Summary
Upprepade mätningar av gnagare andningsfysiologi och provtagning av luftvägarna inflammatoriska celler är önskvärda, men i allmänhet inte genomförbart. Här beskriver vi en repeterbar metod för oralt intubating möss som medger upprepade mätningar av luftvägarna hyperreaktivitet och provtagning i luftvägarna inflammatoriska celler.
Abstract
Airway hyperreaktivitet (AHR) mätningar och lungsköljning (BAL) vätska provtagning är avgörande för experimentell astma modeller, men upprepade procedurer för att få sådana mätningar i samma djur är i allmänhet inte är genomförbara. Här visar vi protokoll för att erhålla från möss upprepade mätningar av AHR och lungsköljning prover vätska. Möss intranasalt sju gånger under 14 dagar med en potent allergen eller behandlas bluff. Före den första utmaningen, och inom 24 timmar efter varje intranasal utmaning, var samma djur bedövas, oralt intuberade och mekaniskt ventilerad. AHR, bedömas genom att jämföra kurvor dos respons andningsorganen motstånd (RRS) inducerad genom att öka intravenösa doser av acetylkolin (ACH) klorid mellan falskt och allergen-utmanade djur, fastställdes. Efteråt, och via samma intubation, var den vänstra lungan lavaged så att differential räkning av luftvägarna celler kan utföras. Dessa studier visar att upprepade mätningar av AHR och BAL vätskeansamling är möjliga från samma djur och att maximal luftvägarna hyperreaktivitet och luftvägar eosinofili uppnås inom 7-10 dagar efter påbörjad allergen utmaning. Denna nya teknik reducerar antalet möss som behövs för longitudinella experiment och tillämpas på olika arter av gnagare, modeller sjukdom och luftvägar fysiologi instrument.
Protocol
Allergen utmaning:
- C57BL / 6 möss, 4-8 veckors ålder, bedövas i en lufttät plexiglas kammare fylls sedan med en 3,2% isofluran i syre ånga blandningen i 10 minuter för att nå fullständig bedövning.
- Intranasal allergen utmaningar (45μL OVA (22,5 mikrogram) och 7μL A. oryzae (7 mikrogram) i PBS) administreras, varje tisdag, torsdag och söndag, för totalt sju på varandra följande program.
Anestesi:
- Inför varje allergen utmaning, och efter den 7: e utmaning, är möss som en intraperitoneal injektion av 48 mg / kg etomidate (2 mg / ml), innan placering i en ljus-utom behållare.
- Ämne kvar i behållaren tills en brist av observerbara neurologiska svar detekteras på ansökan av tryck för att hind tassar (5-10 min).
Intubation:
- En strålningsvärme lampa, hålls på ett avstånd för att säkerställa underhåll av ~ 37 ° C kroppens kärntemperatur, bör fokusera på ämnet under hela förfarandet för att förebygga hypotermi. En rektal termometer bör användas åtminstone till en början att bekräfta euthermia oavsett vilken värme som används källa.
Kritiska steg alla vätskor och instrument tas emot av försöksdjur bör vara sterila, bör utföras under strikt aseptiska förhållanden. Långvarig hypotermi medan under narkos kommer att leda till avvikande data och / eller dödsfall av djur. Kompetens med alla ingrepp bör utvecklas med hjälp av avliden djur innan du försöker arbeta med levande djur. Ophthalmic smörjmedel bör användas för att förhindra att hornhinnan skrubbsår av djur under narkos. - Sövda möss tas bort från behållaren och placeras i liggande läge (ventrala sida upp), på plethysmograph bord, justerat till en 45 ° vinkel.
- Ett gummiband går runt bordet sätts bakom den översta raden i framtänderna så för att säkra föremål på plats. Med pincett i höger hand, grepp, förlänga och lyfta tungan ur munnen innan du säkra den på plats med en metall depressor i vänster hand, vilket möjliggör en fri luftväg för intubation.
- En 0,8 mm diameter fiberoptisk tråd, ansluten till en ljuskälla, förs in genom angiocatheter och utökade 10 mm utanför spetsen. Som depressor har stabiliserats med vänster hand, är den upplysta slutet av fiberoptiska tråden guidas genom munhåla och svalg med höger hand tills stämbanden visualiseras. Tråden sedan passerade under direkt visualisering genom att flytta stämbanden och in i luftstrupen, tidsinställda att uppstå när kablarna är maximalt öppen.
