Summary
कृंतक श्वसन फिजियोलॉजी और airway भड़काऊ कोशिकाओं के नमूने के बार - बार माप वांछनीय हैं, लेकिन आम तौर पर संभव नहीं है. यहाँ हम मौखिक रूप से चूहों कि airway और airway भड़काऊ कोशिकाओं के hyperreactivity नमूने के दोहराया माप परमिट intubating के लिए एक repeatable विधि का वर्णन.
Abstract
Airway hyperreactivity (Ahr) माप और bronchoalveolar lavage (बाल) द्रव नमूना प्रयोगात्मक अस्थमा मॉडल के लिए आवश्यक हैं, लेकिन दोहराया प्रक्रियाओं के लिए एक ही पशुओं में इस तरह के मापन प्राप्त आम तौर पर संभव नहीं हैं. यहाँ, हम चूहों से Ahr और bronchoalveolar lavage द्रव नमूनों की दोहराया माप प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है. चूहे intranasally चुनौती दी थी एक शक्तिशाली allergen या नकली इलाज के साथ 14 दिनों से अधिक सात बार. प्रारंभिक चुनौती के पहले, और प्रत्येक intranasal चुनौती निम्नलिखित 24 घंटे के भीतर, एक ही जानवरों anesthetized थे, मौखिक रूप से intubated और यंत्रवत् हवादार. Ahr, दिखावा और allergen को चुनौती दी जानवरों के बीच acetylcholine क्लोराइड (ACH) की नसों में खुराक में वृद्धि द्वारा प्रेरित श्वसन प्रणाली (आरआरएस) प्रतिरोध की खुराक प्रतिक्रिया घटता की तुलना द्वारा मूल्यांकन निर्धारित किया गया है. बाद में, और एक ही इंटुबैषेण के माध्यम से, बाएं फेफड़े इतना कि airway कोशिकाओं के अंतर गणन निष्पादित किया जा सकता है lavaged था. इन अध्ययनों से पता चलता है कि Ahr और बाल द्रव संग्रह दोहराया माप एक ही जानवरों से संभव हो रहे हैं और है कि अधिक से अधिक airway hyperresponsiveness और airway eosinophilia allergen चुनौती की शुरुआत के 7-10 दिनों के भीतर प्राप्त कर रहे हैं. इस उपन्यास तकनीक काफी अनुदैर्ध्य प्रयोग के लिए आवश्यक चूहों की संख्या कम कर देता है और विविध कृंतक प्रजातियों, रोग मॉडल और airway फिजियोलॉजी उपकरणों के लिए लागू है.
Protocol
Allergen चुनौती:
- C57BL 6 / चूहों, उम्र के 4-8 सप्ताह, एक airtight plexiglass 10 मिनट के लिए गहरी सामान्य संज्ञाहरण प्राप्त के लिए एक 3.2% ऑक्सीजन वाष्प मिश्रण में isoflurane साथ purged कक्ष में anesthetized हैं.
- Intranasal allergen चुनौतियों (45μL (22.5 μg) OVA और 7μL ए (7 μg) पीबीएस में, Oryzae) प्रशासित हर मंगलवार को कर रहे हैं, गुरुवार और रविवार को लगातार सात अनुप्रयोगों के एक कुल के लिए.
संज्ञाहरण:
- पहले प्रत्येक allergen चुनौती देने के लिए, और 7 चुनौती के बाद चूहों के 48 मिलीग्राम / किग्रा etomidate (2 मिलीग्राम / एमएल) की intraperitoneal इंजेक्शन प्रशासित रहे हैं, प्रकाश छोड़कर संदूक में नियुक्ति के लिए पहले.
- विषय गोदाम में रहता है जब तक नमूदार स्नायविक प्रतिक्रिया की कमी के दबाव के हिंद पंजे (5-10 मिनट) के लिए आवेदन पर पता चला है.
इंटुबैषेण:
- एक उज्ज्वल गर्मी दीपक, एक दूरी पर रखा ~ 37 डिग्री सेल्सियस शरीर कोर तापमान, हाइपोथर्मिया को रोकने प्रक्रिया भर में इस विषय पर ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए के रखरखाव सुनिश्चित करने. एक गुदा थर्मामीटर कम से कम प्रयोग किया जाना चाहिए शुरू euthermia गर्मी इस्तेमाल किया स्रोत की परवाह किए बिना पुष्टि.
