Summary
IP - FCM法は、遺伝子工学や大規模なサンプルサイズを必要とせず、天然のタンパク質 - タンパク質相互作用の敏感な、堅牢な、生化学的評価を可能にする、提示される。
Abstract
フローサイトメトリー（IP - FCM）によって検出された免疫沈降はタンパク質 - タンパク質相互作用を検出および定量するための効率的な方法です。基本的な原理は、キャプチャされた主な分析対象物が物理的に多タンパク質複合体の中で関連する他の分子と一緒に検出できる特徴と、サンドイッチELISAのことを拡張します。手順は、細胞ライセートでこれらのビーズをインキュベート蛍光標識プローブで捕捉タンパク質複合体をプロービングし、フローサイトメトリーによってビーズに関連した蛍光を分析する、目的のタンパク質に特異的なモノクローナル抗体（mAb）を免疫沈降したポリスチレンラテックスビーズの共有結合を含む。 IP - FCMは、非常に敏感であり、そのネイティブ（非変性）状態でのタンパク質の解析を可能にし、どちらかの半定量的または定量分析に適している。追加の利点として、IP - FCMは、フローサイトメーター以外の遺伝子工学や特殊な機器を、必要としない、そしてそれは容易に高スループットのアプリケーションに適合させることができる。
Protocol
天然のタンパク質-タンパク質相互作用およびフローサイトメトリーによる多タンパク質複合体の高感度検出と定量分析：**このビデオプロトコルは、関連する出版物1に基づいています 。アダムG. Schrum、ダイアナギル、エレインP.ドップァー、デビッドL.ウィースト、ローレンスA.ツルカ、ヴォルフガングWA Schamel、エドパーマー。科学のSTKE 2007（389）：PL2 2007年6月5日、[DOI：10.1126/stke.3892007pl2]。 この文書を見るにはここをクリックしてください 。
起動する前に、次の水性ストック溶液を準備します。
| MESカップリングバッファ： | 25℃で保存 |
| MES、pH6.0の | 50mMの |
| EDTA | 1mMの |
| / /ストレージ（QBS）ブロッキングバッファー消光： | 4℃で |
| BSA | 一パーセント |
| アジ化ナトリウム | 0.02パーセント |
| PBS、pH7.4の | 1X |
| FCMバッファー： | 4℃で |
| トリス、pH7.4の | 50mMの |
| NaClの | 100mMの |
| アジ化ナトリウム | 0.02パーセント |
| FBS | 5パーセント |
| PBS、pH7.4の | 1X |
すぐに使用する前の準備：
| EDAC - MES： | MESカップリングバッファーで50 mg / mLのEDACの粉を溶かし |
| ジギトニン溶液（2％w / v）の： | 95に加熱することによってのdH 2 Oでジギトニンの粉を溶かし℃で5分間、氷上に冷却 |
| 溶解バッファー： | |
| トリス、pH7.4の | 50mMの |
| NaClの | 150 mmの |
| ジギトニンのソリューション | 一パーセント |
| プロテアーゼ阻害剤 | 1X |
| 氷上に置きます |
1。ビーズに抗体のカップリング
- PBSで希釈し、血球計でカウントすることにより、購入した株式からビーズの濃度を決定する。カウントのためのビーズの1:10000希釈で始まります。
- ピペット18 1.5 mLのマイクロ遠心チューブに× 10 6ビーズ。
- 各洗浄後25℃で3分間、20,000 G · Cで遠心分離、0.5〜1.0mLのMESのカップリングバッファーでビーズを2〜3回洗浄する。
- 50μLMESのカップリングバッファーでビーズを再懸濁します。
- 作りたてのEDAC - MESの20μLを加えることにより、ビーズ上のカルボキシル基を活性化する。
- 25℃を手動ピペッティングで15分間穏やかに混合する。
- 25℃で3分間、20,000 gで遠心分離° Cを各洗浄後、0.5〜1.0mLのPBS中で活性化ビーズを2〜3回洗浄する。
- 50μLのPBSで活性化ビーズを再懸濁します。
- 活性化ビーズソリューションにIPモノクローナル抗体（0.2〜1.0 mg / mLの原液濃度で）を50μLを加える。
- 振動シェーカーにチューブを配置することにより25℃で3〜4時間のミックス。チューブの底にビーズの沈降を防止するために十分にシェイク。
- ウォッシュ抗体結合ビーズは0.5〜1.0mLのPBSで2〜3倍は、各洗浄後25℃で3分間、20,000 gで° C遠心分離。
- 100μLQBSバッファーでビーズを再懸濁します。これらは、4℃で保存することができます
- ビーズを一時停止するだけでなく、PBSで1:200-1:10,000を希釈し、血球計でカウント。濃度は、それぞれのIPまたは、プルダウン実験に使用したビーズの数を正確に制御できるように、各分取バッチを測定する必要があります。
2。ポスト核ライセートの調製とIP
溶解法と最適な溶解条件は、細胞の種類や検査中のタンパク質 - タンパク質相互作用に依存します。多数のプロトコルが存在し、アプリケーションに変更することができます。
- 氷上で20分を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに100μLの新鮮な溶解バッファーで、そのようなリンパ球、または5のような20 × 10 6'small'は細胞を、このようなマクロファージや腫瘍細胞など× 10 6'大'細胞を、溶解する。必要に応じて溶解量を拡大縮小します。
