Summary
ويقدم الأسلوب IP - FCM ، الذي يسمح للقوي وحساسة ، وتقييم من التفاعلات الكيميائية الحيوية البروتين البروتين الأصلي ، دون الحاجة إلى الهندسة الوراثية أو أحجام عينة كبيرة.
Abstract
مناعي الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي (IP - FCM) هو وسيلة فعالة لكشف وقياس البروتين البروتين التفاعلات. المبدأ الأساسي الذي يمتد من شطيرة ELISA ، حيث يمكن الكشف عن القبض على الحليلة الابتدائية مع الجزيئات الأخرى المرتبطة بدنيا داخل المجمعات multiprotein. الإجراء ينطوي على اقتران التساهمية من اللاتكس microbeads البوليسترين immunoprecipitating مع الاجسام المضادة (ماب) معينة للحصول على البروتين من الفائدة ، واحتضان هذه الخرز مع lysates الخلية ، وسبر مجمعات البروتين ملون تألقي مع أسر ، مترافق تحقيقات وتحليل حبة المرتبطة مضان بواسطة التدفق الخلوي. IP - FCM حساس للغاية ، يتيح تحليل البروتينات في الدولة الأم (غير المعطل) ، وإما قابلة للتحليل الكمي أو شبه كمي. ومزايا إضافية ، IP - FCM لا يتطلب أي معدات أو الهندسة الوراثية المتخصصة وغيرها من تدفق عداد الكريات ، ويمكن تكييفها بسهولة للتطبيقات عالية الإنتاجية.
Protocol
** يعتمد هذا البروتوكول على نشر الفيديو المرتبطين بها 1 : حساسية عالية الكشف والتحليل الكمي للتفاعلات البروتينات والبروتين والمجمعات multiprotein الأصلية بواسطة التدفق الخلوي. آدم زاي Schrum ، ديانا جيل ، P. Dopfer الين ، ديفيد ويست إل ، لورانس ألف Turka ، وولفغانغ WA Schamel ، إد بالمر. STKE العلم في 2007 (389) : PL2 ، 5 حزيران 2007 ، [DOI : 10.1126/stke.3892007pl2]. الرجاء النقر هنا لرؤية هذا المنشور .
قبل البدء ، وبعد تحضير ألبوم الحلول المائية :
| MES توصيلات الاحتياطي : | تخزين في درجة حرارة 25 مئوية |
| MES ، ودرجة الحموضة 6.0 | 50 ملي |
| EDTA | 1 ملم |
| تبريد / حظر / التخزين (QBS) العازلة : | المحل في 4 درجات مئوية |
| BSA | 1 ٪ |
| أزيد الصوديوم | 0.02 ٪ |
| برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.4 | 1X |
| FCM الاحتياطي : | المحل في 4 درجات مئوية |
| تريس ، ودرجة الحموضة 7.4 | 50 ملي |
| كلوريد الصوديوم | 100 ملي |
| أزيد الصوديوم | 0.02 ٪ |
| FBS | 5 ٪ |
| برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.4 | 1X |
إعداد مباشرة قبل الاستعمال :
| EDAC - MES : | حل 50 ملغ / مل مسحوق EDAC في مخزن توصيلات MES |
| ديجيتونين حل (2 ٪ وزن / V) : | مسحوق يذوب في ديجيتونين درهم 2 O عن طريق التسخين إلى 95 درجة مئوية لمدة 5min التبريد ثم على الجليد |
| تحلل الاحتياطي : | |
| تريس ، ودرجة الحموضة 7.4 | 50 ملي |
| كلوريد الصوديوم | 150 ملم |
| ديجيتونين الحل | 1 ٪ |
| مثبطات الأنزيم البروتيني | 1X |
| تبقي على الجليد |
1. اقتران خريطة موقع لالخرز
- تحديد تركيز حبات من الأسهم المشتراة من قبل تمييع في برنامج تلفزيوني والفرز مع عدادة الكريات. تبدأ 1:10000 التخفيف من الخرز لفرزها.
- ماصة 18 × 10 6 حبات في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- تغسل حبات 2 إلى 3 مرات في 0،5-1،0 مل الاحتياطي توصيلات زارة التربية والعلم ، الطرد المركزي في 20000 ز لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية بعد كل غسل.
- Resuspend الخرز في 50 ميكرولتر الاحتياطي توصيلات زارة التربية والعلم.
- تنشيط مجموعات الكربوكسيل على الخرز بإضافة 20 ميكرولتر من الطازجة MES - EDAC.