महत्वपूर्ण कदम प्रायोगिक पशुओं द्वारा प्राप्त सभी तरल पदार्थ और उपकरणों बाँझ होना चाहिए, प्रक्रियाओं सख्त सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत किया जाना चाहिए. जबकि संज्ञाहरण के तहत लम्बे समय तक हाइपोथर्मिया न्यायपालिका डेटा और / या जानवरों की मौत के लिए नेतृत्व करेंगे. सभी आक्रामक प्रक्रियाओं के साथ क्षमता जीवित जानवरों पर काम करने का प्रयास करने से पहले शव का पशुओं का उपयोग कर विकसित किया जाना चाहिए. नेत्र स्नेहक के लिए सामान्य संज्ञाहरण के तहत जानवरों के corneal abrasions को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. - Anesthetized चूहों गोदाम से हटा रहे हैं और लेटा हुआ (ventral तरफ ऊपर) plethysmograph मेज पर स्थिति में रखा, एक 45 डिग्री कोण को समायोजित.
- एक रबर तालिका encircling बैंड incisors की शीर्ष पंक्ति के पीछे डाला जाता है तो जगह में इस विषय को सुरक्षित करने के लिए. दाहिने हाथ में चिमटी के साथ, पकड़, विस्तार, और यह एक बाएं हाथ में कष्टकारक धातु के साथ जगह में हासिल करने से पहले मुंह से जीभ लिफ्ट, इस प्रकार इंटुबैषेण के लिए एक बेरोक airway की अनुमति.
- एक 0.8 मिमी व्यास fiberoptic धागा, एक प्रकाश स्रोत से जुड़ा है, angiocatheter के माध्यम से डाला जाता है और टिप से परे 10 मिमी बढ़ाया. के रूप में बाएं हाथ के साथ कष्टकारक steadied है, fiberoptic धागे के प्रबुद्ध अंत और दाहिने हाथ से मौखिक गुहा ग्रसनी के माध्यम से निर्देशित है जब तक मुखर chords कल्पना कर रहे हैं. धागे तो चलती मुखर डोरियों के माध्यम से और ट्रेकिआ में प्रत्यक्ष दृश्य के तहत पारित कर दिया, समय पर होती है जब डोरियों ज़्यादा से ज़्यादा खुले हैं.
- angiocatheter तो ट्रेकिआ में fiberoptic धागा पर पारित हो जाता है जब तक कैथेटर टिप ट्रेकिआ के मध्य भाग के भीतर निहित है. 17-22 ग्राम चूहों के लिए, यह एक 10 मिमी कैथेटर संबंधक और एस विषय निचले जबड़े के कपाल चरम के बीच दिखाई शेष खंड से मेल खाती है है. वास्तविक राशि है जिसके द्वारा कैथेटर पारित कर दिया है प्रासंगिक आकार और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के 2-3 catheterized चूहों के ट्रेकिआ के प्रत्यक्ष निरीक्षण के द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए.
- fiberoptic धागा निकाल दिया है और नियमित रूप से गहरी साँस (छाती और पेट की लयबद्ध यात्रा) है जो तुरंत अंगूठे के साथ संबंधक के निम्नलिखित रोड़ा समाप्त देख द्वारा सफल इंटुबैषेण की पुष्टि की है. एक घुट प्रतिक्रिया, अंगूठे रोड़ा, अनियमित साँस, या साँस लेने में कठिनाई के अन्य लक्षणों की परवाह किए बिना malpositioning और आम तौर पर संकेत मिलता है esophageal इंटुबैषेण angiocatheter के संकेत हैं.
महत्वपूर्ण कदम करने के लिए जल्दी से एक esophageal इंटुबैषेण रिवर्स विफलता घातक हो सकता है . यदि esophageal इंटुबैषेण संदिग्ध है, कैथेटर जल्दी हो सकता है और हटाया जाना चाहिए reinserted एक बार जानवर एक सामान्य श्वास पैटर्न फिर से शुरू है. Etomidate पसंद के रूप में, सभी उपलब्ध कृंतक anesthetics के संवेदनाहारी है, इस एजेंट कम से कम हृदय विषाक्तता (hypotension, अतालता, कार्डियक गिरफ्तारी) भड़काती. - लोअर plethysmograph तालिका काम बेंच और हवा वेंटीलेटर बंदरगाह का सामना करना पड़ रहा जब तक विषय 180 ° बारी के साथ समानांतर तक. उसकी तरफ से वेंटीलेटर से कनेक्ट करने से पहले जानवर मुड़ें.
