Summary
हम एन जुड़े glycans के स्तनधारी कोशिकाओं में अपने biosynthesis के बाद glycoproteins के प्रारंभिक जीवन के माध्यम से परिवर्तन के विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन. यह नाड़ी पीछा metabolically लेबल glycans, glycoproteins और HPLC द्वारा परीक्षा से enzymatic रिलीज के विश्लेषण के द्वारा हासिल की है.
Abstract
GLC की कुर्की
Protocol
कुल glycoproteins या ब्याज की एक विशिष्ट ग्लाइकोप्रोटीन के चीनी श्रृंखला के विश्लेषण के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल का इरादा है. प्रक्रिया मूल रूप से के रूप में प्रोटोकॉल भर में कहा कुछ परिवर्तन के साथ दोनों ही मामलों के लिए ही है.
- एन जुड़े glycans की चयापचय लेबलिंग के लिए एक स्तनधारी प्रत्येक नमूना के लिए एक 90 मिमी डिश में रातोंरात विकसित कोशिकाओं का एक subconfluent संस्कृति का उपयोग करने की जरूरत है (नमूने अलग समय अंक या उपचार का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं). इस प्रोटोकॉल एनआईएच 3T3 कोशिकाओं के लिए अनुकूलित है.
- हौसले से तैयार मध्यम पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) ग्लूकोज मुक्त, 10% dialyzed FCS और 5-15 मिनट के लिए 4 मिमी सोडियम पाइरूवेट के साथ आपूर्ति की 5 मिलीलीटर में ऊष्मायन द्वारा ग्लूकोज के लिए कोशिकाओं को भूख से मर जाना.
- पूर्व गर्म 1 मिलीलीटर के साथ भुखमरी मध्यम बदलें (37 ° सी) ग्लूकोज मुफ्त के 400 μCi युक्त मध्यम [2 - 3 एच] mannose लेबल (65 वर्ष की कम एकाग्रता μCi / मिलीलीटर कुल glycoproteins की लेबलिंग के लिए प्रयोग किया जाता है ), और 1 घंटे के लिए सामान्य टिशू कल्चर की स्थिति में कोशिकाओं को सेते हैं.
- प्रत्येक नमूने लेबलिंग माध्यम से निकालें, और ध्यान से 4 बजे पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़ने ° नाड़ी और उन्हें बर्फ (इन नमूनों को दालों के रूप में संदर्भित होते हैं) पर जगह इसी नमूने सी, जबकि पीछा करने के लिए इसी नमूने की जरूरत है 2 मिलीलीटर के साथ 3 बार rinsed पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) सामान्य पूरा संस्कृति मध्यम, और फिर 37 पर सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखा डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म वांछित पीछा अवधि के लिए नियमित रूप से मध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ.
- ठंडा पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ पल्स (पहले से बर्फ पर रखा) नमूने 3 बार कुल्ला. कोशिकाओं तो बंद 2 मिलीलीटर पीबीएस में पकवान एक सेल खुरचनी का उपयोग scraped हैं, और एक 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में रखा गया.
- लघु स्पिन 16000Xg (6-10 सेकंड) कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला त्यागने और फ्रीज -80 पर सेल गोली डिग्री सेल्सियस
- 5 चरणों और पीछा समय के अंत में पीछा नमूने लिए भी 6 प्रदर्शन.
- फ्रीजर से कक्षों को निकालें और उन्हें बफर के 300 μl के अलावा द्वारा lyse, संक्षेप vortexing और incubating बर्फ पर 20 मिनट के लिए, या कुल glycoproteins विश्लेषण के मामले में, ऊष्मायन द्वारा बफर बी के साथ बर्फ पर 20 मिनट, sonication द्वारा पीछा (4 बार, 10 सेकंड, अधिकतम आयाम), तो 5min के लिए नमूने फोड़ा.
- 16000Xg पर डिग्री सेल्सियस 4 में 20 मिनट के लिए lysates अपकेंद्रित्र एक नई Eppendorf ट्यूब को सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण और गोली त्यागें.