- 核と不溶性の細胞残渣を除去するために、4℃で10分間、20,000 gでライセートを遠心上清をキープし、ペレットを捨てる。
- ミックスに軽くピペッティング0.5 × 10清澄溶解液5〜2.5 × 10 5抗体結合ビーズを追加します。我々の目的で使用する最小量単一のIPを実行するには、5μLです。
- 寒い部屋で一晩に垂直な回転する車輪の上に置いて4時間。セトリングからビーズを防ぐのに十分な速度に設定します。それは、回転中にチューブの底に残っている少量のIPの液体に対して許容可能である。
3。蛍光標識抗体とビーズに捕捉されたタンパク質のプロービング
- 4で20,000 gで遠心分離° Cを各洗浄後に3分間、0.2〜1.0mLの氷冷FCMバッファーのIPビーズを2回洗浄する。
- 五人以上、1.5 mLのマイクロ遠心チューブまたは煙突、底板の各ウエルに100μLのFCMバッファー、アリコート20μlにビーズを再懸濁します。
- サンプルに蛍光色素標識モノクローナル抗体を追加。 FCMは、ベンダーの指示に従ってまたは経験的に決定した濃度に応じて染色行います。出発点として、チューブごと、またはよく株式の抗体溶液の0.2〜1μLを（0.2〜1.0 mg / mLの時）に追加し、氷上で40分間インキュベートする。
- ウォッシュは4で20,000 gで遠心分離、1.0 mlの氷冷したFCMバッファーに1.5 mlチューブに2回ビーズをプローブ·各洗浄後の3分間。優しくビーズを乱さないように注意しながら、それぞれの洗浄の後に上清を取り除く。煙突底板の場合は、4℃で5分間千グラムで遠心分離、0.2mLの氷冷FCMバッファーで2回洗浄° Cを各洗浄後。マルチチャンネルピペッターは、このステップに便利です。煙突の底板にビーズから上清を除去するには、"フリック"プレートは一度、その後、まだ逆さにしながら、井戸の端から任意のしずくを汚点。各ウェル内の残留量は、ビーズを含む、約20μLになります。
- サンプルあたり200μLのFCMバッファーでビーズを再懸濁します。というラベルのFACSチューブに移す。現在、サンプルFCMのための準備が整いました。
4。 FCM取得
このプロトコルで説明されているCMLのビーズは、直径3〜5μmの、静止マウスのリンパ球の約半分の直径です。そのため、手動でスケールを登録するためにビーズのイベントの集団のために前方散乱光（FSC）アンプゲインと側方散乱光（SSC）の電圧を増加させる必要があるかもしれません。個々のIPのビーズは、単一のしっかりとクラスタ化された人口を形成すべきである。設定とゲートがビーズダブレットと破片を除外するように調整する必要があります。
- ビーズやビーズの基準を実行する前に、いくつかのメーターに試料導入口を囲む滴封じ込めのスリーブを取り外します。これは入口をクリアし、別のサンプルから引き継がれてからビーズを防止するようにシース液は、サンプル間に滴下することができます。
- 両方否定的と肯定的な蛍光が極端に対数x軸で同時に表示されるように設定を調整するためにラベルのないビーズ、蛍光のネガティブコントロール、そして虹のキャリブレーション粒子（RCPs）、蛍光の陽性コントロールを、使用してください。これは、実験試料からの蛍光は、また規模になることが保証されます。 FSCとSSCのパラメータは、そう、RCPsはCMLのビーズよりも小さいことに注意して、同様にゲートの位置、一時的にそのサンプルのため変更する必要があるかもしれません。
- RCPsとキャリブレーションが完了すると、ラベルの付いていないビーズの設定に戻ります。サンプルごとに1つの蛍光プローブが使用されている場合、蛍光補正は必要ありません。一般的に、我々は、FCMのサンプルごとに単一の蛍光色素標識モノクローナル抗体を持つ多タンパク質複合体の検出を行ない、我々は、様々なサブユニットの特異的mAbでパラレルビーズ試料を染色することによって、複数の相互作用パートナーを調べる。
- 蛍光データファイルを取得して保存。分析は、フローサイトメトリーのようなCellQuest、FlowJoなどのソフトウェア、またはCFlowを使用して実行することができます。
5。代表的な結果
図1。マウス系統BALB / cからTCR/CD3多タンパク質複合体のためのIP - FCM。T細胞は1％ジギトニンで溶解し、ライセートを抗CD3εのビーズを使用してIP - FCMを行った。キャプチャされた複合体は、TCR -β（紫の領域）の有意な量を含んでおり、共同で関連したCD3 -ε（緑）、それに近いバックグラウンドレベルに（無関係の免疫グロブリンのプローブ、ピンクのトレースによって定義される）などThy1.2のような他のタンパク質のCD45、またはH - 2K（D）（茶色、オレンジ、そして青のトレース、それぞれ）。同様の以前に公表された結果1-6を参照してください。
Discussion
