Summary
Biz, memeli hücrelerinde biyosentezi sonra glikoproteinler erken ömrü boyunca N-bağlı glukanlardır değişiklik analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu darbe-kovalamaca metabolik etiketli glukanlardır, glikoproteinler ve HPLC ile incelenmesi enzimatik serbest analizi ile elde edilir.
Abstract
Eklenti, GLC
Protocol
Aşağıdaki protokol toplam glikoproteinler veya belirli bir glikoprotein ilgi şeker zincirleri analizleri için tasarlanmıştır. Prosedürü temelde birkaç değişikliklerle protokol boyunca belirtildiği gibi her iki durumda aynıdır.
- N-bağlı glukanlardır metabolik etiketleme için, bir gecede her bir örnek için 90 mm tabak içinde yetiştirilen memeli hücrelerinin bir akışkan kültürünü kullanmak için bir ihtiyacı farklı zaman noktalarında ya da tedavi temsil edebilir (numune). Bu protokol NIH 3T3 hücreleri için optimize edilmiştir.
- 5 ml taze hazırlanmış% 10 diyaliz FCS ve 5-15 dakika için 4 mM sodyum piruvat ile birlikte önceden ısıtılmış (37 ° C) glukoz-orta, inkübasyon glikoz hücreleri açlıktan.
- Açlık orta değiştirin önceden ısıtılmış 1 ml (37 ° C) glukoz-400 μCi içeren orta [2 - 3 H] (alt 65 konsantrasyonu μCi / ml Toplam glikoproteinler etiketlenmesi için kullanılan) mannoz-etiketli 1 saat için normal doku kültürü koşullarında hücrelerin kuluçkaya yatmaktadır.
- Her örnekten etiketleme orta çıkarın ve dikkatle 4 2 ml PBS eklemek ° kovalamak için ilgili örnekleri gerekir sırasında nabız ve buz (bu örnekler bakliyat olarak anılacaktır) onları yere karşılık gelen numune C, 2 ml ile 3 kez durulanır önceden ısıtılmış (37 ° C), normal tam bir kültür ortamı ve daha sonra 37 CO 2 inkübatör yerleştirilir ° C, istenilen kovalamaca süreler için, önceden ısıtılmış düzenli orta 5 ml.
- 2 ml buz gibi soğuk PBS ile darbe örnekleri (daha önce buz üzerinde yer) 3 kez durulayın. Bu hücreler daha sonra 2 ml PBS bir hücre kazıyıcı kullanarak çanak kazınmış ve 2 ml Eppendorf tüp yerleştirilir.
- 16000Xg (6-10 sn) hücreleri Kısa-spin süpernatantı atmak ve -80 hücre pelletini ° C dondurmak
- 5 ve kovalama, kovalamaca zaman sonunda numuneler için ayrıca 6 adımları gerçekleştirin.
- Hücreleri dondurucuya kaldırın ve tampon 300 ul Ayrıca onlara lyse kısaca vorteks ve inkübasyon, tampon B ile buz üzerinde 20 dakika buz üzerinde 20 dk inkübe ya da toplam glikoproteinler analiz durumda, sonication tarafından takip (4 kez, 10 sn, maksimum genlik), sonra 5 dk örnekleri kaynatın.
- 4 ° C'de 20 dakika süreyle 16000Xg lizatları Santrifüj Süpernatantı yeni Eppendorf tüpüne aktarın ve pelet iptal.
- Eğer toplam glikoproteinler analiz, moleküler filtrasyon ve deglycosylation (adım 17) geçin. H2A glikoprotein immunoprecipitation burada göstermiştir için, (Bizim örneğimizde H2A anti-antikor (Repligen), protein, A-agaroz boncuk 1:1 askı ve istenilen glikoprotein tavşan poliklonal anti H2A antikor 3 ul / numune 20l/sample eklemek ), adım 9 süpernatantı.
- Yavaş dönüşü ile sürekli karıştırma, numuneler 4 ° C'de 4-16 saat süreyle inkübe edin.
