 수집됩니다.

HPLC 기기는 일련의 간단한 구성 요소로 구성됩니다. 먼저, 용매 저장조에 유지되는 이동상은 일정한 유속으로 하나 이상의 펌프에 의해 시스템을 통해 펌핑됩니다. 샘플은 샘플 주입기에 의해 이동상 스트림으로 주입됩니다. 이동상에 의해 희석된 샘플은 HPLC 컬럼으로 전달되어 샘플의 구성 요소가 분리됩니다. 그런 다음 검출기에 의해 성분을 분석하고 나중에 사용하기 위해 분획으로 저장하거나 폐기물 병으로 옮깁니다.

HPLC 컬럼은 시스템의 핵심 구성 요소입니다. 그것은 금속 또는 플라스틱 실린더로 구성되며, 고정상 또는 크로마토 그래피 수지의 마이크로 스케일 비드로 포장되어 있습니다. 샘플 혼합물은 일정한 유속으로 충전된 입자층을 통해 흐르고 각 구성 요소는 흐름에 따라 고정상과 상호 작용합니다.

화합물은 고정상과 다르게 상호 작용하므로 다른 속도로 컬럼의 길이를 따라 검출기로 이동합니다. 성분이 컬럼을 빠져나가거나 용리하는 데 필요한 시간을 머무름 시간이라고 합니다. 그 결과 머무름 시간 대 강도의 플롯 또는 크로마토그램이 생성됩니다. 보존 시간은 구성 요소를 식별하는 데 사용됩니다. 피크 크기, 특히 피크 아래 면적은 초기 용액에 있는 화합물의 양을 정량화하는 데 사용됩니다.

고정상의 선택은 샘플 혼합물에 있는 성분의 특성에 따라 달라집니다. 가장 일반적으로 사용되는 고정상은 실리카 비드(silica bead)로, 마이크로 스케일 비드를 형성하고 충분한 패킹 밀도를 달성하는 불활성 비극성 물질이기 때문입니다. HPLC의 가장 일반적인 유형은 역상 크로마토그래피로, 소수성 고정상, 일반적으로 비드 표면에 결합된 C18 사슬이 있는 실리카 비드를 사용합니다. 구성 요소는 극성이 감소하는 순서로 용리됩니다.

역상 크로마토그래피에 사용되는 이동상은 일반적으로 물과 아세토니트릴과 같은 유기 용매의 혼합물입니다. 샘플에 따라 이동상은 물과 유기 용매의 일정한 비율을 유지할 수 있으며, 이를 등용매 모드(isocratic mode)라고 합니다. 그러나 이것은 수분 함량이 높은 경우 넓은 피크 또는 유기물 함량이 높은 경우 겹치는 피크로 이어질 수 있습니다.

또한 이동상 비율은 분리 중에 선형 또는 단계적으로 변경하여 이동상 구배를 생성할 수 있습니다. 그래디언트 용리는 극성이 적은 성분의 피크 확장을 방지하여 분리를 개선하고 용리 시간을 단축할 수 있습니다.

이제 HPLC의 기본 사항을 설명했으므로 실험실에서 HPLC 기술을 시연할 것입니다. 이 실험에서 HPLC는 다이어트 소다의 세 가지 일반적인 구성 요소를 분리하고 정량화하는 데 사용됩니다.

먼저, 이동상을 준비하기 위해 정제된 탈이온수 1.5L에 아세토니트릴 400mL를 첨가합니다. 그런 다음 빙초산 2.4mL를 조심스럽게 첨가하십시오. 용액을 총 부피 2L로 희석합니다. 결과 용액의 pH는 2.8에서 3.2 사이여야 합니다.

보정된 pH 측정기를 사용하여 교반 용액에 40% NaOH를 적방울 방향으로 첨가하여 pH를 4.2로 조정합니다.

진공 상태에서 0.47μm 멤브레인 필터를 통해 이동상을 여과하여 용액의 가스를 제거하고 컬럼을 막을 수 있는 고형물을 제거합니다. 기포는 고정상에서 공극을 유발하거나 검출기 셀로 이동하여 측정을 불안정하게 만들 수 있으므로 용액의 가스를 제거하는 것이 중요합니다.

카페인, 벤조에이트, 아스파탐의 세 가지 구성 요소를 준비하며, 이는 다이어트 탄산음료의 세 가지 일반적인 구성 요소입니다. 그런 다음 이러한 구성 요소 솔루션을 사용하여 미지 물질을 결정하는 데 사용할 표준 솔루션을 준비합니다. 카페인과 벤조에이트 용액 500mL를 준비합니다.

아스파탐 성분 용액 100mL를 준비합니다. 사용하지 않을 때는 분해를 방지하기 위해 용액을 냉장고에 보관하십시오.

다음으로, 각각 다른 농도의 카페인, 벤조에이트 및 아스파탐을 함유한 7가지 표준 용액을 준비합니다. 각 성분을 적당량의 부피 플라스크에 피펫으로 주입하고 이동상으로 50mL 표시까지 희석합니다.

처음 3개의 솔루션에는 각각 하나의 성분이 포함되어 있어 피크 식별이 가능합니다. 다른 4개의 용액에는 피크 높이와 농도의 상관관계를 파악하기 위해 3가지 성분 모두의 농도 범위가 포함되어 있습니다.

각 표준 용액을 시료 랙의 라벨이 부착된 바이알에 붓습니다. 샘플과 함께 샘플 랙을 보관하십시오.amples와 나머지 용액은 냉장고에 보관합니다.