タンパク質 - タンパク質相互作用に関する情報は、このようなシグナル伝達、系統の成熟、細胞周期の進行、およびアポトーシスのカスケードのような多くの細胞プロセスの分析との関連性が高いです。 IP - FCMは、タンパク質の相互作用を調べたり、その本来のコンフォメーションで多タンパク質複合体のメンバーを定義するために、迅速な定量的、かつ高感度な方法を提供します。ビーズが結合し、細胞溶解物と共にインキュベートした一日にしてプローブと次の日に分析することができますすることができます。 96ウェルプレートフォーマットでは、統計的またはスクリーニングpurposesのために効率的なデータ収集を提供するために、一度に分析するサンプルの大規模な数値を可能にする。蛍光ビーズの基準を使用して、それぞれのビーズによって捕捉されたタンパク質の数を推定することができる。非常に小さなソースの材料は、捕捉および検出のために必要ですので、限られたサンプルと希少な検体は、依然として、複数の相互作用を分析することができます。 IP - FCMは、非生理的環境でのタンパク質の遺伝子工学、エピトープタギング、変性、またはインビトロでのミキシングを必要としないが、それはそれへの適用性を持つ貴重なとアクセス可能なツールとなって、これらと他の技術と組み合わせて使用することができます多くの生物学的システム。
トラブルシューティング：
多くのIP - FCMの実験では、有用なタンパク質相互作用のデータに彼らが試みている初めてを生成します。しかし、IP - FCMの最適化は、ビーズ、タンパク質複合体のキャプチャ、および結合性蛍光プローブに抗体結合を向上させることができます。
IP抗体結合の効率は、抗免疫グロブリン抗体と直接結合したビーズをプローブによって決定することができる。この効率性が低い場合は、カップリング反応時の抗体の濃度を増加させるとより多くのIP抗体は、それぞれのビーズに接続できるようにすることができます。これは、分析対象物の拡張された捕捉および検出の結果、IPビーズバッチの結合容量を増やすことができます。これらはビーズ添付ファイルと低い抗体の結合の結果のモノクローナル抗体と競合できるように他の主要なアミン含有分子（例えば、トリス、ウシ血清アルブミン）は、カップリング反応の間に存在すべきではない。ビーズへの抗体の結合は、他の理由から問題が判明した場合、ビーズの代わりにアビジン/ストレプトアビジンに結合することができ、そしてビオチン化抗体は、その後に非共有結合とimmunprecipitationに使用することができます。
良い抗体結合にもかかわらず、ビーズ関連蛍光の最初の検出は、低い可能性があります。最初に、複雑なキャプチャ自体は低いかもしれない。 IP - FCMは、ユニットの溶解体積あたりの溶解した細胞の数を増やし、検体の濃度に依存するため、分析物捕捉および検出を向上させることができます。さらに、キャプチャは、キャプチャが少ないビーズ間の複合体、およびプローブビーズ当たりの増加の平均蛍光の結果を配布ライセート、とインキュベートIPビーズの数を減らすことで改善されることがあります。第二に、それは、キャプチャされた複合体へのプローブの抗体のアクセスが立体的に免疫沈降抗体によって阻害されている可能性があります。この場合、問題は、および/またはプローブをキャプチャする別の抗体を使用して対処することができます。
Acknowledgments
この作品は、イーグルスイノベーションアワード（イーグルスの友愛会）でとメイヨー財団によってサポートされていました。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics | 2-5000 | Store at 4°C. |
| Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
| 2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma-Aldrich | M-5287 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Sigma-Aldrich | 22980 E-6383 | Store at -20°C under desiccating conditions. |
| Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
| PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher Scientific | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |
References
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).
- Schrum, A. G. Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).
- Teixeiro, E. T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains. Immunity. 21, 515-526 (2004).
- Teixeiro, E. Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development. Science. 323, 502-505 (2009).
- Treves, S. Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion. J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).
- Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes. J Exp Med. 201, 517-522 (2005).
