지난 20세기 초, 영국의 세균학자 프레더릭 그리피스(Frederick Griffith)는 폐렴을 유발하는 박테리아인 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)을 연구하고 있었습니다. 그는 두 가지 다른 균주를 사용하여 간단한 실험을 수행했습니다. 한 가지 균주는 S 균주로 알려져 있는데, 그 이유는 보호 캡슐이 형성하는 군체나 덩어리를 매끄럽게 보이게 하고 독성이 있거나 해롭기 때문입니다. 두 번째는 R 균주로, 보호 캡슐이 없는 박테리아의 한 버전으로, 군체가 거칠게 보이고 독성이 없게 되었습니다.
먼저 Griffith는 S 균주 박테리아 중 일부를 취하여 가열하여 S 균주의 열 사멸 버전을 생성했습니다. 그런 다음 그는 쥐 몇 마리를 모아 네 그룹으로 나누었습니다. 그는 첫 번째 그룹에는 악성 S 균주를, 두 번째 그룹에는 비독성 R 균주를 주사했습니다. 그는 세 번째 그룹에 열에 의해 사멸된 S 균주를 투여하고, 마지막으로 열에 의해 사멸된 S 균주와 R 균주를 함께 결합하고, 이 혼합물을 네 번째 그룹에 주입했습니다. 예상대로 첫 번째 그룹의 쥐는 죽었고 두 번째와 세 번째 그룹의 쥐는 살았습니다. 그러나 그리피스는 놀랍게도 마지막 그룹의 쥐들도 죽었다.
1928년 그의 연구를 발표했을 때, 그는 이전에 독성이 없었던 균주가 치명적으로 변할 수 있도록 하는 근본적인 변형 원리의 존재를 추측하면서 이 신비한 과정 변형이라고 불렀습니다. 그 후 1943년에 Avert, MacLeod 및 McCarty는 이 변형 원리가 현재 우리가 유전 물질로 알고 있는 데옥시리보 핵산(DNA)일 가능성이 있다고 보고했습니다. 그리피스의 실험에서 근본적으로 일어난 일은 박테리아가 결합되었을 때, 일부 DNA가 열에 의해 죽은 S 균주에서 R 균주 세포로 누출되어 이 비독성 박테리아를 변형시키고 보호 캡슐을 만들기 위한 정보를 전달하여 R 균주를 악성 캡슐로 바꾸어 이제 네 번째 그룹의 동물을 죽일 수 있다는 것입니다.
오늘날로 빠르게 나아가 과학자들은 박테리아 E. coli와 플라스미드라고 하는 DNA의 작은 원형 고리를 사용하여 박테리아 변형을 연구하는 훨씬 더 간단한 방법을 개발했습니다. 일반적으로 형질전환 실험에 사용되는 플라스미드에는 항생제 내성과 같은 특수 기능을 위한 유전자가 포함되어 있습니다. 대장균은 환경으로부터 DNA를 흡수하는 능력인 능력(competence)이라는 특성을 나타낼 수 있기 때문에 변형을 위한 훌륭한 주제입니다. 근본적으로, 이것은 화학 물질이나 전기 또는 열 충격과 같은 특정 환경 조건 하에서 대장균의 세포벽이 일시적으로 투과될 수 있고 환경에서 DNA를 흡수할 수 있음을 의미합니다. 플라스미드가 대장균 내부에 들어가면 새로운 숙주 세포의 세포질에 머물며 게놈과 함께 여러 세대에 걸쳐 복제 및 발현되거나 숙주의 게놈에 완전히 통합될 수 있습니다. 박테리아가 어느 시점에서든 플라스미드를 잃게 되면 세포도 항생제 내성을 잃게 되므로 과학자들은 관심 플라스미드를 함유한 박테리아만 살아남을 수 있도록 항생제가 포함된 배지에서 박테리아를 성장시킵니다.
이 실험실에서는 항생제 내성 유전자가 포함된 플라스미드로 대장균 세포를 형질전환시키는 방법을 배우면서 멸균 미생물 기술을 실습합니다.