- Den angiocatheter leds sedan över fiberoptiska tråden i luftstrupen tills kateterspetsen ligger inom mitten-delen av luftstrupen. För 17-22 gram möss, motsvarar detta en 10 mm kateter segmentet är synligt mellan kontakten och kraniella extrema i ämnet s underkäken. Den faktiska belopp med vilket kateter förs bör bestämmas genom direkt inspektion av luftstrupe av 2-3 kateter möss av relevant storlek och genetisk bakgrund.
- Den fiberoptiska tråden tas bort och framgångsrik intubation bekräftas genom att observera vanliga djupa andetag (rytmiska utflykter i bröstkorgen och buken), som omedelbart säga efter ocklusion av kontakten med tummen. En kvävning svar, oavsett thumb-ocklusion, oregelbundna andetag, eller andra tecken på andningssvårigheter indikerar angiocatheter felställningar och oftast visar esofagus intubering.
Avgörande steg Underlåtenhet att snabbt vända en matstrupen intubering kan vara dödligt. Om esofagus intubation misstänks skall katetern snabbt bort och in igen när djuret har återupptagit en normal andning mönster. Etomidate är bedövande val som, av alla tillgängliga gnagare anestetika, framkallar detta agent minst kardiovaskulär toxicitet (hypotoni, arytmi, hjärtstillestånd). - Lägre plethysmograph bordet tills parallellt med arbetsbänk och vrid föremål 180 ° tills vänd luft fläkt port. Slå djur på sin sida innan du ansluter till fläkten.
- En lyckad intubering bekräftas ytterligare när, Efter att ha säkrat en lufttät anslutning och aktivera fläkten (fungerar på 150 andetag / minut, 9 ml / g tidalvolym, 100% syre) är thoracoabdominal utflykt anses takt med fläkten.
Intravenös infart:
- En 10 mm, är 27ga nålen bort från sin spruta-kontakt genom att smälta det gratis och böja nålen 90 ° vid mittpunkten med hjälp av steril pincett och hemostat så att avfasningen ansikten i vinkel. Den icke-fasade änden är ansluten till PE10 slangen som leder till IV injektion porten.
- För att förhindra att potentielltdödlig luft embolisering, slangen och nål fylls sedan med 37 ° C, 0,9% NaCl via 1 ml sprutan. Injektionen hamnen består av en 27ga nål, drivit igenom ett borrat hål i locket på ett 15ml centrifugrör. Locket är fylld med saltlösning så att slutet av nålen hela tiden under vatten, vilket minskar sannolikheten för att luften kommer att fångas upp i nålen och injiceras intravenöst.
- Med musen kvar under värmelampa, är nålen justeras vid caudal extrema av svansen parallell med och över den laterala ven. Nålen köras lite under huden, medan riktad cranially längs ven s längd och knuffade subkutant till böjen. Framgångsrik IV placering bekräftas genom att observera blod backflöde i IV rör med lätt dra av sprutkolven. Dessutom bör det finnas obehindrat flöde genom IV linjen vid injektion av 50-100 l saltlösning i svansvenen. Enstaka svans vener kan inte vara stabilt kanylerade. I dessa fall kan musen vridas 180 grader åt andra sidan och den andra svansen IV brukar nås utan problem.
- Efter att värmen lampan från installationen, är föremål inneslutna i plethysmograph, därefter säkrade så lufttätt med tillämpning av 4 klämmor.
Avgörande steg Att låta värmelampa kvar på kommer att värma upp luften i plethysmograph kammaren och eventuellt förändra efterföljande mätningar av R RS sterilitet iv nålar och lösningar måste upprätthållas. Sterilisering av nålar sker genom nedsänkning och spolning med 70% etanol följt av sköljning och spolning med steril koksaltlösning före iv insättningen. Dessutom bör svansen rengöras med 70% etanol eller isopropylalkohol före iv insättningen.