- एक सफल इंटुबैषेण आगे जब एक हवा तंग कनेक्शन हासिल करने और वेंटीलेटर (150 साँस / मिनट, 9 / एमएल छ ज्वार की मात्रा, 100% ऑक्सीजन पर कार्य) को सक्रिय करने के बाद, thoracoabdominal भ्रमण वेंटीलेटर के साथ तालमेल करने के लिए देखा जाता है की पुष्टि की है.
अंतःशिरा लाइन:
- एक 10 मिमी, 27ga सुई सिरिंज संबंधक से मुक्त पिघलने, और बाँझ संदंश और hemostat का उपयोग के मध्य में सुई 90 ° झुकने के रास्ते से हटा दिया जाता है इतना है कि बेवल कोण में चेहरे. गैर - beveled अंत PE10 टयूबिंग चतुर्थ इंजेक्शन बंदरगाह के लिए अग्रणी करने के लिए जुड़ा हुआ है.
- संभावित को रोकने केघातक हवा embolization, टयूबिंग और सुई 37 के साथ purged कर रहे हैं डिग्री सेल्सियस, 1 मिलीलीटर सिरिंज के माध्यम से 0.9 NaCl%. इंजेक्शन बंदरगाह 27ga सुई, एक 15ml अपकेंद्रित्र ट्यूब की टोपी में drilled छेद के माध्यम से धक्का दिया के होते हैं. टोपी के साथ भरा है खारा जैसे कि सुई के अंत लगातार जलमग्न है, इस तरह संभावना है कि हवा सुई में entrained हो जाएगा और नसों में इंजेक्शन को कम करने है.
- गर्मी दीपक के नीचे शेष माउस के साथ, सुई पूंछ करने के लिए समानांतर के दुम चरम पर और पार्श्व नस पर गठबंधन है. सुई थोड़ा त्वचा के नीचे चला है, जबकि एस नस की लंबाई के साथ cranially निर्देशित और subcutaneously मोड़ करने के लिए धक्का दिया. सफल चतुर्थ स्थान चतुर्थ टयूबिंग में सिरिंज सवार की मामूली खींच के साथ खून के backflow देख द्वारा की पुष्टि की है. इसके अलावा, वहाँ चतुर्थ लाइन के माध्यम से प्रवाह होना चाहिए 50-100 μl खारा की पूंछ नस में इंजेक्शन पर बेरोक. समसामयिक पूंछ नसों stably cannulated नहीं किया जा सकता है. इन उदाहरणों में, माउस घुमाया जा सकता है दूसरे पक्ष और अन्य पूंछ चतुर्थ आम तौर पर बिना किसी कठिनाई के पहुँचा करने के लिए 180 डिग्री कर सकते हैं.
- सेटअप से गर्मी दीपक को हटाने के बाद, इस विषय plethysmograph में संलग्न है, उसके बाद 4 clamps के आवेदन के साथ हवा तंग के रूप में सुरक्षित है.
गंभीर गर्मी दीपक पर रहने के लिए अनुमति दे कदम plethysmograph चैम्बर में हवा गर्मी और संभावित iv सुइयों और समाधान के आर रुपये बाँझपन के बाद माप बदल बनाए रखा जाना चाहिए होगा. सुइयों के बंध्याकरण डुबो और 70% इथेनॉल के साथ rinsing और बाँझ iv सम्मिलन से पहले नमकीन घोल के साथ निस्तब्धता द्वारा पीछा निस्तब्धता द्वारा पूरा किया है. इसके अलावा, पूंछ 70% इथेनॉल या isopropyl iv सम्मिलन से पहले शराब के साथ साफ किया जाना चाहिए.