배경
20세기 초, 폐렴은 전염병 사망의 상당 부분을 차지했다1. 폐렴에 대한 효과적인 백신을 개발하기 위해 프레드릭 그리피스(Frederick Griffith)는 폐렴구균의 두 가지 다른 균주, 즉 외형이 거친 비독성 균주(R-균주)와 외부 다당류 캡슐2로 인해 부드러운 외관을 가진 악성 균주(S-균주)에 대한 연구에 착수했습니다. 이 S 균주 박테리아의 바깥층은 숙주 면역 체계를 견딜 수 있게 해주었고, 결국 생명을 위협하는 질병으로 이어졌습니다. 그리피스가 두 균주 중 하나로 죽인 박테리아를 쥐에게 따로 주입했을 때, 쥐는 살았다. 그러나 그가 열에 의해 죽은 S-균주와 살아있는 R-균주의 조합을 쥐에게 주입했을 때, 쥐는죽었다 2. 그는 이 조합을 주입한 죽은 쥐에서 얻은 샘플을 분석했을 때 살아있는 S 균주 박테리아가 존재하는 것을 관찰했습니다. 1928년, 그리피스는 무독성 박테리아를 독성 균주로 변화시키기 위해서는 "변형" 과정이 발생했음에 틀림없다고 지적했다. 박테리아 형질전환의 첫 번째 발견으로 알려진 그의 발견은 유전 공학의 필수 도구인 형질전환3의 개발을 위한 길을 열었습니다.
형질전환(transformation)은 환경으로부터 DNA를 섭취함으로써 발생하는 세포의 유전적 변화입니다. Griffith의 실험에서 S 균주 박테리아의 보호 다당류 코팅을 암호화하는 DNA는 열 충격에서 분해되지 않고 R 균주에 도입되어 R 균주가 쥐의 면역 체계를 우회할 수 있도록 했습니다. 이 과정은 야생에서 유기체와 심지어 다른 종 사이에서 지속적으로 발생하지만, 과학자들은 연구 목적으로 실험실 환경에서 박테리아를 변형시킵니다4.
플라스미드를 이용한 세균 형질전환
박테리아는 외인성 유전 물질을 게놈으로 쉽게 흡수하고 빠르게 증폭할 수 있기 때문에 형질전환에 이상적인 유기체입니다3,5. 그들은 하나의 원형 염색체와 세포질 내에 플라스미드라고 하는 이중 가닥 DNA의 여러 개의 작은 원형 조각을 가지고 있습니다. 이러한 플라스미드는 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있으며 일반적으로 항생제에 대한 내성과 같은 특정 기능적 이점을 제공합니다6,7. 자연 환경에서 박테리아는 접합(conjugation)8이라는 과정을 통해 다른 박테리아로부터 플라스미드를 흡수하여 "박테리아 변형"을 겪습니다. 더욱이, 그들이 번식할 때, 그들의 자손들은 각각 새로운 플라스미드의 사본을 받는다.
실험 목적으로 사용되는 Plasmid는 plasmid vectors라고 합니다. 실험실 환경에서 과학자들은 DNA 단편을 플라스미드 벡터에 삽입하여 길이가 약 5,000-10,000 염기쌍인 "재조합 플라스미드"를 인위적으로 만들 수 있습니다. 이러한 재조합 플라스미드는 일반적으로 ORI(origin of replication), 항생제 내성 유전자, 다중 클로닝 부위, promoter, selection marker 및 관심 유전자와 같은 특정 구성 요소를 가지고 있습니다. 복제의 원점은 복제가 시작되는 곳입니다. 항생제 내성 유전자는 플라스미드를 흡수하는 박테리아가 특정 항생제가 있는 상태에서 플레이트에서 생존할 수 있도록 합니다. 플라스미드는 DNA의 비교적 작은 조각이지만, 과학자들은 플라스미드가 세포막을 통해 침투할 수 있도록 숙주 세포를 처리해야 합니다. 따라서 형질전환의 효율성은 숙주막의 다공성과 직접적인 관련이 있습니다. 한 가지 일반적인 접근 방식은 염화칼슘 용액9으로 처리된 박테리아에 열 충격을 가하는 것입니다. 플라스미드를 포함하지 않는 박테리아는 변형되지 않으므로 플레이트에서 생존하고 눈에 띄는 데 저항력이 없습니다. 여러 클로닝 부위는 관심 유전자를 삽입하고 결찰할 수 있는 플라스미드를 절단하기 위한 제한 효소 부위를 포함함으로써 DNA 삽입을 돕습니다. promoter는 관심 유전자의 전사를 유도합니다. 일반적으로 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 단백질과 같은 마커로 표시되거나 추가 항생제 내성 유전자일 수 있습니다. 항생제 내성 유전자 및 기타 선택 마커는 수집된 박테리아에 관심 플라스미드가 포함되어 있는지 여부를 결정하는 데 도움이 됩니다.