Luftvägsmotstånd mätningar:
- Peak motståndet bestäms genom kontinuerliga kvantifiering av kvoten DPT / V (där DPT är förändringen i trakeala tryck och V är luftflödet) i punkter lika lungvolym (70% tidalvolym). DPT bestäms med hjälp av en tryckgivare kopplad till trakeal angiocatheter. För att bestämma V, plethysmograph tryckvariationer kalibrerad till förändringar i volym under den studerade fysiologiska intervallen. Skillnaden i plethysmograph volym över tiden, som beräknas av förförstärkare modulen är V. Efter upprättande av en stabil baslinje R RS (<5% variation över 3 minuter), fem på varandra följande doser (volym = 2 l / g kroppsvikt) med ökande koncentrationer av acetylkolin (0,058, 0,18, 0,59, 1,58 och 5,8 mg / kg kroppsvikt, i 0,9% saltlösning vid pH 7,4, upprätthålls på is och hand-uppvärmd före varje injektion) injiceras under en sekund via IV, med varje efterföljande dos vid återlämnandet av R-RS med baslinjen, tills en tredubbling av baslinjen motstånd (ca 12 cm H 2 O x ml -1 x sek, dvs en 200% ökning av luftvägsmotståndet ovanför typiska baslinjen ca 4 cm H 2 O x ml -1 x sek) uppnås. Den provokativa koncentration av Ach, i mg / g kroppsvikt, som orsakar en 200% ökning av R skivor från utgångsvärdet (kallas PC-200), beräknas med matematisk interpolering av Ach-R RS dos-respons-kurvor.
- När PC 200 värden har nåtts, släpp fästen och demontera plethysmograph. Högst 5 ökande doser av Ach ges. Den Ach koncentrationsintervall anges ovan är lämplig för att uppnå PC 200 värdena för de flesta naiva musstammar.
Avgörande steg när ett utgångsvärde på cirka 4 cm H 2 O x ml -1 x sek är etablerad på motståndet skärmen i 30 sekunder, kan en 60 mikroliter av vanlig saltlösning injiceras iv för att bekräfta att rätt plan anestesi har uppnåtts. Med fullständig anestesi, blir det ingen betydande förändring i motståndet, en ökning av motstånd eller rörelser i ben eller svans är ett tecken på fysisk nöd och indikerar behovet av ytterligare bedövningsmedel. - Ta bort IV från svansvenen och sedan koppla djuret från fläkten, upprätthålla fri luftväg genom att hålla trakeal kanylen på plats. Enstaka djur misslyckas med att återuppta spontan andning omedelbart. I dessa fall kan andningen uppmuntras genom att försiktigt massera bröstkorgen.
Kritiskt steg spontanandning måste fastställas innan de överförs till återhämtningen kammaren, annars dödsfall kommer att inträffa. - Vid återupptagande av spontan andning, är möss överförs med trakeal kanyler på plats, till en kammare fylls sedan med 100% O 2 och underhåll vid 37 ° C med hjälp av en värmelampa. Inom 15-20 min, är möss andas kraftigt och börjar att flytta sina armar och ben, vid vilket tillfälle trakeal katetern kan tas bort och djur safely överförs till deras vanliga burar.
Kritiskt steg luftvägarna är lätt hindras i det omedvetna musen på grund av acetylkolin-inducerad hyper-salivering och är den största orsaken till kvävning dödsfall i sövda möss efter luftvägarna fysiologiska mätningar. Av denna anledning måste trakeal-/svalgsvabbar kanyl kvar, även hos möss inte genomgår lungsköljning, tills de är väckbar och ska inte tas bort förrän hyper-salivaton har upphört.
Lungsköljning:
- Insamling av bronkoalveolär lavage är säker när mössen återhämta sig tillräckligt deras kräkreflexen (~ 20 min efter placering i återhämtningen kammare). Den kräkreflexen bedöms genom att försiktigt skjuta angiocatheter aktiv och passiv, självklart hosta eller kämpa indikerar att kräkreflexen har återvänt.