- यदि कुल glycoproteins विश्लेषण, आणविक निस्पंदन और deglycosylation (17 कदम) के लिए आगे बढ़ें. H2a ग्लाइकोप्रोटीन के immunoprecipitation यहाँ प्रदर्शन किया, (Repligen) मोती एक agarose प्रोटीन 01:01 निलंबन और 3 / हमारे खरगोश पॉलीक्लोनल वांछित ग्लाइकोप्रोटीन के लिए विरोधी H2a एंटीबॉडी के μl नमूना 20l/sample जोड़ने (हमारे उदाहरण विरोधी H2a एंटीबॉडी में ), 9 कदम से सतह पर तैरनेवाला.
- 4 ° C पर, 4-16 घंटे के लिए नमूने सेते लगातार धीमी रोटेशन से मिश्रण.
- नीचे 16000Xg पर 30 सेकंड के लिए मोती, स्पिन और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला का उपयोग निर्वात हटायें.
- मोती डी 500 μl बफर जोड़ने और vortexing से कुल्ला. 12 कदम के रूप में स्पिन और सतह पर तैरनेवाला हटायें. धोने 3 बार दोहराएँ.
- मनका गोली 10μl denaturing बफर (ठोंग एंडो - एच किट के साथ आपूर्ति) जोड़ें और 5 मिनट (जब कुल प्रोटीन का विश्लेषण कर रहे हैं, deglycosylation Microcon फिल्टर, 17 कदम पर किया जाता है) के लिए नमूने फोड़ा.
- नीचे मोती स्पिन (16000Xg 30 सेकंड के लिए), और एक नया Eppendorf ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण. तो एंडो एच एंजाइम की 0.5μl प्रतिक्रिया बफर (भी ठोंग एंडो एच किट के साथ आपूर्ति की) के 10 μl के साथ साथ प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ रहे हैं, और नमूने 37 में incubated डिग्री सेल्सियस 3 घंटे के लिए.
- प्रोटीन से जारी glycans को अलग करने के लिए, नमूना विआयनीकृत जल के साथ 5 गुना पतला है और एक आणविक फिल्टर (Microcon YM30 Ultracel) के शीर्ष पर रखा काट 30kDa, तो 14000Xg पर 3 मिनट के लिए centrifuged के साथ. विआयनीकृत जल और नमूनों की फिर से centrifugation के 50μl लागू. यह वार्शआउट 2 अधिक बार दोहराया है, प्रवाह के माध्यम से रखते हुए.
- यदि आप कुल glycoproteins का विश्लेषण कर रहे हैं, Microcon फ़िल्टर करने के लिए lysates की सतह पर तैरनेवाला (9 कदम से) लागू होते हैं. 14000Xg पर 3 मिनट के लिए दोहराया centrifugation द्वारा 100 μl बफर ई, 3 बार के साथ निकालने धो लें. 10X एंडो एच प्रतिक्रिया बफर के 3 μl और एंडो एच Microcon retentate एंजाइम के 1.5 μl जोड़ें, और 37 पर 3 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस जारी glycans विआयनीकृत जल के साथ 3 दोहराया centrifugations द्वारा eluted कर रहे हैं के रूप में 16 कदम में.
- अगर वांछित, 16 और 17 चरणों से retentates एंडो एच प्रतिरोधी glycoproteins युक्त तो बफर सी के 15 μl में हैं 200mu एन glycosidase एफ के साथ incubated, 37 ° 16 एच. के लिए सी विआयनीकृत जल के साथ Elution 16 कदम के रूप में किया जाता है.
- एक SpeedVac concentrator में प्रवाह के माध्यम से एंडो एच प्रतिक्रिया (16 कदम और 17) युक्त ट्यूब प्लेसऔर नमूने पूरी तरह से सूखे (यह 45 के लिए किया जा सकता है इस प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए सी °).
- HPLC के लिए नमूने तैयार करने के लिए, HPLC विलायक (: पानी, 60:40, 1% फॉस्फोरिक एसिड acetonitrile) के 12 μl में सूखी छर्रों resuspend.