응용 프로그램
효과적인 형질전환 방법을 통해 과학자들은 유전자와 유전자 산물을 분리하고 프로파일링할 수 있었으며, 효과적인 약물 개발, 유전자 변형 작물 개발, 첨단 진단 도구 등 생명과학 및 의학 분야에서 많은 발전을 이뤘다10. 또한 기술 발전으로 새로운 혁신 방법이 등장했습니다. 예를 들어, Gateway Cloning을 사용하면 여러 DNA 단편을 서로 다른 벡터에 삽입할 수 있을 뿐만 아니라 plasmid11 간에 DNA 염기서열을 전달할 수 있습니다. 또한, CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas9은 게놈의 뉴클레오티드를 직접 변형하는 유전자 편집 기술이며 플라스미드12를 사용할 필요가 없습니다. 형질전환 후 연구자들은 종종 관심 유전자와 그 산물을 분리하고 프로파일링합니다. 그 결과, 유전자 복제의 전 과정은 유전자 조작의 새로운 분야를 열었습니다. 유전자 복제 덕분에, 연구자들은 당뇨병 환자를 치료하기 위한 인슐린과 같은 특정 인간 단백질을 다량 생산하도록 박테리아를 조작할 수 있다10. 복제는 또한 현대 농업에서 매우 중요한 역할을 했습니다. 유전자 변형 생물체(GMO)는 유전자 복제와 박테리아 형질전환의 직접적인 결과입니다10. 예를 들어, 과학자들은 식량 생산을 늘리고 비료 사용을 줄여 비료의 경제적, 환경적 영향을 줄이기 위해 게놈에 질소 고정 유전자를 통합한 유전자 변형 작물을 생산하기 위해 노력하고 있습니다13. 요컨대, 박테리아 형질전환은 현대 생명공학의 첫 번째 단계이자 미래 연구 발견의 기초입니다.
참조
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지난 20세기 초, 영국의 세균학자 프레더릭 그리피스(Frederick Griffith)는 폐렴을 유발하는 박테리아인 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)을 연구하고 있었습니다. 그는 두 가지 다른 균주를 사용하여 간단한 실험을 수행했습니다. 한 가지 균주는 S 균주로 알려져 있는데, 그 이유는 보호 캡슐이 형성하는 군체나 덩어리를 매끄럽게 보이게 하고 독성이 있거나 해롭기 때문입니다. 두 번째는 R 균주로, 보호 캡슐이 없는 박테리아의 한 버전으로, 군체가 거칠게 보이고 독성이 없게 되었습니다.
먼저 Griffith는 S 균주 박테리아 중 일부를 취하여 가열하여 S 균주의 열 사멸 버전을 생성했습니다. 그런 다음 그는 쥐 몇 마리를 모아 네 그룹으로 나누었습니다. 그는 첫 번째 그룹에는 악성 S 균주를, 두 번째 그룹에는 비독성 R 균주를 주사했습니다. 그는 세 번째 그룹에 열에 의해 사멸된 S 균주를 투여하고, 마지막으로 열에 의해 사멸된 S 균주와 R 균주를 함께 결합하고, 이 혼합물을 네 번째 그룹에 주입했습니다. 예상대로 첫 번째 그룹의 쥐는 죽었고 두 번째와 세 번째 그룹의 쥐는 살았습니다. 그러나 그리피스는 놀랍게도 마지막 그룹의 쥐들도 죽었다.
1928년 그의 연구를 발표했을 때, 그는 이전에 독성이 없었던 균주가 치명적으로 변할 수 있도록 하는 근본적인 변형 원리의 존재를 추측하면서 이 신비한 과정 변형이라고 불렀습니다. 그 후 1943년에 Avert, MacLeod 및 McCarty는 이 변형 원리가 현재 우리가 유전 물질로 알고 있는 데옥시리보 핵산(DNA)일 가능성이 있다고 보고했습니다. 그리피스의 실험에서 근본적으로 일어난 일은 박테리아가 결합되었을 때, 일부 DNA가 열에 의해 죽은 S 균주에서 R 균주 세포로 누출되어 이 비독성 박테리아를 변형시키고 보호 캡슐을 만들기 위한 정보를 전달하여 R 균주를 악성 캡슐로 바꾸어 이제 네 번째 그룹의 동물을 죽일 수 있다는 것입니다.
오늘날로 빠르게 나아가 과학자들은 박테리아 E. coli와 플라스미드라고 하는 DNA의 작은 원형 고리를 사용하여 박테리아 변형을 연구하는 훨씬 더 간단한 방법을 개발했습니다. 일반적으로 형질전환 실험에 사용되는 플라스미드에는 항생제 내성과 같은 특수 기능을 위한 유전자가 포함되어 있습니다. 대장균은 환경으로부터 DNA를 흡수하는 능력인 능력(competence)이라는 특성을 나타낼 수 있기 때문에 변형을 위한 훌륭한 주제입니다. 근본적으로, 이것은 화학 물질이나 전기 또는 열 충격과 같은 특정 환경 조건 하에서 대장균의 세포벽이 일시적으로 투과될 수 있고 환경에서 DNA를 흡수할 수 있음을 의미합니다. 플라스미드가 대장균 내부에 들어가면 새로운 숙주 세포의 세포질에 머물며 게놈과 함께 여러 세대에 걸쳐 복제 및 발현되거나 숙주의 게놈에 완전히 통합될 수 있습니다. 박테리아가 어느 시점에서든 플라스미드를 잃게 되면 세포도 항생제 내성을 잃게 되므로 과학자들은 관심 플라스미드를 함유한 박테리아만 살아남을 수 있도록 항생제가 포함된 배지에서 박테리아를 성장시킵니다.