Kritiskt steg och ger för långvarig en återhämtningstid kommer att kraftigt minska effektiviteten i BAL tillbaka från enskilda möss, och därför måste kräkreflexen följas upp var några minuter efter den föreslagna 20 min viloperiod. Om möss är inte tolererar lavage förfarande till följd av partiellt uppvaknande, kan 3,2% isofluran ånga anestesi användas. - En metallisk intubation guidekabel (0.5mm OD), med en kontinuerlig kurva på ~ 30 ° riktad till vänster lob av lungan, sätts in i angiocatheter. Guiden tråd och angiocatheter är avancerade ihop till vänster lob av lungan, så att katetern (hubb uteslutna) sträcker sig längre än de främre tänderna med bara 1mm.
Avgörande steg Underlåtenhet att isolera vänster lunga kommer att kraftigt minska avkastning, samtidigt öka sannolikheten för att djuret dör. Försiktighet måste vidtas för att säkerställa att spetsen av guidekabel inte passerar genom den öppna änden av angiocatheter. Vidareutveckling av angiocathether med metalliska spetsen utskjutande kan leda en trakeal skärsår och död på grund av endotrakeal brista. - Att hålla angiocatheter på plats är ledaren bort och 300 mikroliter av PBS (pH 7,4, steril) spolas in i vänstra lungan via en 1 ml spruta. Omedelbart efter, medan du ritar upp sprutkolven för att skapa undertryck är angiocatheter långsamt (3 s) bort, medan intensivt massera lungan. En BAL avkastning på 100-200 mikroliter förväntas.
- Omedelbart tillbaka lavaged möss till 37 ° C, 100% O 2 kammare medan kontinuerligt massera bröstkorgen. Placera möss på sin vänstra sida tills helt återställd (~ 20 min). Djuren placeras sedan tillbaka i sina burar.
Timing:
Per mus, bör hela proceduren ta längre tid än 1 timme att utföra: Steg 3-4, 5-10 min, steg 5-21, 10 min, Step 22, 20-30 min, steg 23-24,... 10 min. Med ökad kompetens och med svindlande ämnen i protokollet, upp till tre möss / timme får behandlas.
Representativa resultat:
Airway hyperreaktivitet hos möss, som bestäms genom åtgärder av PC 200 värden, är en konsekvens av aktivering och rekrytering till lungorna av T-celler och frisättning av cytokin IL-135-7. Således är luftvägarna hyperreaktivitet inte en oundviklig konsekvens av luftvägar utmaning med allergen, utan snarare beroende av en intakt T-cell immun facket och den tid som krävs för T-cells svar att utvecklas i fastställandet av upprepad exponering av allergener. Som visas i figur. 2a, luftvägarna hyperreaktivitet, som definieras som PC 200 värden som är signifikant lägre jämfört med utgångsvärdena, utvecklades efter 5 allergen utmaningar med någon ytterligare betydande ökning efter det sjätte utmaningen. Av skäl som inte är helt klarlagda, minskade luftvägarnas reaktivitet (PC 200 värden steg) efter den första allergen (Fig. 2a). Liknande trender är uppenbara genom att jämföra Ach kurvor dos-respons för samma möss (bild 2b). Det är dock uppenbart här som fullt luftvägarna hyperreaktivitet utvecklar abrupt efter den femte allergen utmaningen, så att möss blir mer än 30 gånger mer känsliga för Ach mellan fjärde och sjätte utmaningar. Tillsammans utgör dessa fynd tyder på att den mest tillförlitliga mätningar av AHR erhålls efter sex allergen utmaningar (12 dagar), mätningar vid tidigare tidpunkter kommer sannolikt att ge mycket varierande uppgifter. Möss upprepade gånger utsattes för fordon intranasalt (koksalt) inte utvecklas luftvägarna hyperreaktivitet, och vid alla doser av Ach, gör R RS mätningar inte väsentligt skiljer sig från baslinjen värden (Fig. 3 och data visas inte).
Innan uppkomsten av robusta AHR, var den dominerande celltypen i luftvägarna som orsakas av allergen neutrofila (bild 4). I likhet med trenden för AHR dock stärkt eosinofili gradvis med upprepade allergen utmaningen och eosinofila blev den numerärt dominerande celltypen i BAL vätska afTER den sjätte utmaningen, sammanfaller med en markant nedgång i neutrophis nummer (bild 4). Makrofager ökade inledningsvis i antal med de första allergen utmaningar och fluktuerade i överflöd därefter. Lymfocyter överflöd förändrades inte nämnvärt oavsett hur många allergen utmaningar och, paradoxalt nog med tanke på deras grundläggande betydelse för den modellen, är oftast den minst talrika cellen i BAL vätska.
