Summary
Den IP-FCM-metoden presenteras, vilket gör en känslig, robust, biokemiska bedömning av infödda protein-protein interaktioner, utan att kräva genteknik eller stora storlekar prov.
Abstract
Immunoprecipitation upptäckas med flödescytometri (IP-FCM) är en effektiv metod för att upptäcka och kvantifiera protein-protein interaktioner. Den grundläggande principen förlänger som sandwich-ELISA, där den fångade primära analyten kan detekteras tillsammans med andra molekyler fysiskt samband inom Multiproteinkomplex. Förfarandet innebär kovalent koppling av mikrokulor polystyren latex med immunoprecipitating monoklonala antikroppar (mAb) specifika för ett protein av intresse, inkubering dessa pärlor med cell lysates, utforskande fångat proteinkomplex med fluorokromkonjugerade sonder, och analysera pärla-associerade fluorescens med flödescytometri. IP-FCM är extremt känslig, gör en analys av proteiner i sitt eget (icke-denaturerat) tillstånd, och är mottaglig för antingen semikvantitativ eller kvantitativ analys. Som ytterligare fördelar, kräver IP-FCM inga genteknik eller specialiserad utrustning, annat än en flödescytometer, och det kan vara lätt anpassas för high-throughput applikationer.
Protocol
** Denna video Protokollet är baserat på en tillhörande publikation 1: Högkänslig detektion och kvantitativ analys av infödda protein-protein interaktioner och komplex Multiproteinkomplex med flödescytometri. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel, Ed Palmer. Vetenskapens STKE 2007 (389): PL2, juni 5, 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. Klicka här för att se denna publikation .
Före start, förbereda följande Vattenlösning Stock lösningar:
| MES Koppling buffert: | Förvaras vid 25 ° C |
| MES, pH 6,0 | 50 mM |
| EDTA | 1 mM |
| Släckning / blockering / Lagring (QBs) buffert: | Förvaras vid 4 ° C |
| BSA | 1% |
| Natriumazid | 0,02% |
| PBS, pH 7,4 | 1x |
| FCM buffert: | Förvaras vid 4 ° C |
| Tris, pH 7,4 | 50 mM |
| NaCl | 100 mM |
| Natriumazid | 0,02% |
| FBS | 5% |
| PBS, pH 7,4 | 1x |
Förbered omedelbart före användning:
| EDAC-MES: | Lös upp 50 mg / ml EDAC pulver i MES Koppling Buffert |
| Digitonin lösning (2% w / v): | Lös digitonin pulver i dH 2 O genom upphettning till 95 ° C för 5min sedan kyla på is |
| Lyseringsbuffert: | |
| Tris, pH 7,4 | 50 mM |
| NaCl | 150 mm |
| Digitonin lösning | 1% |
| Proteashämmare | 1x |
| Håll på is |
1. Koppling av mAb till Pärlor
- Bestäm koncentrationen av pärlor från de köpta beståndet genom att späda i PBS och räknar med en hemacytometer. Börja med en 1:10000 spädning av pärlor för att räkna.
- Pipettera 18 x 10 6 kulor i en 1,5-mL mikrocentrifugrör.
- Tvätta pärlor 2 till 3 gånger hos 0,5 till 1,0 ml MES Koppling buffert, centrifugera på 20.000 g under 3 minuter vid 25 ° C efter varje tvätt.
- Resuspendera pärlor i 50 mikroliter MES Koppling buffert.
- Aktivera karboxylgrupper på kulorna genom att lägga till 20 mikroliter av nyberedd EDAC-MES.
- Blanda försiktigt i 15 min vid 25 ° C genom att manuellt pipettera upp och ned.
- Tvätta aktiveras pärlor 2 till 3 gånger hos 0,5 till 1,0 ml PBS, centrifugera på 20.000 g under 3 minuter vid 25 ° C efter varje tvätt.
- Resuspendera aktiveras pärlor i 50 mikroliter PBS.
- Tillsätt 50 mikroliter av IP mAb (vid 0,2-1,0 mg / ml lager koncentration) till den aktiverade pärla lösningen.
- Blanda i 3 till 4 timmar vid 25 ° C genom att placera röret på en vibrerande shaker. Skaka tillräckligt för att förhindra att lösa av pärlorna på botten av röret.
- Tvätta mAb-kopplade pärlor 2 till 3 gånger hos 0,5 till 1,0 ml PBS, centrifugera på 20.000 g under 3 minuter vid 25 ° C efter varje tvätt.
- Resuspendera pärlor i 100 mikroliter QBs buffert. Dessa kan lagras vid 4 ° C.
- Avbryta pärlor väl, späd 1:200-1:10,000 i PBS och räkna med en hemacytometer. Koncentrationen måste mätas för varje preparativ parti, så att antalet kulor som används i varje IP-eller pull-down experiment exakt kan kontrolleras.