- विलायक के निरंतर प्रवाह (1 मिलीग्राम / मिनट) और दबाव (1000 और 2000 साई के बीच एक विशेष मूल्य) के लिए HPLC डिवाइस (Spherisorb स्तंभ से जुड़े) समायोजित, और एक ट्यूब के हर 1 मिनट बदलने के लिए एक अंश कलेक्टर जगह.
- HPLC डिवाइस में नमूने लोड और अंश कलेक्टर के साथ शुरू.
- प्रत्येक नमूना रन से और एक मानक oligosaccharide मिश्रण की एक रन से 1 मिलीलीटर की 48 भिन्न लीजिए.
- प्रत्येक अंश से एक जगमगाहट शीशी 500 μl स्थानांतरण, और पानी विलेयशील जगमगाहट तरल पदार्थ के 3 मिलीलीटर के साथ सामग्री मिश्रण.
- शीशियों लोड और एक जगमगाहट काउंटर में पढ़ा.
- सीपीएम readout अंश संख्या के एक समारोह के रूप में प्लॉट किए जाते है.
- एक चोटी के भीतर सीपीएम मान निम्नानुसार एक विशिष्ट glycan प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करते हैं: भिन्न 18-21 M5, भिन्न भिन्न 22-26 के लिए M6, 27-31 के लिए M7, भिन्न 32-35 M8, M9 के लिए 36-39 भिन्न के अनुरूप, 40-42 के लिए G1M9 और भिन्न G2M9 43-45 भिन्न.
- प्रत्येक चोटी के भीतर भिन्न के लिए सीपीएम मानों का योग एक विशिष्ट glycan प्रजातियों की पूर्ण राशि को दर्शाता है. प्रत्येक glycan प्रजातियों की पूर्ण राशि है कि यह होता है mannose अवशेषों की संख्या द्वारा विभाजित है: आदेश में तथ्य यह है कि अधिक mannose अवशेषों से युक्त प्रजातियों अधिक लेबल, "प्रत्येक glycan प्रजाति के रिश्तेदार दाढ़ राशि" के रूप में गणना के अधिग्रहण के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए . यह मान तो सभी glycan प्रत्येक विशिष्ट glycan प्रजातियों के लिए "कुल का प्रतिशत प्राप्त करने के लिए प्राप्त प्रजातियों के रिश्तेदार दाढ़ मात्रा की राशि से विभाजित है.
| चेस (घंटे) | 0 | 4 |
| एंडो (सीपीएम) एच के साथ जारी | 90000 | 16800 |
| एन glycosidase एफ ख (सीपीएम) के साथ जारी | 20400 | 3900 |
| Retentate ग (सीपीएम) में glycoproteins | 371700 | 127695 |
| Retentate घ (सीपीएम) में Dolichol - oligosaccharides | 4350 | 540 |
| Retentate में Dolichol oligosaccharides (%) ई | 1.4 ± 0.7 | 0.2 ± 0.2 |
तालिका 1 एन जुड़े deglycosidases और ग्लाइकोप्रोटीन नमूनों में dolichol oligosaccharides की उपस्थिति के साथ चीनी श्रृंखला के रिलीज के विश्लेषण.
हम NIH 3T3 कोशिकाओं से lysate नाड़ी - पीछा प्रक्रिया लागू होता है. Microcon निस्पंदन के बाद, लेबल एन लिंक्ड oligosaccharides मुख्य रूप से एंडो एच के साथ पल्स लेबलिंग (उच्च mannose प्रकार) के बाद और एक पीछा अवधि के बाद एन glycosidase एफ के साथ आगे के इलाज है, जो जटिल प्रकार (Golgi - प्रसंस्कृत glycans) के अनुरूप होगा साथ जारी किए गए, एंडो एच प्रतिरोधी oligosaccharides. यह मात्रात्मक विश्लेषण निर्धारित किया है कि dolichol oligosaccharides, प्रारंभिक retentate में एक लेबल के तुच्छ अंश के लिए जिम्मेदार है.