이 실험실에서는 항생제 내성 유전자가 포함된 플라스미드로 대장균 세포를 형질전환시키는 방법을 배우면서 멸균 미생물 기술을 실습합니다.
지난 20세기 초, 영국의 세균학자 프레더릭 그리피스(Frederick Griffith)는 폐렴을 유발하는 박테리아인 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)을 연구하고 있었습니다. 그는 두 가지 다른 균주를 사용하여 간단한 실험을 수행했습니다. 한 가지 균주는 S 균주로 알려져 있는데, 그 이유는 보호 캡슐이 형성하는 군체나 덩어리를 매끄럽게 보이게 하고 독성이 있거나 해롭기 때문입니다. 두 번째는 R 균주로, 보호 캡슐이 없는 박테리아의 한 버전으로, 군체가 거칠게 보이고 독성이 없게 되었습니다.
먼저 Griffith는 S 균주 박테리아 중 일부를 취하여 가열하여 S 균주의 열 사멸 버전을 생성했습니다. 그런 다음 그는 쥐 몇 마리를 모아 네 그룹으로 나누었습니다. 그는 첫 번째 그룹에는 악성 S 균주를, 두 번째 그룹에는 비독성 R 균주를 주사했습니다. 그는 세 번째 그룹에 열에 의해 사멸된 S 균주를 투여하고, 마지막으로 열에 의해 사멸된 S 균주와 R 균주를 함께 결합하고, 이 혼합물을 네 번째 그룹에 주입했습니다. 예상대로 첫 번째 그룹의 쥐는 죽었고 두 번째와 세 번째 그룹의 쥐는 살았습니다. 그러나 그리피스는 놀랍게도 마지막 그룹의 쥐들도 죽었다.
1928년 그의 연구를 발표했을 때, 그는 이전에 독성이 없었던 균주가 치명적으로 변할 수 있도록 하는 근본적인 변형 원리의 존재를 추측하면서 이 신비한 과정 변형이라고 불렀습니다. 그 후 1943년에 Avert, MacLeod 및 McCarty는 이 변형 원리가 현재 우리가 유전 물질로 알고 있는 데옥시리보 핵산(DNA)일 가능성이 있다고 보고했습니다. 그리피스의 실험에서 근본적으로 일어난 일은 박테리아가 결합되었을 때, 일부 DNA가 열에 의해 죽은 S 균주에서 R 균주 세포로 누출되어 이 비독성 박테리아를 변형시키고 보호 캡슐을 만들기 위한 정보를 전달하여 R 균주를 악성 캡슐로 바꾸어 이제 네 번째 그룹의 동물을 죽일 수 있다는 것입니다.
오늘날로 빠르게 나아가 과학자들은 박테리아 E. coli와 플라스미드라고 하는 DNA의 작은 원형 고리를 사용하여 박테리아 변형을 연구하는 훨씬 더 간단한 방법을 개발했습니다. 일반적으로 형질전환 실험에 사용되는 플라스미드에는 항생제 내성과 같은 특수 기능을 위한 유전자가 포함되어 있습니다. 대장균은 환경으로부터 DNA를 흡수하는 능력인 능력(competence)이라는 특성을 나타낼 수 있기 때문에 변형을 위한 훌륭한 주제입니다. 근본적으로, 이것은 화학 물질이나 전기 또는 열 충격과 같은 특정 환경 조건 하에서 대장균의 세포벽이 일시적으로 투과될 수 있고 환경에서 DNA를 흡수할 수 있음을 의미합니다. 플라스미드가 대장균 내부에 들어가면 새로운 숙주 세포의 세포질에 머물며 게놈과 함께 여러 세대에 걸쳐 복제 및 발현되거나 숙주의 게놈에 완전히 통합될 수 있습니다. 박테리아가 어느 시점에서든 플라스미드를 잃게 되면 세포도 항생제 내성을 잃게 되므로 과학자들은 관심 플라스미드를 함유한 박테리아만 살아남을 수 있도록 항생제가 포함된 배지에서 박테리아를 성장시킵니다.
이 실험실에서는 항생제 내성 유전자가 포함된 플라스미드로 대장균 세포를 형질전환시키는 방법을 배우면서 멸균 미생물 기술을 실습합니다.
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