2. Post-nukleära lysat Upprättande och Ip
Lys metod och optimala förhållanden lys beror på celltyp och protein-protein interaktioner som undersöks. Ett antal protokoll finns och kan modifieras för din ansökan.
- Lyse 20 x 10 6 "små" celler, såsom lymfocyter, eller 5 x 10 6 "stora" celler, såsom makrofager eller tumörceller, i 100 mikroliter färska lyseringsbuffert i en 1,5-mL mikrocentrifugrör för 20min på is. Skala lys volym som behövs.
- För att ta bort kärnor och olösliga cellulära skräp, centrifugera lysat på 20.000 g under 10 minuter vid 4 ° C. Förvara supernatanten och kassera pellets.
- Tillsätt 0,5 x 10 5 till 2.5 x 10 5 mAb-kopplade pärlor till förtydligas lysat, pipettera försiktigt för att blanda. Den minsta volym vi använder för attutföra en enda IP är 5 mikroliter.
- Placera på en vertikal roterande hjul 4 timmar eller över natten i ett kallt rum. Ställ till tillräcklig hastighet för att hindra kulorna från att landa. Det är acceptabelt för vätskan med låg volym IP kvar i botten av röret under rotation.
3. Sondering av Bead fångade-Protein med fluorokrom-konjugerade antikroppar
- Tvätta IP pärlor två gånger i 0,2 till 1,0 ml iskall FCM buffert, centrifugera på 20.000 g vid 4 ° C i 3 min efter varje tvätt.
- Resuspendera pärlor i 100 mikroliter FCM Buffer och delmängd 20 mikroliter i varje av fem eller fler 1,5-mL mikrocentrifugrör eller brunnar i en skorsten-bottenplatta.
- Lägg fluorokromkonjugerade MAbs med proverna. Utför FCM fläcken enligt leverantörens anvisningar eller enligt empiriskt fastställda koncentrationer. Som utgångspunkt, lägga 0,2 till 1 mikroliter i lager antikroppar lösning (0,2-1,0 mg / ml) per rör eller väl, och inkubera i 40 minuter på is.
- Tvätta sonderade pärlor i 1,5 ml-rör två gånger i 1,0 ml iskallt FCM buffert, centrifugera på 20.000 g vid 4 ° C i 3 min efter varje tvätt. Ta försiktigt bort supernatanten efter varje tvätt, se till att inte störa pärlor. För en skorsten-bottenplatta, tvätta två gånger med 0,2 ml iskall FCM buffert, centrifugering vid 1000g i 5 min vid 4 ° C efter varje tvätt. En multikanalspipett är användbart för detta steg. För att ta bort supernatanten från pärlor i en skorsten-bottenplatta, "knäpp" plattan en gång, sedan, samtidigt som upp och ner, blot några droppar från kanterna av brunnarna. Den kvarvarande volymen i varje brunn, som innehåller pärlor, kommer att handla om 20 mikroliter.
- Resuspendera pärlor i 200 mikroliter FCM buffert per prov. Transfer till märkt FACS rör. Prover är nu redo för FCM.
4. FCM Förvärv
Den KML pärlor som beskrivs i detta protokoll är 3 till 5 ìm i diameter, ungefär halva diametern på en rofylld mus lymfocyter. Därför kan det vara nödvändigt att manuellt öka Forward Scatter (FSC) förstärkare vinna och sidospridning (SSC) spänning för att befolkningen i pärla evenemang för att registrera dig på skalan. Individuella IP pärlor bör utgöra ett enda tätt grupperat befolkningen. Inställningarna och grinden borde justerats för att utesluta pärla dubletter och skräp.
- Innan du kör pärlor eller pärla standarder, ta bort hylsan droppen inneslutning som omger intagssonden på vissa cytometrar. Låt skidan vätskan rinna mellan prover, eftersom detta kommer att rensa inlopp och förhindra pärlor från att överföras från ett prov till ett annat.
- Använd omärkt pärlor, en negativ kontroll av fluorescens, och Rainbow Partiklar Calibration (RCPs), en positiv kontroll av fluorescens, justera inställningar så att både negativa och positiva fluorescens ytterligheter visas samtidigt på log-skala x-axeln. Detta säkerställer att fluorescensen från den experimentella prov även kommer att vara på skala. Observera att RCPs är mindre än KML pärlor, så FSC och SSC parametrar samt grind position kan behöva tillfälligt ändras för det provet.
- Återgå till utan etikett-pärla inställningar gång kalibrering med RCPs är klar. Om bara ett fluorescerande probe per prov används är ingen fluorescens kompensation behövs. I allmänhet sond vi Multiproteinkomplex med en enda fluorokromkonjugerade mAb per FCM prov, och vi undersöker flera interaktion partner genom färgning parallellt pärla prover med MAbs specifika för de olika subenheter.