Luftvägsmotståndet mätningar hos möss som varken får allergen eller BAL provtagning inte varierar över 17 dagar av experiment. Upprepad BAL vätska provtagning i avsaknad av luftvägarna fysiologi mätningar eller allergen utfördes också, och visade bara en förbättrad neutrofila och makrofag rekrytering till luftvägarna som inte kvarstår efter 5 dagar (data visas inte). Dessa resultat visar att de framträdande neutrofili observerats i allergen utmanade möss är till stor del resultatet av förfarandet och inte antigenet.
I kontroll, PBS-utmanade möss, luftvägsmotståndet mätningar inte heller variera kraftigt över tiden. Förbättrad makrofager och neutrofiler, men inte eosinofiler, rekryteringen till BAL vätska sågs också i dessa möss, liknande dem som observerats hos möss som enbart fick upprepad BAL vätska provtagningar (Fig. 4 B, D). Tillsammans utgör dessa uppgifter understryker vikten av allergen, och inte de olika manipulationer av luftvägarna, till induktion av både allergisk (eosinofila) luftvägsinflammation och AHR.
Liknande resultat kan förväntas med intranasalt allergener analogt med proteinas som vi har använt här. Men många forskare använder äggalbumin att framkalla allergisk lungsjukdom. Efter en lämplig period av intradermalt eller intraperitoneal priming (1-2 veckor) med äggalbumin fälls i en aluminium salt, en robust astma fenotyp, inklusive luftvägarna hyperreaktivitet, kan förväntas inom 24 timmar efter en enstaka intranasal utmaning med lösliga äggalbumin.
Figur 1. Fotografisk bild av en gnagare plethysmograph, omedelbart före luftvägarna fysiologi mätning inspelning.
Figur 2. Luftvägsmotstånd mätningar. A) För statistiska ändamål är antilog PC 200 som rapporteras. Notera den stora ökningen av antilog PC 200 efter första utmaningen och därefter minska efter ytterligare utmaningar. B) Andningsorganen motstånd (RRS): Observera lutning av Ach-RRS dos-respons-kurvor efter sjätte och sjunde utmaningar. Felstaplar representerar SEM.
Figur 3. Representant i realtid andningsorganen motstånd (R RS) tracings från en naiv (A) och 6X allergen utmanade musen (B) som får i följd IV doser av Ach. Dos värden presenteras i mg / kg enheter.
Figur 4. Differentiell immunceller som räknas i lungsköljning prover från vänster lungorna hos möss som behandlats med 7 rad intranasal utmaningar. Procent (%) överflöd av immunceller hos möss som behandlats med allergen (A) eller PBS (B). Totalt antal immunceller från möss som behandlats med allergen (C) eller PBS (D). Värden representeras betyder + / - SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studiet av astma och diverse andra luftvägssjukdomar obstruktiv, utgör en aktiv och växande området biomedicinsk forskning. En viktig del av astmarelaterade experimentell forskning är förmågan att mäta förändringar i luftvägarna storlek under varierande förhållanden. Överdriven luftvägsförträngning som svar på provocerande utmaning, en kanonisk funktion i astma och sjukdomar lunga och en egendom kallas luftvägarna luftvägarna hyperreaktivitet, är en viktig del av kliniskt signifikant attacker som leder till andnöd och andra symptom, inklusive död.
I denna studie var en ny metod utvecklats för att mäta luftvägarna hyperreaktivitet och samtidigt prov inflammatoriska celler rekryteras till luftvägarna i musen. Vi visar att luftvägarna hyperreaktivitet inte omedelbart framkallas med den första, eller ens efter att de första av sju på varandra följande allergener utmaningar ges under 15 dagar. Snarare ökar luftvägarna hyperreaktivitet endast gradvis med progressiv allergen utmaning, att bli av stor betydelse (i förhållande till bluff allergener utmanade djur) först efter 6 utmaningar (12 dagar). Detta markerade förändring i luftvägarna fysiologi parallellt ungefär tillströmningen av lungan inflammatoriska celler, märkt mest framträdande av eosinofiler, som först visas i luftvägarna lavage i stort antal (> 10 6 / ml) efter den 5: e allergen utmaningen.