Airway प्रतिरोध माप:
- पीक प्रतिरोध भागफल के निरंतर quantitation द्वारा निर्धारित किया जाता है डीपीटी / वी (जहाँ डीपीटी tracheal दबाव में परिवर्तन है और वी हवा का प्रवाह) के अंक बराबर फेफड़ों की मात्रा (70% ज्वार की मात्रा) पर. डीपीटी tracheal angiocatheter से जुड़े दबाव transducer का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है. वी निर्धारित करने के लिए, plethysmograph दबाव भिन्नरूपों शारीरिक अध्ययन पर्वतमाला से अधिक मात्रा में परिवर्तन करने के लिए कैलिब्रेटेड हैं. plethysmograph मात्रा, समय के साथ के रूप में preamp मॉड्यूल द्वारा गणना के अंतर है, एक स्थिर आधारभूत की स्थापना के बाद वी. आर (<3 मिनट से अधिक 5% भिन्नता) रुपये, पांच को बढ़ाने की लगातार खुराक (मात्रा = 2 शरीर के वजन / μl छ) acetylcholine (0.058, 0.18, 0.59, 1.58 और 5.8 मिलीग्राम / शरीर के वजन के kg, पीएच 7.4 पर 0.9% खारा में, बर्फ और प्रत्येक इंजेक्शन के लिए पहले हाथ गर्म पर बनाए रखा) क्लोराइड की सांद्रता एक दूसरे पर चार के माध्यम से अंतःक्षिप्त रहे हैं, प्रत्येक बाद खुराक के साथ आर रुपये की आधारभूत की वापसी पर आधारभूत प्रतिरोध का tripling (लगभग 12 एच 2 सेमी हे एक्स मिलीलीटर -1 एक्स सेकंड, यानी लगभग 4 सेमी की ठेठ आधारभूत ऊपर एक airway प्रतिरोध में 200% वृद्धि जब तक प्रशासित 2 एच ओ एक्स मिलीलीटर -1 एक्स सेकंड) हासिल की है. ACH के उत्तेजक मिलीग्राम / छ, शरीर के वजन के, कि आधारभूत मूल्यों (200 पीसी करार दिया) से एक आर रुपये में 200% की वृद्धि का कारण बनता है, एकाग्रता ACH-R रुपये खुराक - प्रतिक्रिया घटता के गणितीय प्रक्षेप द्वारा computed है.
- एक बार पीसी 200 मानों तक पहुँच गया है, रिलीज फास्टनरों, और plethysmograph विघटित. ACH के 5 बढ़ती खुराकों की एक अधिकतम दिया है. ऊपर दिए गए ACH एकाग्रता रेंज सबसे अनुभवहीन माउस उपभेदों के लिए पीसी 200 मूल्यों को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त है .
महत्वपूर्ण कदम है, जब लगभग 4 सेमी एच 2 हे एक्स मिलीलीटर -1 एक्स सेकंड के एक आधारभूत 30 सेकंड के लिए प्रतिरोध मॉनीटर पर स्थापित है, सामान्य नमक की एक 60 μL iv पुष्टि करने के लिए इंजेक्शन जा सकता है कि संज्ञाहरण के उपयुक्त विमान हासिल किया गया है. पूरा संज्ञाहरण के साथ, वहाँ प्रतिरोध में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन किया जाएगा, या अंग या पूंछ के प्रतिरोध आंदोलन में वृद्धि शारीरिक संकट के संकेत का प्रतिनिधित्व करता है और अतिरिक्त चतनाशून्य करनेवाली औषधि के लिए जरूरत इंगित करता है. - चतुर्थ पूंछ नस से निकालें और फिर वेंटीलेटर से पशु काटना, जगह में tracheal प्रवेशनी रखने के द्वारा एक पेटेंट airway बनाए रखने. समसामयिक जानवरों सहज साँस लेने को तुरंत फिर से शुरू करने में विफल है. इन उदाहरणों में, श्वसन धीरे से छाती की मालिश के द्वारा प्रोत्साहित किया जा सकता है.
महत्वपूर्ण कदम उठना साँस लेने से पहले स्थापित किया जाना चाहिए वसूली चैम्बर हस्तांतरण, अन्यथा मौतों घटित होगा. - सहज साँस लेने की बहाली पर, चूहों tracheal cannulae के साथ जगह में स्थानांतरित कर रहे हैं 37 100% 2 हे और बनाए रखने के साथ purged चैम्बर डिग्री सेल्सियस एक गर्मी दीपक का उपयोग कर. 15-20 मिनट के भीतर, चूहों दृढ़ता से साँस ले रहे हैं और उनके extremities बढ़ने लगे, पर जो बात tracheal कैथेटर और हटाया जा सकता है पशुओं एसafely अपने नियमित रूप से पिंजरों को हस्तांतरित.
Airway महत्वपूर्ण कदम acetylcholine प्रेरित अति लार के कारण बेहोश माउस में आसानी से बाधित है और निम्नलिखित airway शारीरिक माप anesthetized चूहों में asphyxiation संबंधित मौत के लिए प्रमुख कारण है . इस कारण के लिए, tracheal प्रवेशनी जगह में रहते हैं, यहां तक कि चूहों के दौर से गुजर bronchoalveolar lavage नहीं में करना चाहिए, जब तक वे arousable हैं और नहीं हटाया जाना चाहिए जब तक अति salivaton नहीं रह गया है.