- المزيج برفق لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 25 مئوية بحلول pipetting يدويا صعودا وهبوطا.
- تغسل حبات تنشيط 2 إلى 3 مرات في برنامج تلفزيوني مل 0،5-1،0 ، الطرد المركزي في 20000 ز لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية بعد كل غسل.
- Resuspend حبات تنشيط برنامج تلفزيوني في 50 ميكرولتر.
- إضافة 50 ميكرولتر من خريطة موقع IP (0،2-1،0 في تركيز الأسهم ملغ / مل) إلى الحل حبة تفعيلها.
- المزيج لمدة 3 إلى 4 ساعات عند درجة 25 عن طريق وضع أنبوب على شاكر تهتز. بما فيه الكفاية لمنع زعزعة الاستقرار من الخرز على الجزء السفلي من الأنبوب.
- تغسل حبات خريطة موقع ، إضافة 2 إلى 3 مرات في برنامج تلفزيوني مل 0،5-1،0 ، الطرد المركزي في 20000 ز لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية بعد كل غسل.
- Resuspend الخرز في 100 مخزن QBS ميكرولتر. ويمكن تخزين هذه في 4 درجة مئوية.
- تعليق الخرز جيدا ، وتمييع 1:200-1:10،000 في برنامج تلفزيوني والعد مع عدادة الكريات. يجب أن يكون قياس تركيز كل دفعة إعدادي ، بحيث يمكن لعدد من الخرز المستخدمة في كل تجربة أو IP المنسدلة التي تسيطر عليها بدقة.
2. آخر الحائزة إعداد Lysate والملكية الفكرية
والأسلوب وتحلل الأوضاع تحلل الأمثل تعتمد على نوع من الخلايا والبروتين البروتين التفاعلات يجري فحصها. وهناك عدد من البروتوكولات موجودة ويمكن تعديلها لطلبك.
- ليز 20 × 10 6 'الصغيرة' الخلايا ، مثل الخلايا اللمفية ، أو 5 × 10 6 'كبيرة' الخلايا ، مثل الخلايا البلعمية الكبيرة أو الخلايا السرطانية ، في 100 ميكرولتر تحلل عازلة جديدة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل ل20min على الجليد. مقياس حجم تحلل حسب الحاجة.
- لإزالة النوى والحطام الخلوية غير قابلة للذوبان ، وأجهزة الطرد المركزي في lysate ز 20000 لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. وطاف الاحتفاظ تجاهل بيليه.
- إضافة 0.5 × 10 5-2،5 X - 10 5 خريطة موقع يقترن الخرز lysate إلى توضيح ، pipetting برفق لالمزيج. حجم الحد الأدنى الذي نستخدمه لأداء IP واحد هو 5 ميكرولتر.
- مكان على رأسي 4 ساعات بالتناوب العجلة ليلة وضحاها في غرفة باردة. لتعيين سرعة كافية للحيلولة دون تسوية من الخرز. فمن المقبول بالنسبة للسيولة منخفضة حجم الشرطة العراقية أن تبقى في قاع الأنبوب أثناء الدوران.
3. تحقق من الخرزة التي تم الاستيلاء عليها ملون تألقي مع البروتين ، مترافق الأضداد
- تغسل حبات IP مرتين في 0،2-1،0 مل الجليد الباردة الاحتياطي FCM ، الطرد المركزي في 20000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق بعد كل غسل.
- Resuspend الخرز في 100 ميكرولتر FCM 20 ميكرولتر العازلة وقسامة في كل من خمسة أو أكثر أنابيب microcentrifuge 1.5 مل أو الآبار لوحة مدخنة القاع.
- إضافة ملون تألقي ، مترافق MABS للعينات. نفذ FCM صمة عار وفقا لتعليمات للبائع أو وفقا لتركيزات تحدد تجريبيا. كنقطة انطلاق ، إضافة 0،2-1 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأسهم (في 0،2-1،0 ملغ / مل) في أنبوب أو جيدا ، واحتضان لمدة 40 دقيقة على الجليد.