नोट:
- एनआईएच 3T3 कोशिकाओं थे नाड़ी [2 - 3 एच] के साथ लेबल mannose और पूरा मध्यम के साथ पीछा किया. YM30 Microcon के माध्यम से सेल और lysis निस्पंदन के बाद, उच्च mannose एन से जुड़े oligosaccharides retentates से ऊष्मायन द्वारा एंडो एच. के साथ जारी किए गए
- Endo एच प्रतिरोधी सामग्री (क) से Microcon retentates में तो एन glycosidase एफ साथ incubated किया गया था और एक जगमगाहट काउंटर में मापा oligosaccharides जारी है.
- मेथनॉल: 10:10:03 पानी अग्रदूत glycolipids को हटाने, और unextracted 1N NaOH में solubilized और एक जगमगाहट काउंटर में गिना सामग्री Microcon retentates (क) एंडो एच इलाज से पहले, क्लोरोफॉर्म के साथ 4 बार निकाले गए थे के रूप में प्राप्त है.
- Dolichol oligosaccharides (ग) के रूप में 1 में वर्णित है और एक जगमगाहट काउंटर में गिना से अर्क से शुद्ध किया गया.
- Retentate में कुल सीपीएम के dolichol oligosaccharides (घ) के प्रतिशत के लिए 3 प्रयोगों के औसत (ग + घ).
प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1. पल्स - पीछा अनुपचारित कोशिकाओं में और proteasomal निषेध पर कुल NIH 3T3 glycoproteins के विश्लेषण के साथ पल्स लेबलिंग 1 के बाद. [2 - 3 एच] हम कुछ glucosylated के साथ एक आशा प्रोफ़ाइल प्राप्तव्यापारियों (GLC 2 9 मैन 2 GlcNAc (G2M9) और G1M9) शेष है, लेकिन M9 में उपस्थित लेबल और M8 प्रजातियों के सबसे बाद सभी ग्लूकोज की trimming और एक mannose अवशेषों (चित्रा 1 ए) का परिणाम जा रहा है. कोई मुक्त mannose या अन्य छोटे व्यापारियों का पता चला रहे थे, शुद्धि की पूर्णता के लिए attesting. एक नहीं बल्कि लंबे 8h पीछा के बाद वहाँ अधिक व्यापक था M7-6 और M5 की एक छोटी राशि के लिए trimming, लेकिन प्रमुख प्रजातियों M9 और M8 (1 चित्रा बी) के लिए जारी रखा. यदि एक proteasomal अवरोध करनेवाला (30 सुक्ष्ममापी एमजी - 132) की उपस्थिति में पीछा किया गया था, वहाँ केवल ही इन प्रजातियों में से छंटनी की एक छोटी सी संचय (1 चित्रा सी) था.
चित्रा 2. कुल glycoproteins की तुलना में एक ERAD सब्सट्रेट के चीनी श्रृंखला के मात्रात्मक विश्लेषण. (ए) चित्रा 1 में एक के समान प्रयोग में, प्रत्येक oligosaccharide प्रजातियों के रिश्तेदार दाढ़ मात्रा mannose सामग्री के आधार पर गणना की गई . हम सीपीएम प्रत्येक glycan प्रजातियों के लिए प्राप्त मूल्यों परिवर्तित, तो सभी प्रजातियों वर्तमान के सापेक्ष दाढ़ मात्रा की कुल राशि के सापेक्ष प्रत्येक प्रजातियों के प्रतिशत दो प्रयोगों की एक औसत के लिए पीछा समय के एक समारोह के रूप में प्लॉट किया गया था. (बी) इसी प्रकार की के लिए (ए) कि ERAD सब्सट्रेट ASGPR H2a से जारी glycans को छोड़कर विश्लेषण किया गया के बाद 4 के लिए के लिए पल्स लेबलिंग और पीछा proteasomal अवरोध करनेवाला एमजी 132 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में उपस्थिति में (सी) 4 पीछा के लिए मान (ए) और (ख) ASGPR H2a और ग्लाइकोप्रोटीन पूल के लिए तुलना कर रहे हैं. एमजी-132 से (डी) एन जुड़े चीनी श्रृंखला trimming ईआर में प्रक्रियाओं की योजना है. चीनी trimming प्रक्रियाओं है कि M6-5 नेतृत्व (नि.) प्रोटीन है कि Golgi और परे करने के लिए बाहर निकलें. कि ERAD M9 - 8 की तुलना में उन पर लक्षित कर रहे हैं से जुड़े परिणामों से संकेत मिलता है कि ERAD प्रक्रिया mannose एन glycans trimming के 5-6 mannose शेष अवशेषों के साथ प्रजातियों की उपज के साथ जुड़ा हुआ है.