Bronchoalveolar lavage:
- Bronchoalveolar lavage द्रव के संग्रह सुरक्षित है जब चूहों पर्याप्त उनके ढकोसला पलटा (~ वसूली कक्ष में नियुक्ति के बाद 20 मिनट) ठीक हो. ढकोसला पलटा धीरे angiocatheter आवक और जावक फिसलने द्वारा मूल्यांकन है, स्पष्ट खाँसी या संघर्ष का संकेत मिलता है कि ढकोसला पलटा वापस आ गया है.
गंभीर की अनुमति दे कदम भी लंबे समय तक वसूली समय बहुत व्यक्तिगत चूहों से बाल वापसी की दक्षता में कमी होगी, इस प्रकार, ढकोसला पलटा हर कुछ मिनट पर नजर रखी जाना चाहिए का सुझाव दिया 20 मिनट आराम की अवधि के निम्नलिखित. यदि चूहों lavage आंशिक जागृति के कारण प्रक्रिया बर्दाश्त करने में असमर्थ हैं, 3.2% isoflurane वाष्प संज्ञाहरण इस्तेमाल किया जा सकता है. - एक धातु गाइड इंटुबैषेण (0.5mm आयुध डिपो) ~ ° फेफड़ों के बाईं पालि के लिए निर्देशित 30 की एक सतत मोड़ के साथ, तार, angiocatheter में डाला जाता है. गाइड तार और angiocatheter के साथ फेफड़ों के बाईं पालि में उन्नत कर रहे हैं, जैसे कि कैथेटर (अपवर्जित हब) केवल 1mm द्वारा सामने दांत से परे फैली हुई है.
महत्वपूर्ण कदम विफलता बाएं फेफड़े अलग उपज बहुत कम होगा, जबकि जानवरों की मौत की संभावना को बढ़ाने . देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कि गाइड तार की नोक angiocatheter के खुले अंत के माध्यम से पारित नहीं है लिया जाना चाहिए. धातु उभड़नेवाला टिप के साथ angiocathether में आगे बढ़ने के एक tracheal पंगु बनाना और tracheal टूटना के कारण मौत का नेतृत्व कर सकता है. - जगह में angiocatheter रखते हुए, guidewire निकाल दिया है और पीबीएस के 300 μL (7.4 पीएच, बाँझ) 1 मिलीलीटर सिरिंज के माध्यम से बाएं फेफड़े में प्लावित है. के तुरंत बाद, जबकि सिरिंज नकारात्मक दबाव बनाने सवार ड्राइंग, angiocatheter धीरे धीरे (3 s) हटा दिया जबकि तीव्रता फेफड़ों मालिश. 100-200 μL का एक बाल वापसी की उम्मीद है.
- तत्काल 37 डिग्री सेल्सियस, 100% हे 2 चैम्बर जबकि लगातार छाती की मालिश. Lavaged चूहों वापसी उनके बाईं तरफ प्लेस चूहों जब तक पूरी तरह से बरामद (~ 20 मिनट). जाते हैं तो अपने पिंजरों में वापस रखा.
समय:
माउस के प्रति पूरी प्रक्रिया नहीं रह एक घंटे से भी लेने के लिए पूरा करना चाहिए: चरण 3-4, 5-10 मिनट, 5-21 चरण, 10 मिनट चरण, 22, 20-30 मिनट, 23-24 कदम,.. 10 मिनट. वृद्धि हुई प्रवीणता के साथ और प्रोटोकॉल में चौंका देने वाला विषयों द्वारा तीन चूहों / घंटे के लिए संसाधित किया जा सकता है.