- بحث تغسل حبات في 1.5 مل مرتين في أنابيب 1.0 مل الاحتياطي FCM الجليد الباردة ، الطرد المركزي في 20000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق بعد كل غسل. طاف إزالة بلطف بعد كل غسل ، مع الحرص على عدم تعكير صفو الخرز. لوحة مدخنة القاع ، ويغسل مرتين مع 0.2 مل من الجليد الباردة الاحتياطي FCM ، الطرد المركزي في 1000g لمدة 5 دقائق حتى 4 بعد كل غسل درجة مئوية. A pipettor الأقنية مفيد لهذه الخطوة. لإزالة طاف من الخرز في صفيحة مدخنة القاع ، 'نفض الغبار" لوحة واحدة ، ثم ، في حين لا تزال مقلوبة ، أي لطخة تقطر من حواف الآبار. حجم المتبقية في كل بئر ، الذي يحتوي على حبات ، وسوف تكون حوالي 20 ميكرولتر.
- Resuspend الخرز في 200 مخزن FCM ميكرولتر لكل عينة. لأنابيب نقل FACS المسمى. نماذج جاهزة الآن لFCM.
4. FCM اقتناء
حبات CML الموصوفة في هذا البروتوكول 3 إلى 5 ميكرون في القطر ، ما يقرب من نصف قطرها من اللمفاويات الماوس هادئة. لذلك ، قد يكون من الضروري زيادة يدويا مبعثر إلى الأمام (FSC) أمبير وكسب مبعثر الجانبية (SSC) الجهد من أجل سكان حبة لتسجيل الأحداث على نطاق واسع. ينبغي الخرز IP فردية تشكل احد سكان مجمع بإحكام. وينبغي تعديل الإعدادات وبوابة لاستبعاد doublets حبة والحطام.
- قبل تشغيل أو معايير الخرز حبة ، إزالة الأكمام الاحتواء الحبرية التي تحيط مدخل عينة على بعض cytometers. تسمح السائل إلى غمد بالتنقيط بين العينات ، لأن هذا سيؤدي إلى مسح المدخل ، ومنع من الخرز يجري ترحيلها من عينة واحدة إلى أخرى.
- استخدام الخرز غير المسماة ، والسيطرة السلبية لمضان ، والجسيمات معايرة قوس قزح (عمليات التشاور الإقليمي) ، والسيطرة الإيجابية لمضان ، لضبط الإعدادات بحيث أن كلا من النهايات السلبية والإيجابية مضان تظهر في نفس الوقت على محور س تسجيل النطاق. هذا يضمن أن مضان من العينات التجريبية ستكون أيضا على نطاق واسع. علما بأن عمليات التشاور الإقليمي هي أصغر من حبات CML ، لذا FSC والمعلمات محكمة أمن الدولة ، فضلا عن موقف البوابة ، قد تحتاج إلى تغيير مؤقت لتلك العينة.
- عودة إلى غير المسماة ، حبة الإعدادات مرة واحدة مع المعايرة اكتمال عمليات التشاور الإقليمي. إذا تم استخدام واحد فقط لكل عينة الفلورسنت التحقيق ، أي تعويض مضان ضروري. بشكل عام ، ونحن التحقيق مع المجمعات multiprotein خريطة موقع ملون تألقي ، مترافق عينة واحدة لكل FCM ، ونحن شركاء دراسة التفاعل تلطيخ عينات متعددة بواسطة حبة بالتوازي مع MABS محددة لمفارز مختلفة.
- اكتساب وحفظ ملفات البيانات مضان. ثم يمكن أن يؤديها باستخدام تحليل التدفق الخلوي البرمجيات مثل CellQuest ، FlowJo ، أو CFlow.
5. ممثل النتائج
الشكل 1. IP - FCM لمجمع multiprotein TCR/CD3. خلايا تي من سلالة الماوس وlysed BALB / ج في ديجيتونين 1 ٪ ، وتعرضت لlysate FCM - IP استخدام الألغام المضادة للCD3ε الخرز. الواردة في المجمعات استولت على كميات كبيرة من TCR - β (المنطقة الأرجواني) ، وشارك المرتبطة CD3 - ε (الأخضر) ، ولكن ، على مقربة من المستويات الخلفية (التي حددتها لجنة التحقيق المناعي لا صلة لها بالموضوع ، والوردي التتبع) من البروتينات الأخرى مثل Thy1.2 CD45 ، أو H - 2K (د) (البني والبرتقالي والأزرق وآثار ، على التوالي). انظر نتائج مماثلة نشرت سابقا 1-6.