- 30 saniye boyunca 16000Xg boncuk Spin, supernatant kullanarak vakum ve dikkatli bir şekilde çıkarın.
- 500 ul tampon D ekleyerek ve vorteks, boncuk durulayın. Spin ve adım 12 gibi süpernatantı kaldırmak. Yıkama 3 kez tekrarlayın.
- Boncuk pelet 10μl denatüre tamponu (NEB endo-H kiti ile birlikte) ekleyin ve 5 dakika (toplam proteinlerin analiz edildiğinde, deglycosylation Microcon filtresi, adım 17) örnekleri kaynatın.
- (30 saniye için 16000Xg) boncuk aşağı çevirin ve yeni bir Eppendorf tüp içine süpernatantı transfer. Sonra, endo H enzim 0.5μl 10 ul reaksiyon tamponu (NEB endo H kiti ile birlikte) ile birlikte her örnek, örnekleri 37 ° C'de 3 saat inkübe edilir.
- Proteinlerden serbest glukanlardır ayırmak için, örnek sonra 3 dakika süreyle santrifüj 14000Xg, cut-off 30kDa 5 kez deiyonize su ile seyreltilir ve bir moleküler filtre (Microcon Ultracel YM30) üstüne konur. Deiyonize su numuneleri tekrar santrifüj 50μl uygulayın. Bu yıkanmaya flow-through tutarak, 2 kez daha tekrarlanır.
- Toplam glikoproteinler analiz yapıyorsanız, Microcon filtre lizatları süpernatant (adım 9) geçerlidir. 14000Xg az 3 dakika santrifüj tekrarlanan 3 kez tampon E, 100 ul özü yıkayın. 10X endo H reaksiyon tamponu 3 ul ve Microcon retentate endo H enzim 1.5 ul ekleyin ve 37 az 3 saat boyunca inkübe ° C 3 tekrarlanan santrüfüj piyasaya glukanlardır adım 16 olarak deiyonize su ile yıkandı.
- İsterseniz, H-endo dayanıklı glikoproteinler içeren 16 ve 17 adımları retentates, sonra 37, tampon C 15 ul N-glycosidase F 200mu inkübe ° C 16 saat Deiyonize su ile Elüsyon adım 16 olarak yapılır.
- SpeedVac konsantratör endo H reaksiyon flow-through (adım 16 ve 17) içeren tüp YeriVe tamamen örnekleri kuru (bu 45 kadar yapılabilir ° C, bu süreci hızlandırmak için).
- HPLC için numuneleri hazırlamak için, HPLC solvent (su, 60:40,% 1 fosforik asit asetonitril) 12 ul kuru pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
- HPLC cihazı (Spherisorb sütun bağlı) sabit çözücü akışı (1 ml / dk) ve basınç (1000 ve 2000 psi arasında belirli bir değer) ayarlayın ve her 1 dakikada bir tüp değiştirmek için bir fraksiyon toplayıcı yerleştirmek.
- HPLC cihazı örnekleri Yük ve fraksiyon toplayıcı aynı anda başlatmak.
- Her numune vadede ve standart bir oligosakkarit karışımı bir çalışma 1 ml 48 kesirler toplayın.
- 500 ul Transferi, her fraksiyon bir sintilasyon flakon ve 3 ml su karışabilir sintilasyon sıvı içeriği karıştırın.
- Şişeleri Yük ve sintilasyon sayacı okuma.
- Kopyaya okuma kesir sayısı bir fonksiyonu olarak çizilir.
- , Aşağıdaki gibi özel bir glukanıdır türler bir zirve içinde kopyaya değerleri temsil eder: kesirler 18-21 M8, M9 Kesirleri 36-39, M5, kesirler 22-26 ile M6, kesirler 27-31 M7, kesirler 32-35 karşılık kesirler G2M9 için 40-42 G1M9 ve kesirler 43-45.