- Förvärva och spara fluorescens datafiler. Analys kan sedan utföras med hjälp av programvara flödescytometri som CellQuest, FlowJo eller CFlow.
5. Representativa resultat
Figur 1. IP-FCM för TCR/CD3 Multiproteinkomplex komplex. T-celler från mus stam BALB / c var lyseras i 1% digitonin och lysat utsattes för IP-FCM med anti-CD3ε pärlor. De tagna komplex innehöll betydande mängder TCR-β (lila regionen) och co-associerade CD3-ε (grön), men nära bakgrundsnivåerna (definieras av irrelevanta immunglobulin sonden, rosa trace) av andra proteiner såsom Thy1.2, CD45, eller H-2K (d) (brunt, orange och blått spår, respektive). Se liknande tidigare publicerade resultat 1-6.
Discussion
Information om protein-protein interaktioner är ytterst relevant för analysen av många cellulära processer såsom signaltransduktion, härstamning mognad, cell-cykel progression och kaskader apoptos. IP-FCM ger en snabb, kvantitativ, och känsliga sätt att undersöka samspelet mellan proteiner och definiera medlemmar Multiproteinkomplex i sitt hemland konformation. Pärlor kan kopplas och inkuberas med celler lysates under en dag och kan sonderade och analyseras nästa dag. En 96-brunnar formatet tillåter ett stort antal prover som skall analyseras vid ett tillfälle att ge en effektiv insamling av uppgifter för statistiska eller screening. Med fluorescerande pärla normer, kan antalet proteiner fångas av varje pärla uppskattas. Mycket lite källmaterial som behövs för att fånga och upptäckt, så begränsade prover och knappa analyter kan fortfarande analyseras för flera interaktioner. Även om IP-FCM inte kräver genteknik, epitop-taggning, denaturering eller in vitro blandning av proteiner i en icke-fysiologisk miljö kan den kopplas till dessa och andra tekniker, vilket gör det ett värdefullt och lättillgängligt verktyg med tillämpning på många biologiska system.
Felsökning:
Många IP-FCM experiment generera användbara proteininteraktioner uppgifter första gången de försökte. Däremot kan optimering av IP-FCM förbättra antikropp konjugering till pärlor, proteinkomplex fånga, och fluorescerande probe bindande.
Effektiviteten i IP-antikroppar konjugering kan avgöras genom sondering tillsammans pärlor direkt med en anti-immunglobulin antikropp. Om detta effektiviteten är låg, kan öka koncentrationen av antikroppar under den kopplingen reaktionen möjliggör fler IP-antikroppar att fästa till varje pärla. Detta kan öka bindande egenskaper IP pärla parti, vilket resulterar i bättre fånga upp och upptäcka analyter. Andra primär-amin innehållande molekyler (t.ex. Tris, bovint serumalbumin) bör inte vara närvarande under kopplingen reaktion, eftersom dessa kan konkurrera med mAb för bead infästning och resulterar i låga mAb koppling. Om konjugering av mAb till pärlor visar problematisk av andra skäl, kan pärlor istället kopplas till avidin / streptavidin och biotinylerad antikroppar kan därefter vara icke-kovalent bundna och används för immunprecipitation.
Trots goda antikropp konjugation, kan den första upptäckten av pärlor-associerad fluorescens vara låg. Först komplex fånga sig själv kan vara låg. Eftersom IP-FCM beror på koncentrationen av analyt, vilket ökar antalet celler lyseras per lys volymen kan öka analyt fånga och upptäckt. Dessutom kan fånga ökas genom att minska antalet IP-pärlor inkuberas med lysat, som distribuerar fångade komplex över färre pärlor, och resulterar i ökad genomsnittlig fluorescens per pärla när sonderade. För det andra är det möjligt att komma åt av sonden antikropp mot fångade komplex steriskt hindras av immunoprecipitating antikropp. I detta fall kan problemet lösas genom att använda olika antikroppar för att fånga och / eller sond.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Eagles Innovation Award (Fraternal Order of Eagles) och av Mayo Foundation.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics | 2-5000 | Store at 4°C. |
| Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
| 2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma-Aldrich | M-5287 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Sigma-Aldrich | 22980 E-6383 | Store at -20°C under desiccating conditions. |
| Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
| PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher Scientific | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |
References
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).
- Schrum, A. G. Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).
- Teixeiro, E. T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains. Immunity. 21, 515-526 (2004).
- Teixeiro, E. Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development. Science. 323, 502-505 (2009).
- Treves, S. Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion. J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).
- Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes. J Exp Med. 201, 517-522 (2005).