Discussion
معلومات عن البروتين البروتين التفاعلات ذات الصلة للغاية لتحليل العديد من العمليات الخلوية مثل نقل الإشارة ، والنضج النسب ، تقدم دورة الخلية ، وشلالات موت الخلايا المبرمج. IP - FCM يوفر طريقة سريعة ، والكمية ، وحساسة لدراسة التفاعل بين البروتينات وتحديد أعضاء المجمعات multiprotein التشكل في وطنهم. ويمكن أن يترافق مع الخرز والمحتضنة lysates الخلية في يوم واحد ، ويمكن بحثها وتحليلها في اليوم التالي. تنسيق لوحة 96 - جيدا يسمح لأعداد كبيرة من عينات لتحليلها في وقت واحد لتوفير كفاءة جمع البيانات لأغراض إحصائية أو الفرز. باستخدام معايير حبة فلوري ، يمكن تقدير عدد من البروتينات التي استولت عليها في كل حبة. وهناك حاجة مادية ضئيلة للغاية من أجل القبض على مصدر والكشف ، وبالتالي لا تزال محدودة ، وعينات نادرة analytes يتم تحليلها لتفاعلات متعددة. على الرغم من أن الملكية الفكرية لا يتطلب FCM الهندسة الوراثية ، ووضع علامات حاتمة ، تمسخ ، أو في المختبر ، مزج البروتينات في بيئة غير فسيولوجية ، ويمكن أن يترافق مع هذه التقنيات وغيرها ، مما يجعلها أداة قيمة والوصول إلى تطبيق مع كثير من النظم البيولوجية.
المشاكل :
العديد من التجارب IP - FCM توليد بيانات مفيدة التفاعل البروتين المرة الأولى التي حاول فيها. ومع ذلك ، يمكن الاستفادة المثلى من FCM - IP تحسين تصريف الأجسام المضادة لالخرز ، والقبض على بروتين معقد ، والتحقيق الفلورسنت ملزمة.
ويمكن تحديد كفاءة الاقتران الضد الملكية الفكرية من خلال التحقيق الخرز يقترن مباشرة مع الأضداد المضادة للالمناعي. إذا كان هذا هو الكفاءة المنخفضة ، ويمكن زيادة تركيز الأجسام المضادة خلال تفاعل الأضداد اقتران تسمح IP أكثر لنعلق على كل حبة. وهذا يمكن أن يزيد من قدرة ربط الدفعة حبة الملكية الفكرية ، مما أدى إلى القبض على تعزيز والكشف من analytes. ينبغي الأولية الأخرى التي تحتوي على جزيئات الأمينات (على سبيل المثال تريس ، ألبومين المصل البقري) لن يكون حاضرا أثناء اقتران رد فعل ، وهذه يمكن أن تتنافس مع خريطة موقع لمرفق حبة ويؤدي إلى اقتران خريطة موقع منخفض. إذا اقتران خريطة موقع ليثبت الخرز إشكالية لأسباب أخرى ، يمكن بدلا من ذلك إلى أن يقترن الخرز أفيدين / streptavidin ، والأجسام المضادة biotinylated يمكن في وقت لاحق غير محدد وتساهميا المستخدمة لimmunprecipitation.
على الرغم من اقتران الأضداد جيدة ، قد كشف الأولي للحبة المرتبطة مضان تكون منخفضة. أولى ، قد تكون هي نفسها معقدة التقاط منخفضة. وذلك لأن IP - FCM يعتمد على تركيز من analytes ، وزيادة عدد الخلايا في حجم lysed تحلل زيادة حدة التقاط تحليلها والكشف. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم القبض على تعزيز من خلال خفض عدد من الخرز IP المحتضنة مع lysate ، التي توزع عبر المجمعات أسر أقل الخرز ، والنتائج في مضان زاد متوسط لكل حبة عند بحثها. الثانية ، فمن الممكن أن يعرقل وصول sterically الضد التحقيق الى المجمعات التي استولت عليها immunoprecipitating الأضداد. في هذه الحالة ، يمكن أن تعالج المشكلة عن طريق استخدام أجسام مضادة مختلفة لالتقاط و / أو التحقيق.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل على جائزة الابتكار النسور (ترتيب الشقيق النسور) ، ومؤسسة مايو كلينيك.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics | 2-5000 | Store at 4°C. |
| Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
| 2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma-Aldrich | M-5287 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Sigma-Aldrich | 22980 E-6383 | Store at -20°C under desiccating conditions. |
| Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
| PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher Scientific | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |
References
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).
- Schrum, A. G. Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).
- Teixeiro, E. T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains. Immunity. 21, 515-526 (2004).
- Teixeiro, E. Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development. Science. 323, 502-505 (2009).
- Treves, S. Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion. J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).
- Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes. J Exp Med. 201, 517-522 (2005).