- Her tepe içinde kesirler için kopyaya değerleri toplamı, belirli bir glukanıdır türlerin mutlak miktarını yansıtır. Aslında her glukanıdır türün mutlak miktarı içerdiği mannoz kalıntılarının sayısına göre ayrılmıştır: daha mannoz kalıntılarını içeren türlerin daha fazla etiket, her glukanıdır türün aşağıdaki gibi hesaplanır "göreli molar miktarı" Satın aldığınız için telafi etmek için . Bu değer, daha sonra, her belirli glukanıdır türleri için, "toplam yüzde" elde etmek için elde edilen tüm glukanıdır türlerin göreceli molar miktarda toplamına bölünür.
| Chase (h) | 0 | 4 |
| Endo H (CPM) ile yayımlanan | 90000 | 16800 |
| N-glycosidase F (CPM) b ile Çıkış | 20400 | 3900 |
| Retentate (CPM) c de Glikoproteinler | 371700 | 127695 |
| Retentate (CPM) d Dolichol-oligosakkaritler | 4350 | 540 |
| Retentate Dolichol-oligosakkaritler (%) e | 1.4 ± 0.7 | 0.2 ± 0.2 |
Tablo 1: N-bağlı şeker zincirleri deglycosidases ve glikoprotein örneklerinde dolichol-oligosakkaritler varlığı serbest Analizi.
NIH 3T3 hücreleri lizat darbe-kovalamaca prosedürü uygulanır. Microcon filtrasyon sonra, etiketli N-bağlı oligosakkaritler, darbe etiketleme sonra (yüksek mannoz tipi) ve N-glycosidase F karmaşık türü (Golgi işlenmiş glukanlardır) karşılık kovalamaca bir süre sonra daha ileri tedavi, endo H olmak üzere serbest bırakıldı endo H dayanıklı oligosakkaritler. Bu kantitatif analiz dolichol-oligosakkaritler, ilk retentate etiket önemsiz bir kısmını oluşturmaktadır belirlenir.
Notlar:
- NIH 3T3 hücreleri darbe [2 - 3 H] ile etiketlenmiş mannoz ve tam orta ile kovaladı. Microcon YM30 yoluyla hücre parçalama ve filtrasyon sonra, yüksek mannoz N-bağlı oligosakkaritler endo H. kuluçka tarafından retentates serbest bırakıldı
- Endo (a) Microcon retentates H-dayanıklı malzeme daha sonra N-glycosidase F inkübe ve sintilasyon sayacı ölçülen oligosakkaritler serbest bırakıldı.
- Metanol: su 10:10:03 habercisi glikolipitler kaldırmak ve 1N NaOH içinde çözünür ve bir sintilasyon sayacı sayılır unextracted malzeme Microcon retentates (a) endo H tedavi öncesi, kloroform ile 4 kez çıkarıldı olarak elde.
- Dolichol-oligosakkaritler (c) 1 açıklanan ve sintilasyon sayacı sayılır alıntılar saflaştırıldı.
- Ortalama retentate toplam cpm dolichol-oligosakkaritler (d) yüzde 3 deneyler (c + d).
Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1. 1s sonra tedavi edilmezse hücreleri ve proteozomal inhibisyonu üzerine toplam NIH 3T3 glikoproteinler Pulse-kovalamaca analizi ile darbe etiketleme [2 - 3 H] biz bazı glucosylated beklenen bir profil eldeöncüleri (GLC 2 Man 9 GlcNAc 2 (G2M9) ve G1M9) kalan, fakat M9 içinde mevcut etiket ve M8 türlerin çoğu, ikincisi tüm glikoz kırparak ve bir mannoz kalıntısı (Şekil 1 A) sonucu. No ücretsiz mannoz veya diğer küçük öncüleri arınma titizlik doğrulayan tespit edildi. Oldukça uzun bir 8h kovalamaca ardından M7-6 ve M5 küçük bir miktar kırpma daha kapsamlı olduğunu, ancak en önemli türler, M9 ve M8 (Şekil 1 B) olmaya devam etmiştir. Kovalayan bir proteozomal inhibitörü (30 mcM MG-132) huzurunda yapıldı ise, bu aynı kesilmiş türlerin (Şekil 1 C) küçük bir birikim vardı.