प्रतिनिधि परिणाम:
चूहों में Airway hyperreactivity, के रूप में पीसी 200 मूल्यों के उपायों के द्वारा निर्धारित है, टी कोशिकाओं और cytokine आईएल-135 7 के स्राव के फेफड़ों के लिए सक्रियण और भर्ती के परिणाम है. इस प्रकार, airway hyperreactivity allergen के साथ airway चुनौती का अपरिहार्य परिणाम नहीं है बल्कि एक अक्षुण्ण टी सेल प्रतिरक्षा डिब्बे और टी सेल प्रतिक्रिया के लिए दोहराया allergen प्रदर्शन की सेटिंग में विकसित करने के लिए आवश्यक समय पर निर्भर करता है है. के रूप में छवि में दिखाया गया है. 2a, airway hyperreactivity, पीसी 200 मूल्यों उल्लेखनीय है कि आधारभूत मूल्यों, 5 छठे चुनौती के बाद आगे कोई उल्लेखनीय वृद्धि के साथ allergen चुनौतियों के बाद विकसित की तुलना में कम कर रहे हैं के रूप में परिभाषित किया . कारण है कि पूरी तरह समझ नहीं रहे हैं के लिए, airway जेट पहली allergen चुनौती (2a छवि) के बाद कम (पीसी 200 मूल्यों में वृद्धि हुई). इसी तरह के रुझान एक ही चूहों (छवि 2b) के लिए ACH खुराक प्रतिक्रिया घटता तुलना द्वारा स्पष्ट कर रहे हैं. हालांकि, यहाँ यह स्पष्ट है कि पूरा airway hyperreactivity पांचवें allergen चुनौती के बाद अचानक विकसित, ऐसी है कि चूहों 30 गुना से अधिक हो और अधिक चौथे और छठे चुनौतियों के बीच ACH के प्रति संवेदनशील है. साथ में, इन नतीजों से संकेत मिलता है कि Ahr की सबसे विश्वसनीय माप छह allergen चुनौतियों (12 दिन) के बाद प्राप्त कर रहे हैं, पहले timepoints पर माप अत्यधिक चर डेटा उपज की संभावना रहे हैं. वाहन intranasally (खारा) के साथ बार - बार चुनौती दी चूहे airway hyperreactivity विकसित नहीं है, और ACH की सभी खुराक दी, आर आर माप काफी आधारभूत मूल्यों से भिन्न नहीं है (3 छवि और डेटा नहीं दिखाया गया है) .
मजबूत Ahr के उद्भव से पहले, airway के प्रमुख कोशिका प्रकार allergen के द्वारा प्रेरित न्युट्रोफिल (4 छवि) था. Ahr के लिए प्रवृत्ति के लिए भी इसी तरह, तथापि, eosinophilia दोहराया allergen चुनौती और eosinophil BAL द्रव वायुसेना में संख्यानुसार प्रमुख कोशिका प्रकार बन गया के साथ धीरे - धीरे मजबूतआतंकवाद छठे चुनौती, neutrophis संख्या में एक उल्लेखनीय गिरावट (4 छवि) के साथ संयोग. मैक्रोफेज पहले कुछ allergen चुनौतियों के साथ शुरू की संख्या में वृद्धि हुई है और उसके बाद बहुतायत में fluctuated. लिम्फोसाइट बहुतायत में काफी allergen चुनौतियों की संख्या की परवाह किए बिना नहीं बदल था और, विडंबना मॉडल के लिए अपनी प्राथमिक महत्व दिया, आम तौर पर बाल द्रव में कम से कम कई सेल हैं.
न तो allergen चुनौती न ही बाल नमूने प्राप्त चूहों में airway प्रतिरोध माप प्रयोग के 17 दिनों से अधिक भिन्न नहीं था. Airway फिजियोलॉजी माप या allergen चुनौती के अभाव में दोहराया BAL द्रव के नमूने भी प्रदर्शन किया गया और केवल एक बढ़ाया न्युट्रोफिल और बृहतभक्षककोशिका भर्ती वायुमार्ग के लिए है कि 5 दिनों (नहीं दिखाया डेटा) से परे जारी रहती है नहीं था दिखाया. इन निष्कर्षों को दिखाना है कि प्रमुख neutrophilia allergen चुनौती दी चूहों में मनाया मोटे तौर पर प्रक्रिया नहीं है और प्रतिजन के परिणाम है.
नियंत्रण में, Pbs चुनौती दी चूहों airway प्रतिरोध माप भी काफी समय के साथ अलग अलग नहीं किया था. बढ़ी बृहतभक्षककोशिका और न्युट्रोफिल, लेकिन यह नहीं eosinophil, बाल तरल पदार्थ के लिए भर्ती भी इन चूहों, उन केवल दोहराया BAL द्रव नमूने (4 छवि ख घ) प्राप्त चूहों में मनाया परिवर्तन करने के लिए समान में देखा गया था. साथ में, इन आंकड़ों allergen के महत्व को रेखांकित, और नहीं airway के विभिन्न जोड़तोड़ दोनों एलर्जी (इओसिनोफिलिक) airway सूजन और Ahr की प्रेरण.