Dessa resultat överensstämmer med tidigare visa att T-hjälparceller typ 2 (Th2) celler medlar både luftvägarna hyperreaktivitet och eosinophilia6, men förlänga dessa observationer genom att visa den minsta tid (12 dagar) som krävs för dessa endpoints för att bli maximalt med semi-kontinuerlig exponering av allergener . Maximal grader av luftvägarna hyperreaktivitet och luftvägar eosinofili redovisas här är sannolikt den högsta möjliga med musen använder denna allergenet som ytterligare allergen utmaning misslyckats med att locka fram mer svar (data visas inte).
Ännu viktigare är att dessa data visar att luftvägarna hyperreaktivitet mätningar och analys av luftvägarna inflammatoriska celler rigoröst kan utföras upprepade gånger på samma kohort av möss. Förutom att ge kontinuitet till data som samlas in seriellt, de beskrivna protokoll möjliggöra minskade experimentella kostnader (färre möss som krävs för varje studie) och förbättrade statistiska styrkan (upprepade mätningar från samma djur i motsats till data från olika grupper). En stark teoretisk grund som ligger bakom den beskrivna fysiologiska metoden 8, vilket ytterligare förtroende för insamlade data. Med dedikerade ansträngning, färdighet med de beskrivna teknikerna lätt uppnås, vilket ger en mycket viktig Verktygssats för att utreda experimentell allergisk lungsjukdom och andra lungsjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Dr W. Mintzer för förslaget att utföra fiberoptiska orotracheal intubering. Finansierats med bidrag U19AI070973, R01AI057696, K02HL75243 och R01HL082487 från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airway physiology measurement software (Rescomp) | Millenium Premier Group; 415-519-4371 | Custom prepared | |
| PC workstation running Windows XP equipped with a Pentium III CPU | Intel | Data analysis | |
| 17-pin analog to digital signal converter | National Instruments | PC-LPM16) | |
| 0.5mm external diameter fiber-optic thread, connected to light source | Cole-Parmer | 41722 series | |
| Ventilator | Harvard Apparatus | 687 | |
| 10 mm, 27ga needle | BD Biosciences | 309602 | |
| Heat lamp | |||
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 305109 | |
| 4 spring clamps | Pony | 3200 | |
| 0.5 mm external wire for intubation guide | |||
| Hemacytometer | |||
| Superfrost/plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Shandon Filter Cards | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
| Differential cell slide stain | Fisher Scientific | 122911 | |
| Light microscope | Leica Microsystems | ||
| Cytospin 3 | Shandon, Inc. | ||
| 20 ga, 1.25 inch ProtectIV intravenous catheters | Smiths Medical | ||
| 0.5 mm polymer optical fiber | Edmund Scientific | NT02-532 | |
| Small animal airway physiology workstation, Custom assembled by Millenium Premier Group using: | |||
| Commercially available pressure transducers | Buxco Research Systems | TRD5700 | |
| Commercially available pressure transducers | Buxco Research Systems | TRD4510 | |
| Preamp modules | Buxco Research Systems | MAX2270 | |
| Chassis | Buxco Research Systems | MAX1320 | |
| Customized small animal plethysmograph | |||
References
- Hamelmann, E. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156, 766-775 (1997).
- Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice. J. Appl. Physiol. 97, 286-292 (2004).
- Bates, J. The use and misuse of penh in animal models of lung disease. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 373-374 (2004).
- Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Grunig, G. Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma. Science. 282, 2261-2263 (1998).
- Corry, D. B. Requirements for allergen-induced airway hyperreactivity in T and B cell-deficient mice. Mol. Med. 4, 344-355 (1998).
- Corry, D. B. Interleukin 4, but not interleukin 5 or eosinophils, is required in a murine model of acute airway hyperreactivity. J. Exp. Med. 183, 109-117 (1996).
- Amdur, M. O., Mead, J. Mechanics of respiration in unanesthetized guinea pigs. Am J Physiol. 192, 364-368 (1958).