Şekil 2. ERAD bir substrat şeker zincirleri Kantitatif analiz toplam glikoproteinler. (A) Şekil 1'de birine benzer bir deneyde, her oligosakkarit türün bağıl molar miktarda mannoz içerik dayanarak hesaplandı. (B) Biz her glukanıdır tür için elde edilen kopyaya değerler dönüştürülür, sonra bütün türlerin mevcut bağıl molar miktarda toplamı göre her tür yüzde iki deneyler ortalama kovalamaca zamanın bir fonksiyonu olarak çizilen oldu. Benzer (A) ERAD substrat ASGPR H2A salınan bu glukanlardır hariç incelendi sonra varlığında 4h kovalamak için proteozomal inhibitörü MG-132 varlığı ya da yokluğu 4h için darbe etiketleme ve kovalamaca (C) Değerler (A) ve (B) ASGPR H2A ve glikoprotein havuzu için karşılaştırılır. MG-132 (D) N-bağlı şeker zinciri ER süreçleri kırparak Programı. Şeker kırpma işlemleri bu M9-8 karşılaştırıldığında ERAD hedeflenen proteinleri (R) Golgi ve ötesinde çıkın. Bağlantılı M6-5 yol Mannoz kalan 5-6 mannoz kalıntılarının tür verim N-glukanlardır kırparak ERAD süreci ile ilişkili olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HPLC ayırma ile canlı hücrelerin içinde glukanlardır darbe-kovalamaca analiz oligosakkarit yapısal değişikliklerin dinamikleri bir glikoprotein ömrü boyunca çalışmak için bir yöntem sağlar. ER katlama, kalite kontrol ve ticareti sistemleri 2-5 sinyalleri üreten bu tip değişikliklerin yer aldığını giderek artan kanıtlar vardır. Bu yöntem değil, sadece belirli bir ilgi glikoprotein için değil, aynı zamanda biz belirli bir ERAD substrat zıt kader ve hücresel bir glikoprotein havuzu karşılaştırıldığında bu makalede gösterildiği gibi toplam glikoproteinler, yapısının dinamiklerini analiz etmek için uygulanabilir . Arıtma tekniği, basit ama yine de belli. Man, O-bağlı şeker zincirleri ve GPI-demirlemiş proteinler gibi, sıkı deglycosidases ve moleküler filtrasyon kullanarak [3 H 2] ile işaretlenmiş diğer makromoleküller geride bırakarak, sadece glikoproteinler gelen yayımlanan N-bağlı glukanlardır elde edilir sağlanır. Dolichol habercisi yayımlanan oligosakkaritler önemsiz bir kirleticinin (Tablo 1).
Bu yöntem, malzeme başlayan bir çok az miktarda kullanarak tespit yüksek hassasiyet sağlar. Çok düşük bir verim bekliyor, hassasiyet SpeedVac kullanarak HPLC kesirler hacmini azaltarak daha da artmış olabilir. Böylece, sintilasyon sıvı çözünürlük sınırlaması üstesinden gelinmesi ve kesirler tüm içeriği sintilasyon sayacı takip edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz Zehavit Frenkel ve Sandra Tolchinsky teknik yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma ile ilgili araştırmalar, İsrail Bilim Vakfı (1229-1207) ve Alman-İsrail Projesi İşbirliği (DIP-DFG) hibe tarafından destekleniyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | |
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck & Co., Inc. | 1.0003 | |
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | EMD Millipore | UFC503024 or 4208 | |
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | |
| Dialyzed F–tal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | GIBCO, by Life Technologies | 41965039 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| EDTA disodium salt(Titriplex Iii) | Merck & Co., Inc. | 1084180250 | |
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | |
| F–tal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Frac-100 fraction collector | Amersham | 18-1000-77 | |
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter Inc. | 510720 | |
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer, Inc. | NET570A | |
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | |
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche Group | 11365177 | |
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | |
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection | CRL-1658 | |
| Opti-Flour | PerkinElmer, Inc. | 6013199 | |
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | |
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | |||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | |
| Triton X-100 | VWR | 306324N | |
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | |
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | |||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | |||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate,0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercapt–thanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