इसी तरह के परिणाम intranasal proteinase है कि हम यहां इस्तेमाल किया है अनुरूप करने के लिए एलर्जी का उपयोग उम्मीद की जा सकती है. हालांकि, कई जांचकर्ताओं ovalbumin का उपयोग करने के लिए एलर्जी फेफड़ों के रोग प्रेरित. Ovalbumin साथ intradermal या intraperitoneal भड़काना (1-2 सप्ताह) की एक उचित अवधि के बाद एक एल्यूमीनियम नमक, एक मजबूत अस्थमा phenotype airway hyperreactivity सहित में उपजी, घुलनशील ovalbumin के साथ एक एकल intranasal चुनौती के बाद 24 घंटे के भीतर उम्मीद की जा सकती है.
चित्रा 1 कृंतक plethysmograph के फोटोग्राफिक प्रतिनिधित्व, तुरंत airway फिजियोलॉजी माप रिकॉर्डिंग से पहले.
चित्रा 2. Airway प्रतिरोध माप. ए) सांख्यिकीय प्रयोजनों के लिए, antilog पीसी 200 मूल्यों रिपोर्ट कर रहे हैं. नोट पहली चुनौती है और आगे चुनौतियों के बाद बाद में कमी के बाद antilog 200 पीसी में बड़ी वृद्धि. बी) श्वसन प्रणाली (आरआरएस) प्रतिरोध: ACH-आरआरएस छठे और सातवें चुनौतियों के बाद खुराक - प्रतिक्रिया घटता के steepness ध्यान दें. त्रुटि सलाखों SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं.
3 चित्रा प्रतिनिधि वास्तविक समय श्वसन प्रणाली (नि. रुपये) प्रतिरोध भोले (ए) और 6X माउस को चुनौती दी allergen (बी) ACH के लगातार चतुर्थ खुराक प्राप्त से tracings. खुराक मूल्यों मिलीग्राम / किग्रा इकाइयों में प्रस्तुत कर रहे हैं.
चित्रा 4 विभेदकों bronchoalveolar lavage लगातार 7 intranasal चुनौतियों के साथ इलाज चूहों की बाईं फेफड़ों से प्राप्त नमूनों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गिनती.. प्रतिशत (%) (ए) allergen या पीबीएस (बी) के साथ इलाज चूहों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बहुतायत है. (सी) allergen या पीबीएस (डी) के साथ इलाज चूहों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कुल संख्या. मान का प्रतिनिधित्व के रूप में + / मतलब - sem.
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Discussion
अस्थमा के अध्ययन, और विभिन्न अन्य airway प्रतिरोधी रोगों, जैव चिकित्सा अनुसंधान के एक सक्रिय और क्षेत्र के विस्तार का गठन किया. अस्थमा से संबंधित प्रायोगिक अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण घटक शर्तों के तहत अलग airway आकार में बदलाव को मापने की क्षमता है. उत्तेजक चुनौती है, अस्थमा और संबंधित फेफड़ों के रोगों की एक विहित सुविधा और airway करार दिया airway hyperresponsiveness के एक संपत्ति के जवाब में अत्यधिक airway संकुचन, चिकित्सकीय महत्वपूर्ण सांस की तकलीफ और मौत सहित अन्य लक्षणों के लिए अग्रणी हमलों के एक प्रमुख घटक है.
इस अध्ययन में, एक उपन्यास विधि airway hyperresponsiveness उपाय विकसित किया गया था और साथ ही सूजन माउस में airway के लिए भर्ती कोशिकाओं का नमूना है. हम बताते हैं कि airway hyperresponsiveness तुरंत पहले, या यहां तक कि बाद लगातार सात allergen के पहले कई चुनौतियों, 15 दिनों से अधिक दिया साथ प्रेरित नहीं है. बल्कि, airway hyperresponsiveness प्रगतिशील allergen चुनौती के साथ ही धीरे - धीरे बढ़ता है, केवल 6 चुनौतियों (12 दिन) के बाद अत्यंत महत्वपूर्ण है (नकली allergen के पशुओं को चुनौती दी सापेक्ष) बनने. Airway फिजियोलॉजी में यह उल्लेखनीय परिवर्तन मोटे तौर पर फेफड़ों भड़काऊ कोशिकाओं की आमद, इयोस्नोफिल्स, जो पहली बार बड़ी संख्या में airway lavage 5 allergen चुनौती के बाद तरल पदार्थ (> 6 / 10 मिलीलीटर) में दिखाई देते हैं द्वारा सबसे प्रमुखता से चिह्नित paralleled.