먼저 이동상과 폐기물 용기를 설정합니다. 폐기물 라인이 폐기물 용기에 공급되고 이동상으로 다시 재활용되지 않는지 확인하십시오. 입구 이동상선이 이동상 용기에 공급되는지 확인합니다.

이동상의 유속이 0.5mL/분으로 설정되어 있는지 확인합니다. 이 유속은 모든 성분이 5분 이내에 용리될 수 있도록 하지만 개별 피크의 분리능을 보장할 만큼 느립니다.

다음으로, 용매 전달 시스템의 최소 및 최대 압력을 확인합니다. 이 설정은 각각 누출 또는 막힘이 발생할 경우 펌프를 차단합니다.

감지기 전면 패널에서 "0"을 눌러 블랭크를 설정합니다. 100-을 헹굽니다. L 탈이온수로 주사기를 넣은 다음 7 작업 표준 중 1 개의 여러 볼륨으로 주사기를 사용합니다. 그런 다음 주사기에 해당 용액을 채웁니다. 각 성분의 피크를 식별하기 위해 3개의 단일 성분 샘플로 시작합니다.

다음으로, 주입기 핸들을 로드 위치에 놓아 용액을 수동으로 주입합니다. 천천히 주입 100 ? L은 격막 포트를 통한 용액입니다.

데이터 수집 프로그램이 300초 동안 데이터를 수집하도록 설정되어 있는지 확인하여 3개의 피크가 모두 검출기를 통해 용리될 수 있는 충분한 시간을 허용합니다. 시험을 시작할 준비가 되면 주입기 핸들을 주입 위치로 돌려 샘플을 이동상에 주입합니다. 즉시 데이터 수집 프로그램에서 "평가판 시작"을 클릭하십시오. 스캔이 완료되면 7가지 표준 솔루션 각각에 대해 프로세스를 반복합니다. 처음 3개의 표준물질 각각에 대해 3개의 봉우리 중 하나만 나타납니다. 성분을 식별하는 데 사용되는 피크의 위치를 기록해 둡니다.

3개의 다이어트 소다 샘플을 선택하고 탄산을 제거하기 위해 열린 용기에 밤새 그대로 두십시오.

밤새 가스를 제거한 후 각 다이어트 소다당 약 3mL를 플라스틱 주사기에 넣습니다. 다음으로, 필터 팁을 주사기에 부착하고 필터를 통해 소다를 유리 바이알에 밀어 넣어 고체 입자를 제거합니다.

각 샘플 2mL를 이동상 2mL로 희석하여 소다 농도를 절반으로 줄입니다.

100 무승부 ? 소다 샘플 중 하나의 L을 주사기에 넣고 샘플 루프에 주입합니다. 표준 솔루션과 동일한 매개 변수를 사용하여 평가판을 실행합니다. 각 소다 샘플에 대해 반복합니다.

먼저, 표준 샘플의 피크 면적을 알려진 농도와 연관시킵니다. 이를 위해서는 삼각형 분석법을 사용하여 각 표준물질 시료에 대한 크로마토그래프의 피크 면적을 측정하십시오. 높이의 절반에 있는 너비를 사용하여 피크 높이 시간을 계산하고 이 값을 피크 영역으로 사용합니다.

피크 면적과 알려진 농도를 사용하여 각 성분에 대한 검량선을 생성하고 각 검량선에 대한 최소 제곱 적합도를 결정합니다.

피크 영역에서 다이어트 소다의 각 성분 농도를 계산합니다. 탄산음료는 HPLC에 주입하기 전에 모두 2배로 희석되었음을 기억하십시오. 이 결과를 바탕으로 12온스 소다 캔에 있는 각 성분의 mg을 계산합니다.

당연히 테스트된 3가지 탄산음료에는 모두 거의 같은 양의 방부제 벤조에이트가 포함되어 있었습니다. 그러나 콜라 제품에는 더 많은 카페인이 포함되어 있었습니다. 모든 구성 요소에 대해 계산된 값은 제조업체가 보고한 값과 잘 상관되었습니다.

HPLC는 광범위한 분석에 사용되는 다목적 기기입니다.

HPLC는 종종 펩타이드 분자를 정제하는 데 사용됩니다. 이 예에서는 막관통 펩타이드 복합체를 준비한 다음 단백질을 이황화 결합으로 산화적 가교결합시켜 안정화했습니다.

그런 다음 단백질을 포름산에 용해시키고 역상 HPLC를 사용하여 정제했습니다. 그런 다음 두 용매의 선형 구배를 사용하여 샘플을 용리하고 질량 분석법으로 순도를 확인했습니다.

HPLC는 실험실에서 합성된 유기 화합물을 식별하는 데에도 사용할 수 있습니다. 밀러-유리(Miller-Urey) 실험에서는 원시 지구에서 유기 화합물의 비생물적 합성이 연구되었다. 메탄과 암모니아와 같은 원시 가스는 물이 들어있는 플라스크에 도입되어 초기 바다를 시뮬레이션했습니다. 그런 다음 원시 지구의 번개를 모방하여 전기 방전을 가했습니다.

그런 다음 질량 분석법과 결합된 HPLC를 사용하여 물을 분석하고 알려진 아미노산 표준물과 비교했습니다. 이 실험에서 23개의 아미노산을 합성하여 확인했습니다.

JoVE의 HPLC 소개를 시청하셨습니다. 이제 기기 실행 및 결과 데이터 분석의 기본 사항을 이해해야 합니다.

시청해 주셔서 감사합니다!