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Discussion
नाड़ी पीछा HPLC जुदाई के साथ जीवित कोशिकाओं में glycans का विश्लेषण एक glycoprotein के जीवन भर oligosaccharide संरचनात्मक परिवर्तन की गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक तरीका प्रदान करता है. वहाँ बढ़ती सबूत है कि इस तरह के परिवर्तन ईआर तह, गुणवत्ता नियंत्रण और अवैध व्यापार प्रणालियों 2-5 के लिए संकेतों के उत्पादन में शामिल हैं. विधि न केवल ब्याज की एक विशिष्ट ग्लाइकोप्रोटीन के लिए, लेकिन कुल glycoproteins, के रूप में इस लेख में सचित्र है, जहां हम एक विशिष्ट ERAD सब्सट्रेट की विषम सेलुलर ग्लाइकोप्रोटीन पूल के भाग्य और की तुलना में की संरचना की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए भी लागू किया जा सकता है . शुद्धि तकनीक सरल लेकिन फिर भी विशिष्ट है. यह सख्त deglycosidases और आणविक निस्पंदन का उपयोग करके यह सुनिश्चित किया है कि केवल एन जुड़े glycoproteins से जारी glycans प्राप्त कर रहे हैं, अन्य बड़े अणुओं के साथ लेबल [2 - 3 एच] पीछे छोड़ने O से जुड़े चीनी चेन और जीपीआई - लंगर प्रोटीन जैसे यार,. Oligosaccharides dolichol अग्रदूत से जारी एक नगण्य contaminant (तालिका 1) कर रहे हैं.
विधि का पता लगाने के एक उच्च संवेदनशीलता सामग्री शुरू करने की एक बहुत छोटी राशि का उपयोग प्रदान करता है. जब एक बहुत कम उपज की उम्मीद, संवेदनशीलता आगे HPLC SpeedVac का उपयोग भिन्न की मात्रा को कम करने से वृद्धि हुई किया जा सकता है. इस प्रकार, जगमगाहट द्रव की विलेयता सीमा पार किया जा सकता है और भिन्न की पूरी सामग्री जगमगाहट काउंटर में नजर रखी जा सकता है.
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Acknowledgments
हम तकनीकी सहायता के लिए Zehavit Frenkel और सैंड्रा Tolchinsky धन्यवाद. इस काम से संबंधित अनुसंधान के इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (1229-1207) और जर्मन इजरायल परियोजना सहयोग (डुबकी DFG) से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | |
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck & Co., Inc. | 1.0003 | |
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | EMD Millipore | UFC503024 or 4208 | |
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | |
| Dialyzed F–tal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | GIBCO, by Life Technologies | 41965039 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| EDTA disodium salt(Titriplex Iii) | Merck & Co., Inc. | 1084180250 | |
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | |
| F–tal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Frac-100 fraction collector | Amersham | 18-1000-77 | |
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter Inc. | 510720 | |
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer, Inc. | NET570A | |
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | |
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche Group | 11365177 | |
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | |
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection | CRL-1658 | |
| Opti-Flour | PerkinElmer, Inc. | 6013199 | |
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | |
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | |||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | |
| Triton X-100 | VWR | 306324N | |
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | |
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | |||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | |||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate,0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercapt–thanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