इन निष्कर्षों को पहले प्रदर्शन के साथ संगत है कि टी सहायक कोशिकाओं टाइप 2 (Th2) दोनों airway hyperresponsiveness और eosinophilia6 मध्यस्थता, लेकिन न्यूनतम समय (12 दिन) इन endpoints के लिए आवश्यक करने के लिए अर्द्ध निरंतर allergen प्रदर्शन के साथ अधिक से अधिक बनने के प्रदर्शन द्वारा इन टिप्पणियों का विस्तार कर रहे हैं . airway hyperreactivity और airway eosinophilia के अधिक से अधिक डिग्री को यहाँ बताया संभावना आगे allergen चुनौती के रूप में इस allergen के माउस का प्रयोग कर के साथ अधिकतम संभव अधिक से अधिक प्रतिक्रियाओं (नहीं दिखाया डेटा है) को प्रकाश में लाना करने में विफल रहा है.
इससे भी महत्वपूर्ण बात, इन आंकड़ों को दिखाना है कि airway hyperreactivity airway सूजन कोशिकाओं की माप और विश्लेषण चूहों के एक ही पलटन में कड़ाई से किया जा सकता है बार बार प्रदर्शन किया. Serially एकत्र डेटा के लिए निरंतरता प्रदान करने के लिए इसके अलावा में वर्णित प्रोटोकॉल कम प्रयोगात्मक लागत (कम प्रत्येक अध्ययन के लिए आवश्यक चूहों) और बढ़ाया सांख्यिकीय शक्ति (एक ही जानवरों से दोहराया उपायों के रूप में अलग समूहों में से डेटा को विरोध) के लिए अनुमति देते हैं. एक मजबूत सैद्धांतिक नींव underlies वर्णित शारीरिक 8 विधि, आगे एकत्र आंकड़ों को विश्वास जोड़ने. समर्पित प्रयास के साथ वर्णित तकनीकों के साथ प्रवीणता आसानी से हासिल की है एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रयोगात्मक एलर्जी फेफड़े की बीमारी और अन्य फेफड़े की बीमारियों की जांच करने के लिए सेट प्रदान.
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Acknowledgments
हम fiberoptic orotracheal इंटुबैषेण प्रदर्शन करने के लिए सुझाव के लिए डॉ. डब्ल्यू Mintzer धन्यवाद. अनुदान U19AI070973, R01AI057696, K02HL75243, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के से R01HL082487 द्वारा समर्थित.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airway physiology measurement software (Rescomp) | Millenium Premier Group; 415-519-4371 | Custom prepared | |
| PC workstation running Windows XP equipped with a Pentium III CPU | Intel | Data analysis | |
| 17-pin analog to digital signal converter | National Instruments | PC-LPM16) | |
| 0.5mm external diameter fiber-optic thread, connected to light source | Cole-Parmer | 41722 series | |
| Ventilator | Harvard Apparatus | 687 | |
| 10 mm, 27ga needle | BD Biosciences | 309602 | |
| Heat lamp | |||
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 305109 | |
| 4 spring clamps | Pony | 3200 | |
| 0.5 mm external wire for intubation guide | |||
| Hemacytometer | |||
| Superfrost/plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Shandon Filter Cards | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
| Differential cell slide stain | Fisher Scientific | 122911 | |
| Light microscope | Leica Microsystems | ||
| Cytospin 3 | Shandon, Inc. | ||
| 20 ga, 1.25 inch ProtectIV intravenous catheters | Smiths Medical | ||
| 0.5 mm polymer optical fiber | Edmund Scientific | NT02-532 | |
| Small animal airway physiology workstation, Custom assembled by Millenium Premier Group using: | |||
| Commercially available pressure transducers | Buxco Research Systems | TRD5700 | |
| Commercially available pressure transducers | Buxco Research Systems | TRD4510 | |
| Preamp modules | Buxco Research Systems | MAX2270 | |
| Chassis | Buxco Research Systems | MAX1320 | |
| Customized small animal plethysmograph | |||
References
- Hamelmann, E. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156, 766-775 (1997).
- Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice. J. Appl. Physiol. 97, 286-292 (2004).
- Bates, J. The use and misuse of penh in animal models of lung disease. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 373-374 (2004).
- Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Grunig, G. Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma. Science. 282, 2261-2263 (1998).
- Corry, D. B. Requirements for allergen-induced airway hyperreactivity in T and B cell-deficient mice. Mol. Med. 4, 344-355 (1998).
- Corry, D. B. Interleukin 4, but not interleukin 5 or eosinophils, is required in a murine model of acute airway hyperreactivity. J. Exp. Med. 183, 109-117 (1996).
- Amdur, M. O., Mead, J. Mechanics of respiration in unanesthetized guinea pigs. Am J Physiol. 192, 364-368 (1958).
